1、11、氨基酸、氨基酸2、肽、肽键与肽链、肽、肽键与肽链3、蛋白质的分离与鉴定、蛋白质的分离与鉴定4、蛋白质一级结构测定、蛋白质一级结构测定2除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。各种氨基酸的区别在于侧链通式。各种氨基酸的区别在于侧链R R基的不基的不同。从蛋白质中分离出来的所有氨基酸（除同。从蛋白质中分离出来的所有氨基酸（除甘氨酸外）都是甘氨酸外）都是L-L-型的。型的。COOHCHH2NR -氨基酸氨基酸可变部可变部分分不变部不变部分分32020种基本氨基酸按侧链极性可分为种基本氨基酸按侧链极性可分为3 3类：类：非极性氨基酸、极性但不带电荷的氨基
2、非极性氨基酸、极性但不带电荷的氨基酸、带电荷的氨基酸。酸、带电荷的氨基酸。按组成也可分为按组成也可分为3 3类：脂肪族氨基酸类：脂肪族氨基酸（1515）、芳香族氨基酸（）、芳香族氨基酸（3 3）、杂环族氨）、杂环族氨基酸（基酸（2 2）。）。4非极性氨基酸非极性氨基酸:Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met R基具极性不带电荷的氨基酸基具极性不带电荷的氨基酸:Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln R基带正电荷的氨基酸基带正电荷的氨基酸:Lys, Arg, His R基带负电荷的氨基酸基带负电荷的氨基酸:Asp, Glu 5 甘
3、氨酸甘氨酸 Gly GH2NCH CHOHO6 H2NCH CCH3OHO丙氨酸丙氨酸 Ala A7 缬氨酸缬氨酸 Val VH2NCH CCHOHOCH3CH38 亮氨酸亮氨酸 Leu LH2NCH CCH2OHOCH CH3CH39 异亮氨酸异亮氨酸 Ile IH2NCH CCHOHOCH3CH2CH310 甲硫氨酸甲硫氨酸 Met MH2NCHCCH2OHOCH2SCH311 半胱氨酸半胱氨酸 Cys CH2NCH CCH2OHOSH12精氨酸精氨酸 Arg RH2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NH13 赖氨酸赖氨酸 Lys KH2NCH CCH2OHOCH2CH2CH2N
4、H214 天冬氨酸天冬氨酸 Asp DH2NCH CCH2OHOCOHO15 谷氨酸谷氨酸 Glu EH2NCH CCH2OHOCH2COHO16 丝氨酸丝氨酸 Ser SH2NCH CCH2OHOOH17 苏氨酸苏氨酸 Thr TH2NCH CCHOHOOHCH318 天冬酰胺天冬酰胺 Asn NH2NCH CCH2OHOCNH2O19 谷氨酰胺谷氨酰胺 Gln QH2NCHCCH2OHOCH2CNH2O20 脯氨酸脯氨酸 Pro PHNCOHO21 组氨酸组氨酸 His HH2NCH CCH2OHONNH22 苯丙氨酸苯丙氨酸 Phe FH2NCHCCH2OHO23 酪氨酸酪氨酸 Tyr
5、YH2NCHCCH2OHOOH24 色氨酸色氨酸 Trp WH2NCHCCH2OHOHN25两性电离性质：两性电离性质：根据根据L-L-氨基酸可电离基团氨基酸可电离基团的的pKpK值，氨基酸在生理值，氨基酸在生理pHpH下并不是以游离下并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化形离子。在两性离子中，氨基是以质子化形式存在，羧基是以离解状态存在。式存在，羧基是以离解状态存在。26氨基酸的两性电离性质氨基酸的两性电离性质 在不同的在不同的pHpH条件下，氨基酸的电离状条件下，氨基酸的电离状态态 会随之发生变化。会随之发生变
6、化。COO-CHH3N+R-pK1+H+H+COOHCHH3N+RH+H+pK2-COO-CHH2NRpH 强酸性强酸性 中性中性 强碱性强碱性净电荷净电荷 +1 0 -1 正离子正离子 两性离子两性离子 负离子负离子 等电点等电点PI27氨基酸的等电点氨基酸的等电点：当溶液浓度为某一当溶液浓度为某一pHpH值时，氨基酸分子中所含的值时，氨基酸分子中所含的-NH-NH3 3+ +和和- -COOCOO- -数目正好相等，净电荷为数目正好相等，净电荷为0 0。这一。这一pHpH值即为氨基酸的等电点，简称值即为氨基酸的等电点，简称p pI I。在等电点时，氨基酸既不向正极也不在等电点时，氨基酸既不
7、向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。状态。28侧链不含离解基团的中性氨基酸，其侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的等电点是它的p pK K1 1和和p pK K2 2的算术平均值。的算术平均值。侧链含有可解离基团的氨基酸，其侧链含有可解离基团的氨基酸，其p pI I值也决定于两性离子两边的值也决定于两性离子两边的p pK K值的算值的算术平均值。术平均值。无论氨基酸侧链是否解离，其无论氨基酸侧链是否解离，其p pI I 值均值均决定于净电荷为零的两性离子两边的决定于净电荷为零的两性离子两边的p pK K值的算术平均值。值的算术平均值。29基于
8、氨基酸的酸碱性质和极性大小进基于氨基酸的酸碱性质和极性大小进行分析分离。常用的分析分离方法有：行分析分离。常用的分析分离方法有： 滤纸层析、薄层层析滤纸层析、薄层层析分配柱层析分配柱层析离子交换层析：阴离子交换层析：阴/ /阳离子交换树脂阳离子交换树脂高效液相层析高效液相层析电泳分离电泳分离30电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。氨基酸是两性电解质，在一定氨基酸是两性电解质，在一定pHpH缓冲液缓冲液的电场中，氨基酸混合物中各组分根据的电场中，氨基酸混合物中各组分根据它们所带净电荷的种类和数量不同，以它们所带净电荷的种类和数量不同，以不同速度向不同方向泳动，
9、从而得以分不同速度向不同方向泳动，从而得以分离。离。31带电颗粒在电场中的泳动速度（电泳迁带电颗粒在电场中的泳动速度（电泳迁移率）与分子的净电荷、半径、介质粘移率）与分子的净电荷、半径、介质粘度及电压有关。度及电压有关。净电荷可用净电荷可用pI-pH pI-pH 来近似计算。来近似计算。可作电泳固相支持物的有滤纸、淀粉、可作电泳固相支持物的有滤纸、淀粉、醋酸纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶醋酸纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。等。32离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的不溶性高分子化合物。合成的不溶性高分子化合物。阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出
10、阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出NaNa+ + 或或H H+ +，当溶液中含有其它阳离子时，它，当溶液中含有其它阳离子时，它们可以和们可以和NaNa+ +或或H H+ +发生交换而结合在树脂上；发生交换而结合在树脂上；同样，阴离子交换树脂含有的碱性基团可解同样，阴离子交换树脂含有的碱性基团可解离出离出OHOH- -，溶液中的阴离子和，溶液中的阴离子和OHOH- -发生交换而发生交换而结合在树脂上。结合在树脂上。33分离氨基酸混合物常使用阳离子交换树分离氨基酸混合物常使用阳离子交换树脂。脂。交换柱中的树脂先用碱处理成钠型，将交换柱中的树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液上柱，由于各种氨基酸与
11、氨基酸混合液上柱，由于各种氨基酸与树脂的亲和力不同，用洗脱液可将各种树脂的亲和力不同，用洗脱液可将各种氨基酸以不同的速度洗脱下来。氨基酸以不同的速度洗脱下来。在在pH3pH3左右左右, pI10, pI6, pI10, pI6，pI3pI3的氨基酸的氨基酸混合物的分离情况？混合物的分离情况？34氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。水相互作用。在在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树左右，氨基酸与阳离子交换树脂间的亲和力次序是碱性氨基
12、酸脂间的亲和力次序是碱性氨基酸中性中性氨基酸氨基酸酸性氨基酸。则洗脱顺序是？酸性氨基酸。则洗脱顺序是？35氨基酸与氨基酸之间通过氨基酸与氨基酸之间通过-氨基和氨基和-羧基之间失水形成的酰胺键共价羧基之间失水形成的酰胺键共价的结合在一起，这样形成的化合物称的结合在一起，这样形成的化合物称为肽。为肽。在蛋白质化学中，这种酰胺键称为肽在蛋白质化学中，这种酰胺键称为肽键。键。36H2NCHCOOHR1+ H2NCHCOOHR2NCHCOOHR2HH2NCHCR1O肽键二肽由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽，这样就个氨基酸组成的肽则称为多肽，这
13、样就形成了一条线性的链状分子形成了一条线性的链状分子肽链。组肽链。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。37CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。这种排列顺序称为氨基酸顺序。通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的 - -氨基，氨基，称为氨基端或称为氨基端或N-N-端；在另一端含有一个游
14、离端；在另一端含有一个游离的的 - -羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，端的氨基酸残基开始，以以C-C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln生物活性肽。如谷胱甘肽生物活性肽。如谷胱甘肽,其重要生理功其重要生理功能有清除有害的氧化剂、作为植物体内能有清除有害的氧化剂、作为植物体内的电子传递体等。此外，许多重要的激的电子传递体等。此外，许多重要的激素如舒缓激肽、脑啡肽，某些抗菌素如素
15、如舒缓激肽、脑啡肽，某些抗菌素如短杆菌肽短杆菌肽S也是重要的生物活性肽。也是重要的生物活性肽。3839研究蛋白质的结构、性质和功能，首先研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。需要得到纯的蛋白质样品。(1)(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；和植物细胞；(2)(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。量。(3)(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。下进行。40前处理：前处理：(1)(1)破碎生物组织。常用的方法有破碎生物组织。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融
16、法和酶解法等。研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。表面活性剂抽提等。粗分级分离粗分级分离: :离心除去固体杂质后，可通过离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。质粗制品。细分级分离：细分级分离：可用层析法、电泳法等对蛋白可用层析法、电泳法等对蛋白质进行精制。质进行精制。目标蛋白
17、的鉴定。目标蛋白的鉴定。41盐溶：低盐浓度范围内，随着盐浓度增盐溶：低盐浓度范围内，随着盐浓度增加，蛋白质分子表面的带电基团吸附盐加，蛋白质分子表面的带电基团吸附盐离子，水合能力增强，蛋白质溶解度增离子，水合能力增强，蛋白质溶解度增大。大。盐析：当盐浓度达到饱和或半饱和程度，盐析：当盐浓度达到饱和或半饱和程度，中性盐大量结合溶液中的自由水分子，中性盐大量结合溶液中的自由水分子，降低水的活度，同时与蛋白质竞争水分降低水的活度，同时与蛋白质竞争水分子，破坏蛋白质表面的水化层，使蛋白子，破坏蛋白质表面的水化层，使蛋白质的溶解度降低，容易发生沉淀。质的溶解度降低，容易发生沉淀。42盐析时，先将蛋白质混
18、合液调至目标蛋盐析时，先将蛋白质混合液调至目标蛋白质的等电点附近，此时溶解度最小，白质的等电点附近，此时溶解度最小，可以达到最佳盐析效果。可以达到最佳盐析效果。常用的中性盐为硫酸铵。不同的蛋白质常用的中性盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。将不同的蛋白质加以分离。43此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。方法。阳离子交换树脂适合分离阳离子
19、交换树脂适合分离pIpI大于大于7 7的蛋白质，的蛋白质，阴离子交换树脂最适合分离阴离子交换树脂最适合分离pIpI小于小于7 7的蛋白的蛋白质。质。若用阴离子交换树脂分离蛋白质，则带负若用阴离子交换树脂分离蛋白质，则带负电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带负电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带负电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阴离子洗脱液（如同浓度的阴离子洗脱液（如NaClNaCl溶液进行溶液进行梯度洗脱，通过梯度洗脱，通过ClCl- -的离子交换作用）可以的离子交换作用）可以将带有不同负电荷的蛋白质进行分离。将带有不同负电荷的蛋白质进行分离。444
20、5此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。内部是多孔的网状结构。4647这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。其原理是其原理是不同的蛋白质分子不同的蛋白质分子对于固定对于固定在载体上的在载体上的特殊配体特殊配体具有具有不同的识别不同的识别和结合能力和结合能力。常用的配体有抗体、抗原、激素或受常用的配体有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为
21、琼脂糖凝胶等。柱载体为琼脂糖凝胶等。48 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配体，然后应用化学方法结合作用的配体，然后应用化学方法将该配体与载体共价连接。将这种连将该配体与载体共价连接。将这种连接有配体的载体装入层析柱中，当含接有配体的载体装入层析柱中，当含有待纯化蛋白质的溶液通过层析柱时，有待纯化蛋白质的溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配体发生特异性结合而该蛋白质即与配体发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液的蛋白质，
22、可以用适当的配体洗脱液洗脱。洗脱。4950在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的蛋白质溶液的pHpH值不等于等电点时，蛋白值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。在电场中移动的速度也不相同。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（电场中移动的速度（v v）取决于电场强度）取
23、决于电场强度(E)(E)，所带的净电荷，所带的净电荷(q)(q)以及与介质的摩擦以及与介质的摩擦系数系数(f)(f)。51SDSSDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约基按大约1 1 2 2比例结合。比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDSSDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而
24、且电荷密度也大体相同，带有大量的负电荷，而且电荷密度也大体相同，因此，迁移速度因此，迁移速度只与相对分子量有关，与电荷只与相对分子量有关，与电荷和分子形状无关和分子形状无关。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。出不同蛋白质的分子量。5253将两性电解质将两性电解质(pH3-9,(pH3-9,或其它范围的如或其它范围的如pH5-7)pH5-7)与丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合与丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合后预电泳，建立均匀连续的后预电泳，建立均匀连续的pHpH梯度。梯度。蛋蛋白质样品后加样再电泳时会根据它自身白质样品后加样再电泳时会根据它自
25、身的等电点分别向两极移动，最后在凝胶的等电点分别向两极移动，最后在凝胶中相应于其等电点处聚焦。中相应于其等电点处聚焦。545556蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。它是蛋白质生物功能的基础。57(1)(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2)(2)多肽链的拆分。多肽链的拆分。当蛋白质分子中存在链间或链内的
26、二硫键时，当蛋白质分子中存在链间或链内的二硫键时，必需拆分二硫键，以获得伸展的肽链。必需拆分二硫键，以获得伸展的肽链。58(3)(3)多肽链完全水解进行氨基酸组成分多肽链完全水解进行氨基酸组成分析，析，分析每条多肽链的氨基酸组成和分析每条多肽链的氨基酸组成和各种氨基酸的摩尔数。各种氨基酸的摩尔数。( (4 4) )多肽链断裂成多个肽段。采用两种多肽链断裂成多个肽段。采用两种或多种专一性水解方法将多肽样品断或多种专一性水解方法将多肽样品断裂成两套或多套肽碎片，并将其分离裂成两套或多套肽碎片，并将其分离开来，以获得单一的碎片。开来，以获得单一的碎片。( (5 5) )测定每个肽碎片的氨基酸序列。测
27、定每个肽碎片的氨基酸序列。59( (6 6) )确定肽碎片在多肽链中的次序。确定肽碎片在多肽链中的次序。利用两套或多套肽碎片的氨基酸顺序利用两套或多套肽碎片的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，推导出整条肽链彼此间的交错重叠，推导出整条肽链完整的氨基酸顺序。完整的氨基酸顺序。( (7 7) )确定二硫键和酰胺基的位置。确定二硫键和酰胺基的位置。60N-末端分析末端分析 :利用多肽链利用多肽链N-末端残基的游离末端残基的游离 氨基能与某些化学试剂产生特有的化学氨基能与某些化学试剂产生特有的化学反应来进行分析。反应来进行分析。二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB、FDNB，Sanger试试剂）、丹磺酰氯法
28、（剂）、丹磺酰氯法（DNS）C-末端分析末端分析 61SangerSanger法：在碱性条件下，法：在碱性条件下， 2,4-2,4-二硝基氟二硝基氟苯能够与肽链苯能够与肽链N-N-端的游离端的游离-氨基作用，生氨基作用，生成二硝基苯衍生物（成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）法：）法：在碱性条件下，丹在碱性条件下，丹磺酰氯可以与磺酰氯可以与N-N-
29、端氨基酸的游离端氨基酸的游离-氨基作氨基作用，得到丹磺酰用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到性质，检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。62过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。1.1.几条多肽链借助非共价键连接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍处理，即盐酸胍处理，即可分开多肽链可分开多肽链( (亚基亚基).).2.2.几条多肽链通过二硫键交联在一起。可几条多肽链通过
30、二硫键交联在一起。可在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用用过量的过量的 - -巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。以防止它重新被氧化。63常用常用6 mol/L6 mol/L的盐酸在的盐酸在105-110105-110条件下封条件下封闭水解闭水解2424、4848和和7272小时。小时。优点：不容易引起水解产物的消旋化。优点：不容易引起水解产物的消旋化。缺点：缺点：色氨酸色氨酸被完全破坏；被完全破坏；含有羟基的丝含有羟基
31、的丝氨酸或苏氨酸等有一小部分被分解；氨酸或苏氨酸等有一小部分被分解；天门天门冬酰胺冬酰胺和和谷氨酰胺谷氨酰胺的酰胺基被水解。的酰胺基被水解。色氨酸色氨酸在碱水解中不受破坏在碱水解中不受破坏64胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：R1=R1=苯丙苯丙氨酸氨酸PhePhe、色氨酸、色氨酸TrpTrp、酪氨酸、酪氨酸Tyr, Tyr, R2R2脯氨酸脯氨酸Pro Pro （速度快）（速度快）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点肽链的部分水解肽链的部分水解 65胰蛋白酶：胰蛋白酶：R1=R1=赖氨酸赖氨酸Lys Lys 和精氨酸和精氨酸A
32、rg Arg 侧链，侧链，R2R2脯氨酸脯氨酸ProPro（专一性（专一性高）。高）。CNBr 裂解：裂解：Met羧基形成的肽键羧基形成的肽键NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点66EdmanEdman化学降解法：逐个降解化学降解法：逐个降解 酶降解法：氨肽酶、羧肽酶酶降解法：氨肽酶、羧肽酶 质谱法质谱法 根据核苷酸序列推定法根据核苷酸序列推定法 67Edman Edman （苯异硫氰酸酯）法：在温和苯异硫氰酸酯）法：在温和的碱性条件下，苯异硫氰酸酯与的碱性条件下，苯异硫氰酸酯与肽链肽链N-N-端的游离端的游离-氨基作用，生成氨基作用，生成P
33、TC-PTC-多肽。多肽。此法的特点是能够不断重复循环，将此法的特点是能够不断重复循环，将肽链肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和端氨基酸残基逐一进行标记和解离。也可用于肽链解离。也可用于肽链N-N-末端分析。末端分析。 68例题例题某肽经分析其某肽经分析其N-N-末端和末端和C-C-末端分别是末端分别是AlaAla和和LysLys，用胰蛋白酶水解产生四个小，用胰蛋白酶水解产生四个小肽，经肽，经EdmanEdman法测定，顺序分别为法测定，顺序分别为Asp-Asp-Phe-Leu-Lys,Met-Phe-Ala-Lys,Ala-Phe-Leu-Lys,Met-Phe-Ala-Lys,Ala-Arg,Arg; Arg,Arg; 用胰凝乳蛋白酶水解产生三用胰凝乳蛋白酶水解产生三个小肽，经个小肽，经EdmanEdman法测定顺序分别为法测定顺序分别为Ala-Lys-Asp-Phe,Ala-Arg-Arg-Met-Ala-Lys-Asp-Phe,Ala-Arg-Arg-Met-Phe,Leu-LysPhe,Leu-Lys。试推断该多肽的一级结。试推断该多肽的一级结构。构。
