生物化学蛋白质的生物合成及基因工程课件.pptx

1、四川省精品课程 生物化学第十三章第十三章 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成及基因工程及基因工程 一、概述一、概述二、蛋白质合成体系二、蛋白质合成体系三、蛋白质的合成机制三、蛋白质的合成机制四、基因突变和四、基因突变和DNADNA损伤的修复损伤的修复五、基因工程五、基因工程 四川省精品课程 生物化学现代生物学已充分证明，核酸是生物现代生物学已充分证明，核酸是生物遗传的遗传的物质基础物质基础。生物的遗传信息以。生物的遗传信息以密码的形式贮存在密码的形式贮存在DNADNA分子上，表现分子上，表现为为特定的核苷酸排列顺序特定的核苷酸排列顺序。 第一节第一节 概述概述四川省精品课程 生物化学蛋白质蛋白质

2、蛋白质蛋白质复制复制DNARNA转录转录翻译翻译复制复制RNA翻译翻译逆转录逆转录DNARNA 遗传信息的中心法则遗传信息的中心法则四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学第二节第二节 蛋白质合成体系蛋白质合成体系RNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质RNADNA复制复制复制复制反转录反转录转录转录翻译翻译翻译翻译四川省精品课程 生物化学2020种氨基酸种氨基酸, ,mRNAmRNA、tRNAtRNA、核糖体、核糖体、酶和因子酶和因子, ,无机离子、无机离子、ATP ATP 、GTP GTP 一、合成体系：一、合成体系：四川省精品课程 生物化学二、二、参与蛋白质合成的三类参与蛋白质合成的三类R

3、NARNA及核糖体及核糖体与蛋白质一起构成核糖体与蛋白质一起构成核糖体蛋白质合成蛋白质合成“工厂工厂” 1.rRNA1.rRNA核糖体的基本功能：核糖体的基本功能：结合结合mRNAmRNA，在，在mRNAmRNA上选择适当的区域开始翻译上选择适当的区域开始翻译密码子（密码子（mRNAmRNA）和反密码子（）和反密码子（tRNAtRNA）的正确配对）的正确配对肽键的形成肽键的形成四川省精品课程 生物化学原核生原核生物核糖物核糖体组成体组成真核生真核生物核糖物核糖体组成体组成四川省精品课程 生物化学 特定的特定的tRNAtRNA搬运特定的氨搬运特定的氨基酸，保证了遗传信息传基酸，保证了遗传信息传递

4、的准确递的准确 结合氨基酸：一种氨基酸结合氨基酸：一种氨基酸有几种有几种tRNAtRNA携带，结合需携带，结合需要要ATPATP供能供能, ,氨基酸结合在氨基酸结合在tRNA3tRNA3-CCA-CCA的位置。的位置。 2.tRNA2.tRNA四川省精品课程 生物化学 tRNA+AMPR O氨基酰氨基酰tRNA 合成酶合成酶tRNA氨基酰氨基酰tRNA合成酶合成酶ATPPPiAMP-E消耗消耗2个高能磷酸键个高能磷酸键tRNA四川省精品课程 生物化学氨基酸活化的总反应式氨基酸活化的总反应式氨基酰氨基酰tRNA合成酶合成酶高度特异性高度特异性氨基酸氨基酸tRNA氨基酸氨基酸 + ATP + tR

5、NA + H+ ATP + tRNA + H2 2O O氨基酰氨基酰-tRNA 合成酶合成酶氨基酰氨基酰-tRNA + AMP + PPi-tRNA + AMP + PPi四川省精品课程 生物化学v 在大肠杆菌中在大肠杆菌中,与与Met特异结合的特异结合的tRNA有两种：有两种：tRNAfMet （起始）（起始）和和 tRNAMetCH3SCH2CH2CHH2NCOO tRNAMet转甲酰基酶转甲酰基酶N10-CHO-FH4CH3SCH2CH2CHH-C-HNCOO tRNAfMetOv 真核细胞中起始真核细胞中起始tRNA,不被甲酰化不被甲酰化四川省精品课程 生物化学 3. mRNA3. m

6、RNADNAmRNA蛋白质蛋白质四川省精品课程 生物化学三三. .遗传密码遗传密码 为一个氨基酸编码进入蛋白质多肽链特为一个氨基酸编码进入蛋白质多肽链特定线性位置的三个核苷酸单位称为密码子定线性位置的三个核苷酸单位称为密码子（CodenCoden）或三联体密码。）或三联体密码。四川省精品课程 生物化学(一)三联体密码的确立三联体密码的确立19541954年年, ,物理学家伽物理学家伽莫夫首先对遗传密码莫夫首先对遗传密码进行探讨。进行探讨。(68(68年诺年诺贝尔生理学医学奖贝尔生理学医学奖 )四川省精品课程 生物化学 三个不同的实验证明了遗传密码是三个不同的实验证明了遗传密码是mRNAmRNA

7、上上3 3个连续的核苷酸残基构成的，下面给个连续的核苷酸残基构成的，下面给出了三个证明遗传密码是三联体密码的出了三个证明遗传密码是三联体密码的著名实验的示意图。著名实验的示意图。( (二二) )密码子的破译密码子的破译四川省精品课程 生物化学证明三联体密码的三个著名实验的示意图证明三联体密码的三个著名实验的示意图1961年，年，尼仑博格尼仑博格1964年，年，尼仑博格尼仑博格柯腊拉柯腊拉四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学( (三三) ) 遗传密码的特点：遗传密码的特点： 从简单生物到人类使用同一套密码子。从简单生物到人类使用同一套密码子。由此可推测所有生物来源于一个共同的祖先。由

8、此可推测所有生物来源于一个共同的祖先。密码子是不重叠的，每个三联体中的三个核密码子是不重叠的，每个三联体中的三个核苷酸只编码一个氨基酸苷酸只编码一个氨基酸. .1 1、不重叠、不重叠2 2、通用性、通用性 四川省精品课程 生物化学 除除MetMet，TrpTrp外，其余氨基酸由外，其余氨基酸由2 2个以上密码个以上密码子编码。（同义密码子）子编码。（同义密码子）生物学意义：保证属的稳定性。生物学意义：保证属的稳定性。 密码子的第一、第二两个碱基的配对是标准密码子的第一、第二两个碱基的配对是标准配对，而第三个碱基为非标准配对。配对，而第三个碱基为非标准配对。生物学意义：减少突变频率生物学意义：减

9、少突变频率3 3、 简并性简并性 4 4、 摆动性摆动性四川省精品课程 生物化学 密码子的排列是连续的，不间隔，也不重叠。密码子的排列是连续的，不间隔，也不重叠。5 5、 连续性连续性v 不重叠不重叠v 通用性通用性v 简并性简并性v 摆动性摆动性v 连续性连续性四川省精品课程 生物化学第三节第三节 蛋白质的合成机制蛋白质的合成机制 以以mRNAmRNA为模板，氨基酸经活化获得的氨酰为模板，氨基酸经活化获得的氨酰tRNAtRNA为原料，为原料，GTPGTP、ATPATP供能，在核糖体中供能，在核糖体中完成。完成。四川省精品课程 生物化学( (一）、蛋白质合成的起始一）、蛋白质合成的起始起始起始

10、肽链延长肽链延长终止终止起始氨基酰起始氨基酰-tRNA -tRNA 与与 mRNA mRNA 结合到核糖体上，结合到核糖体上，形成起始复合物的过程形成起始复合物的过程. .原料原料：fMet-tRNA，IF(1，2，3)，GTP，Mg2+四川省精品课程 生物化学1. 1. 小亚基识别并结合小亚基识别并结合mRNA mRNA 30S50S50S+mRNA解聚解聚30S小亚基小亚基识别并结合识别并结合mRNAmRNA起始密码子上游起始密码子上游10nt10nt富含嘌呤富含嘌呤碱基的碱基的SDSD序列序列，IF3IF3加固这一作用。加固这一作用。 IF-1IF-3小亚基的小亚基的16S rRNA 3

11、端的端的UCCU序列序列四川省精品课程 生物化学2. 2. 大小亚基聚合大小亚基聚合IF-3GDP+Pi50S起始复合物起始复合物fMetAUGfMetAUGIF-1IF-2四川省精品课程 生物化学3.3.真核生物与原核生物的起始过程的不同点真核生物与原核生物的起始过程的不同点(1) (1) 起始起始Met-tRNAMet-tRNAMetMet不需甲酰化；不需甲酰化；(2) (2) 起始因子不少于起始因子不少于1010种；种；(3) (3) 小亚基先与小亚基先与Met-tRNAMet-tRNAMetMet结合，再与结合，再与 mRNAmRNA结合；结合；(4) ATP(4) ATP供能。供能。

12、四川省精品课程 生物化学( (二）二） 肽链延长：肽链延长：1.1.进位进位特异的氨基酰特异的氨基酰-tRNA进入进入A位位pAAUG四川省精品课程 生物化学2. 2. 转肽转肽Mg2+， K+转肽酶转肽酶CH2CH2-CHOC= OCH-RNH2O=OCH2NCH3SAUGUAC给给 受受OCO =R-CHNHOHCO=H3CSCH2CH2-CHNH2AUGUAC给给受受四川省精品课程 生物化学通过进位通过进位-转肽转肽-移位不断重复，移位不断重复， 肽链自肽链自NC端不断延长端不断延长OHGTPOHA3. 3. 移位移位四川省精品课程 生物化学( (三三) ) 终止阶段终止阶段RF-3RF

13、-3：促使：促使RF-1 RF-1 或或RF-2RF-2从核糖体上结合从核糖体上结合RF-1RF-1：UAAUAA，UAGUAGRF-2RF-2：UAAUAA，UGAUGA当当mRNAmRNA的任一终止信号进入的任一终止信号进入A A位时，没有任位时，没有任何何tRNAtRNA能与之识别，只有释放因子能与之识别，只有释放因子(RF)(RF)识别识别这种信号这种信号, , 进入终止阶段进入终止阶段. .四川省精品课程 生物化学二、多核糖体多核糖体53意义：提高翻译效率。意义：提高翻译效率。同时结合到同一条同时结合到同一条mRNAmRNA上多个成串的核糖体。上多个成串的核糖体。四川省精品课程 生物

14、化学三三、 翻译后加工翻译后加工（一）切割（一）切割（二）修饰（二）修饰（三）（三） 新生肽链的折叠新生肽链的折叠1. 1. 去除去除N N末端蛋氨酸残基末端蛋氨酸残基2. 2. 信号肽及其他肽段的切除信号肽及其他肽段的切除 1. 1. 二硫键的形成二硫键的形成 2. 2. 辅助因子的连接和亚基聚合辅助因子的连接和亚基聚合 3. 3. 多肽链中个别氨基酸的修饰多肽链中个别氨基酸的修饰四川省精品课程 生物化学（一）切割（一）切割 原核生物原核生物1. 1. 去除去除N N末端蛋氨酸残基末端蛋氨酸残基脱甲脱甲 酰基酶酰基酶Met-fMet-氨基肽酶氨基肽酶真核细胞真核细胞四川省精品课程 生物化学2

15、. 2. 信号肽及部分肽段的切除信号肽及部分肽段的切除分泌性蛋白前体的两个特点：分泌性蛋白前体的两个特点： 1. N 1. N端含有信号肽（端含有信号肽（signal peptidesignal peptide） 信号肽富含疏水氨基酸，其作用是使新信号肽富含疏水氨基酸，其作用是使新合成的多肽链易于穿过膜系统，随后被信号合成的多肽链易于穿过膜系统，随后被信号肽酶切除。肽酶切除。 2. 2. 往往还含有一段与活性无关的其他肽往往还含有一段与活性无关的其他肽段，必须将其切除才能形成有活性的蛋白质。段，必须将其切除才能形成有活性的蛋白质。四川省精品课程 生物化学（二）修饰（二）修饰 1. 1.二硫键的

16、形成二硫键的形成CysSHCysSHCysSCysS-2H二硫键二硫键 异构酶等异构酶等四川省精品课程 生物化学 2. 2. 辅助因子的连接和亚基聚合辅助因子的连接和亚基聚合 蛋白质与糖、脂类、核酸、血红素等辅助蛋白质与糖、脂类、核酸、血红素等辅助因子结合形成糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、血因子结合形成糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、血红蛋白等结合蛋白质。红蛋白等结合蛋白质。 具有四级结构的蛋白质需进行亚基之间的具有四级结构的蛋白质需进行亚基之间的聚合。如血红蛋白聚合。如血红蛋白4 4个亚基的聚合。个亚基的聚合。四川省精品课程 生物化学. 3. 3. 多肽链中个别氨基酸的修饰多肽链中个别氨基酸的修饰磷酸化：

17、磷酸化：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸羟基化：羟基化：脯氨酸，赖氨酸脯氨酸，赖氨酸酰基化：酰基化：组氨酸组氨酸甲基化：甲基化：色氨酸色氨酸核糖基化：核糖基化：精氨酸精氨酸四川省精品课程 生物化学第四节第四节 基因突变和基因突变和DNADNA损伤的修复损伤的修复 在基因内部某些位点的碱基发生改变或碱基排列在基因内部某些位点的碱基发生改变或碱基排列顺序发生变化顺序发生变化称基因突变。称基因突变。 理化因素：理化因素：紫外线、电离辐射及化学诱变剂等；紫外线、电离辐射及化学诱变剂等； 生物因素：生物因素：噬菌体或病毒感染、转位因子的作用，噬菌体或病毒感染、转位因子的作用，以及以及DNAD

18、NA复制错误等。复制错误等。 突变的类型可分为碱基置换、碱基插入或缺失等。突变的类型可分为碱基置换、碱基插入或缺失等。 一、基因突变一、基因突变四川省精品课程 生物化学仅涉及仅涉及DNADNA分子中单个碱基的改变称点突变分子中单个碱基的改变称点突变（point mutationpoint mutation）。涉及多个碱基的还有缺失、。涉及多个碱基的还有缺失、重复和插入。重复和插入。突变体突变体(mutant)(mutant)：具有突变表型的细胞或个体。：具有突变表型的细胞或个体。四川省精品课程 生物化学 从突变的表型从突变的表型: : 1 1）形态突变形态突变：突变影响生物的形态结构。：突变影

19、响生物的形态结构。 2 2）生化突变生化突变：突变影响生物的代谢过程，导致：突变影响生物的代谢过程，导致一个特定生化功能的改变或丧失。一个特定生化功能的改变或丧失。 3 3）致死突变致死突变：突变影响生物个体的生活力。分：突变影响生物个体的生活力。分为显性致死和隐性致死。为显性致死和隐性致死。 4 4）条件致死突变条件致死突变：在某一些条件下致死，而在：在某一些条件下致死，而在另一些条件下成活的突变。另一些条件下成活的突变。突变类型突变类型四川省精品课程 生物化学 从对遗传信息的改变从对遗传信息的改变: 1 1）同义突变同义突变: :碱基序列的改变没有引起产物氨基碱基序列的改变没有引起产物氨基

20、酸序列的改变酸序列的改变, ,与密码子的简并性有关。与密码子的简并性有关。2 2）无义突变无义突变: :某个碱基的改变使代表某种氨基酸某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变成了终止密码子，使蛋白质合成提前的密码子变成了终止密码子，使蛋白质合成提前终止，因而蛋白质产物一般是没有活性的。终止，因而蛋白质产物一般是没有活性的。四川省精品课程 生物化学3 3）错义突变错义突变: : 碱基序列的改变引起了产物氨基酸序碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。列的改变。 有些错义突变严重影响蛋白质活性甚至完全无有些错义突变严重影响蛋白质活性甚至完全无活性，从而影响了表现型。如果该基因是必须基因，活性，从

21、而影响了表现型。如果该基因是必须基因，则称为致死突变。则称为致死突变。 有些有些错义突变的产物仍有部分活性，使表型介错义突变的产物仍有部分活性，使表型介于野生型与突变型之间的中间类型，称为渗漏突变。于野生型与突变型之间的中间类型，称为渗漏突变。 有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质的有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质的活性，不表现明显的性状变化，称为中性突变。活性，不表现明显的性状变化，称为中性突变。四川省精品课程 生物化学 按其发生的原因按其发生的原因: :1)1)自发突变自发突变（spontaneous mutationspontaneous mutation）：在自）：在自然情况下

22、发生的突变。然情况下发生的突变。2)2)诱发突变诱发突变（induced mutationinduced mutation）：人们有意）：人们有意识地利用物理、化学诱变因素引起的突变识地利用物理、化学诱变因素引起的突变 。四川省精品课程 生物化学1.1.引起基因突变的物理因素引起基因突变的物理因素（1 1）紫外线：）紫外线：紫外线（尤其是波长为紫外线（尤其是波长为200200300nm300nm光光波）的照射可导致波）的照射可导致DNADNA分子中相邻两个胸嘧啶的第分子中相邻两个胸嘧啶的第5 5、6 6位碳碳双键打开，形成共价二聚体。位碳碳双键打开，形成共价二聚体。 四川省精品课程 生物化学（

23、2 2）电离辐射：）电离辐射：指受到指受到X X、或或射线的照射。射线的照射。 DNADNA吸收射线粒子后，分子发生电离，接着出现吸收射线粒子后，分子发生电离，接着出现结构上的变化。另一方面，结构上的变化。另一方面，DNADNA周围介质受到辐射周围介质受到辐射产生的自由基、过氧化物等，也可与产生的自由基、过氧化物等，也可与DNADNA碱基或其碱基或其他基团作用，导致结构改变，发生突变。他基团作用，导致结构改变，发生突变。 四川省精品课程 生物化学2.2.引起基因突变的化学因素引起基因突变的化学因素 引起基因突变的化学因素指那些能与引起基因突变的化学因素指那些能与DNADNA分分子发生化学反应并

24、诱发突变的物质，称之子发生化学反应并诱发突变的物质，称之为为诱变剂诱变剂。 主要包括亚硝酸、羟胺、碱基类似物、烷主要包括亚硝酸、羟胺、碱基类似物、烷化剂及某些染料等。它们引起基因突变的化剂及某些染料等。它们引起基因突变的机理各不相同。机理各不相同。 四川省精品课程 生物化学（1 1）亚硝酸亚硝酸作用于核酸的碱基可引起氧化脱氨，使作用于核酸的碱基可引起氧化脱氨，使碱基上原来是氨基的位置转变为酮基，即可使碱基上原来是氨基的位置转变为酮基，即可使A A转转变为变为I I，C C变为变为U U，G G变为变为X X。随着。随着DNADNA复制，原来的复制，原来的ATAT对可变成对可变成GCGC对；原来

25、的对；原来的GCGC对可变成对可变成ATAT对。对。 四川省精品课程 生物化学（2 2）碱基类似物碱基类似物主要有胸嘧啶的类似物主要有胸嘧啶的类似物5-5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶（5-BU5-BU）和腺嘌呤的类似物）和腺嘌呤的类似物2-2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP2-AP）。）。复制时复制时5-UB5-UB除与除与A A配对外还可与配对外还可与G G配对；配对；2-AP2-AP除与除与T T配对外还可与配对外还可与C C配对，因而经过几代配对，因而经过几代DNADNA复制，原来复制，原来的的ATAT对可变为对可变为GCGC对，或对，或GCGC对变为对变为ATAT对。对。 四川省精品课程 生物化学

26、（3 3）烷化剂烷化剂主要有硫酸二甲酯和硫酸二乙酯等。主要有硫酸二甲酯和硫酸二乙酯等。 烷化剂可使烷化剂可使 DNADNA的脱氧核糖及碱基烷基化，引起的脱氧核糖及碱基烷基化，引起突变。碱基一旦脱落，会造成复制时新进入的碱突变。碱基一旦脱落，会造成复制时新进入的碱基无配对依据，发生碱基错配，甚至额外插入或基无配对依据，发生碱基错配，甚至额外插入或丢失碱基，引起突变。丢失碱基，引起突变。 （4 4）某些）某些抗菌素、色素和染料抗菌素、色素和染料的作用。的作用。 一些带有稠环结构的抗菌素、色素和染料，如放线菌素一些带有稠环结构的抗菌素、色素和染料，如放线菌素D D、丫啶橙和溴乙锭等，其分子的杂环平面

27、可嵌入到丫啶橙和溴乙锭等，其分子的杂环平面可嵌入到DNADNA分子的分子的两个碱基对之间，使两个碱基对之间，使DNADNA分子扭曲变形，并可产生局部解链分子扭曲变形，并可产生局部解链区而使分子增长。嵌入的杂环可起到附加碱基的作用，复制区而使分子增长。嵌入的杂环可起到附加碱基的作用，复制时子链容易在此位点插入额外碱基，引起插入突变或称移码时子链容易在此位点插入额外碱基，引起插入突变或称移码突变。突变。 四川省精品课程 生物化学3.3.生物因素引起的基因突变生物因素引起的基因突变 能够引起基因突变的生物因素有噬菌体或能够引起基因突变的生物因素有噬菌体或病毒感染、转位因子的作用，以及病毒感染、转位因

28、子的作用，以及DNADNA复制复制错误等。错误等。四川省精品课程 生物化学 一方面一方面DNADNA受到自然因素或诱变因素作用，结受到自然因素或诱变因素作用，结构会出现不同程度的损伤或产生突变；构会出现不同程度的损伤或产生突变； 另一方面生物体中存在有特殊的修复系统，可另一方面生物体中存在有特殊的修复系统，可以对某些损伤进行适当的修复；以对某些损伤进行适当的修复； 这两方面的统一，构成了生物遗传、变异和选这两方面的统一，构成了生物遗传、变异和选择进化的基本特征。择进化的基本特征。 二、二、DNADNA损伤的修复损伤的修复四川省精品课程 生物化学修复分为两大类：修复分为两大类：u 一类是把错误的

29、碱基去除，换成正确碱基，一类是把错误的碱基去除，换成正确碱基，使损伤部位恢复正常，称之为使损伤部位恢复正常，称之为校正修复校正修复；u 另一类修复差错率高，称为另一类修复差错率高，称为倾错性修复倾错性修复。四川省精品课程 生物化学1.1.校正修复校正修复三种方式：光修复、切除修复和重组修复。三种方式：光修复、切除修复和重组修复。 四川省精品课程 生物化学 这是一种对紫外线引起的嘧啶二这是一种对紫外线引起的嘧啶二聚体高度专一的修复机制。聚体高度专一的修复机制。 该酶能被可见光激活，专一识别该酶能被可见光激活，专一识别并作用于紫外线引起的嘧啶二聚并作用于紫外线引起的嘧啶二聚体，将二聚体分解为单体状

30、态，体，将二聚体分解为单体状态，使使DNADNA结构恢复正常。结构恢复正常。 当细菌被紫外线损伤后，暴露于当细菌被紫外线损伤后，暴露于可见光下，大部分损伤的细胞可可见光下，大部分损伤的细胞可以得到恢复，原因就在于此，这以得到恢复，原因就在于此，这种现象称种现象称光复活现象光复活现象。 （1 1）光修复）光修复四川省精品课程 生物化学 切除修复切除修复是在多种酶参与下将是在多种酶参与下将DNADNA分子中受损伤的分子中受损伤的部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切除的部分，从而使切除的部分，从而使DNADNA恢复正常结构的过程。恢复正常结构的过程。

31、 这是这是生物界普遍存在的一种修复机制生物界普遍存在的一种修复机制，它对多种，它对多种损伤均能起修复作用。参与损伤均能起修复作用。参与DNADNA切除修复的酶主要切除修复的酶主要有：特异的修复内切酶、核酸外切酶、有：特异的修复内切酶、核酸外切酶、DNADNA聚合酶聚合酶及连接酶等。及连接酶等。（2 2）切除修复）切除修复 四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学（3 3）重组修复）重组修复 含嘧啶二聚体及其他损伤的含嘧啶二聚体及其他损伤的DNADNA也可以先复制，后也可以先复制，后修复。修复。(1)(1)复制复制：以损伤单链为：以损伤单链为模板复制时，越过损伤部

32、模板复制时，越过损伤部位，对应位点留下缺口；位，对应位点留下缺口；未损伤单链复制成完整双未损伤单链复制成完整双链。链。(2)(2)重组重组：缺口单链与完：缺口单链与完整同源单链重组，缺口转整同源单链重组，缺口转移到完整链，使损伤单链移到完整链，使损伤单链的互补链完整，损伤单链的互补链完整，损伤单链仍然保留。仍然保留。(3)(3)再合成再合成：转移后的缺：转移后的缺口以新的互补链为模板聚口以新的互补链为模板聚合补齐。合补齐。四川省精品课程 生物化学2.SOS2.SOS修复（倾错性修复）修复（倾错性修复） SOSSOS修复是细胞修复是细胞DNADNA受到损伤致使复制受阻的紧受到损伤致使复制受阻的紧

33、急情况下，为求得生存出现的急情况下，为求得生存出现的应急效应应急效应。 紫外线照射后，如果紫外线照射后，如果DNADNA两条链上产生的两个两条链上产生的两个嘧啶二聚体处在相邻位置时，这种损伤不能被嘧啶二聚体处在相邻位置时，这种损伤不能被切除或重组修复所修复。切除或重组修复所修复。 单链单链DNADNA上出现了嘧啶二聚体及一些化学诱变上出现了嘧啶二聚体及一些化学诱变剂与碱基作用产生的异常碱基，也不能被前述剂与碱基作用产生的异常碱基，也不能被前述的修复机制所修复。的修复机制所修复。 正常的正常的DNADNA聚合酶复制到模板损伤处被迫停止。聚合酶复制到模板损伤处被迫停止。 四川省精品课程 生物化学

34、在在DNADNA复制受到抑制的紧急情况下，细胞内通复制受到抑制的紧急情况下，细胞内通过复杂的调控机制，过复杂的调控机制，诱导产生一种缺乏校对功诱导产生一种缺乏校对功能的能的DNADNA聚合酶聚合酶，它可促使四种，它可促使四种dNTPdNTP中任何一中任何一种与模板损伤部位的碱基配对，掺入到新生的种与模板损伤部位的碱基配对，掺入到新生的子链上。子链上。 这样受损伤的母链虽可进行复制，但却增加了这样受损伤的母链虽可进行复制，但却增加了复制错误机率，其结果是提高了生物的存活率，复制错误机率，其结果是提高了生物的存活率，却增加了变异率。却增加了变异率。 SOSSOS修复广泛存在于原核与真核生物中，它是

35、修复广泛存在于原核与真核生物中，它是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。 四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学第五节第五节 基因工程基因工程 在体外将不同的在体外将不同的DNADNA片段（片段（目标基因与载体目标基因与载体）连接起来，形成连接起来，形成重组体重组体，再把它，再把它导入特定导入特定受体细胞受体细胞，随着受体细胞的繁殖，重组体，随着受体细胞的繁殖，重组体DNADNA得到扩增，得到扩增，目的基因得以表达目的基因得以表达，从而使，从而使受体细胞获得受体细胞获得新的遗传特性新的遗传特性的技术的技术称基因称基因

36、工程。工程。 四川省精品课程 生物化学u 质粒是细菌拟核裸质粒是细菌拟核裸露露DNADNA外的遗传物质外的遗传物质，为环形闭合的双股为环形闭合的双股DNA,DNA,存在于细胞质中；存在于细胞质中；u 质粒编码非细菌生质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。素、毒素和耐药性等。u 质粒具有可质粒具有可自主复自主复制、传给子代、也可丢制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等失及在细菌之间转移等特性，特性，与细菌的遗传变与细菌的遗传变异有关。异有关。四川省精品课程 生物化学一、目标基因的获得一、目标基因的获得 目标基因是指需

37、要导入宿主细胞的外源基目标基因是指需要导入宿主细胞的外源基因。主要有三条获取途径：因。主要有三条获取途径：从生物基因组从生物基因组中分离、中分离、cDNAcDNA法制备及化学法合成。法制备及化学法合成。 四川省精品课程 生物化学1.1.从生物基因组中分离从生物基因组中分离 从基因组分离是指从从基因组分离是指从供体细胞供体细胞DNADNA大分子大分子中分中分离目标基因。离目标基因。 首先是将供体细胞首先是将供体细胞DNADNA用限制酶断裂成许多适用限制酶断裂成许多适当大小的片段，让这些当大小的片段，让这些DNADNA片段与载体片段与载体DNADNA重组重组连接，再转化到特定的宿主细胞中，筛选出含

38、连接，再转化到特定的宿主细胞中，筛选出含有重组体有重组体DNADNA的受体细胞，克隆。的受体细胞，克隆。 可用分子杂交等方法，从中选出含有目标基因可用分子杂交等方法，从中选出含有目标基因重组体的克隆株，并提取其重组体重组体的克隆株，并提取其重组体DNADNA，经特，经特定限制酶切割，便可分离得到目标基因。定限制酶切割，便可分离得到目标基因。 四川省精品课程 生物化学2.cDNA2.cDNA法（亦称反转录法）法（亦称反转录法）先提取编码目标蛋白质先提取编码目标蛋白质的的mRNAmRNA，以，以mRNAmRNA为模板为模板合成出与其碱基互补的合成出与其碱基互补的DNADNA（cDNAcDNA）。）

39、。四川省精品课程 生物化学3.3.化学合成法化学合成法 现已研制出了现已研制出了DNADNA自动合成仪，可以较方便地自动合成仪，可以较方便地合成单链合成单链DNADNA小片段，给化学合成目标基因带小片段，给化学合成目标基因带来了方便。来了方便。四川省精品课程 生物化学二、载体的选择二、载体的选择 外源目标基因不易直接进入宿主细胞，即使进入后外源目标基因不易直接进入宿主细胞，即使进入后也难以进行复制和表达，大多数情况下会被宿主的也难以进行复制和表达，大多数情况下会被宿主的限制酶系统降解掉。限制酶系统降解掉。作为载体应该具备一定的条件：作为载体应该具备一定的条件： 它们是相对分子质量较小的环形它们

40、是相对分子质量较小的环形DNADNA； 有独立复制和表达的功能；有独立复制和表达的功能； 有某些限制酶的单一切点，以便在此位点上插入目标基因；有某些限制酶的单一切点，以便在此位点上插入目标基因； 对特定宿主有专一的转化能力及有被筛选的基因标记等。对特定宿主有专一的转化能力及有被筛选的基因标记等。 四川省精品课程 生物化学 符合这些基本条件的载体主要有符合这些基本条件的载体主要有质粒质粒DNADNA、噬菌、噬菌体体 DNADNA和病毒和病毒DNADNA三大类。三大类。 天然的载体需经改造才能成为基因工程可利用的天然的载体需经改造才能成为基因工程可利用的理想载体。所谓理想载体。所谓改造改造，是把载

41、体，是把载体DNADNA上的某些不上的某些不必需片段去除，某些多余的限制酶切点通过点突必需片段去除，某些多余的限制酶切点通过点突变方法消去，某些位点应增加特定的功能片段等。变方法消去，某些位点应增加特定的功能片段等。四川省精品课程 生物化学三、目标基因和载体三、目标基因和载体DNADNA的体外连接的体外连接 目标基因和载体目标基因和载体DNADNA的体外连接方法主要有的体外连接方法主要有粘粘性末端法、人工接头法和均聚核苷酸加尾法性末端法、人工接头法和均聚核苷酸加尾法。1.1.粘性末端法粘性末端法 限制酶识别并交错切开限制酶识别并交错切开DNADNA上的回文顺序后，得到两个有相上的回文顺序后，得

42、到两个有相同单链末端顺序的双链同单链末端顺序的双链DNADNA片段，这两个单链末端彼此可重片段，这两个单链末端彼此可重新互补配对，故称为新互补配对，故称为粘性末端粘性末端。 不同的不同的DNADNA片段若能被片段若能被同一种限制酶切割同一种限制酶切割，产生的粘性末端，产生的粘性末端一定是一定是互补互补的，可以相互配对粘接，再通过的，可以相互配对粘接，再通过DNADNA连接酶将裂连接酶将裂缝以缝以33，5-5-磷酸二酯键连接起来，就得到了重组的磷酸二酯键连接起来，就得到了重组的DNADNA分子。分子。四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学2.2.人工接头法人工接头法 人工合成出含有某种

43、限制酶切割位点顺序的双人工合成出含有某种限制酶切割位点顺序的双链链DNADNA小片段（此类小片段称为人工接头）；小片段（此类小片段称为人工接头）； 用用T T4 4DNADNA连接酶将其连接到目标基因及载体连接酶将其连接到目标基因及载体DNADNA两端的平末端上，再用专一切割该人工接头的两端的平末端上，再用专一切割该人工接头的限制酶在此接头上切出粘性末端，便可通过粘限制酶在此接头上切出粘性末端，便可通过粘性末端法连接。性末端法连接。 此法可使任意两个此法可使任意两个DNADNA片段通过人工接头而连片段通过人工接头而连接起来。接起来。 四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学3.3.均聚

44、核苷酸接尾法均聚核苷酸接尾法 通过末端核苷酸转移酶在目标基因双链通过末端核苷酸转移酶在目标基因双链DNADNA的的两个两个3-3-端分别聚合上一段多聚脱氧腺苷酸端分别聚合上一段多聚脱氧腺苷酸（或多聚脱氧鸟苷酸），在载体（或多聚脱氧鸟苷酸），在载体DNADNA的两个的两个3-3-端分别聚合上一段多聚脱氧胸苷酸（或多端分别聚合上一段多聚脱氧胸苷酸（或多聚脱氧胞苷酸），然后将接尾的两种聚脱氧胞苷酸），然后将接尾的两种DNADNA一起一起保温退火，则可形成均聚物尾巴间的互补配对，保温退火，则可形成均聚物尾巴间的互补配对，再由再由DNADNA聚合酶聚合酶I I补齐缺口，连接酶封闭裂缝。补齐缺口，连接酶封

45、闭裂缝。 四川省精品课程 生物化学四川省精品课程 生物化学四、将重组体四、将重组体DNADNA导入受体细胞导入受体细胞 1.1.转化转化 转化指外源转化指外源DNADNA直接进入直接进入受体细胞，并使受体细胞受体细胞，并使受体细胞获得新的遗传特性的过程。获得新的遗传特性的过程。 转化过程中，受体细胞需转化过程中，受体细胞需先经氯化钙处理以提高细先经氯化钙处理以提高细胞膜的通透性，使外源胞膜的通透性，使外源DNADNA分子容易进入细胞。分子容易进入细胞。 四川省精品课程 生物化学2.2.转导转导 以噬菌体以噬菌体DNADNA为载体，为载体，与目标基因组成重组噬与目标基因组成重组噬菌体菌体DNAD

46、NA，经体外包装，经体外包装成为噬菌体。然后去感成为噬菌体。然后去感染宿主细胞，包装在其染宿主细胞，包装在其中的重组中的重组DNADNA便被注入便被注入到宿主细胞内。这种以到宿主细胞内。这种以噬菌体为媒介向受体菌噬菌体为媒介向受体菌引入外源引入外源DNADNA的方式称的方式称转导转导。转导能达到高效。转导能达到高效转移重组转移重组DNADNA的目的。的目的。四川省精品课程 生物化学在动物基因工程中还在动物基因工程中还可用显微注射仪微量可用显微注射仪微量注射动物细胞；在植注射动物细胞；在植物基因工程中可用基物基因工程中可用基因枪打孔技术或在开因枪打孔技术或在开花期从花粉管通道直花期从花粉管通道直

47、接滴加外源接滴加外源DNADNA进入子进入子房。房。 四川省精品课程 生物化学五、转化子的筛选和鉴定五、转化子的筛选和鉴定 重组重组DNADNA分子进入宿主细胞后能被保留下来，并且分子进入宿主细胞后能被保留下来，并且独立复制扩增，这样的受体细胞叫转化子。独立复制扩增，这样的受体细胞叫转化子。一般一般转化的频率是很低的，因此，需要认真地筛选和转化的频率是很低的，因此，需要认真地筛选和鉴定。目前已建立了多种可靠性较高的转化子检鉴定。目前已建立了多种可靠性较高的转化子检测法，如原位杂交法、免疫检测法等；现就最常测法，如原位杂交法、免疫检测法等；现就最常用的用的原位杂交法原位杂交法作一简单的介绍。作一

48、简单的介绍。 四川省精品课程 生物化学 原位杂交法：原位杂交法：将经转将经转化或转导处理的细胞化或转导处理的细胞接种在琼脂平板上，接种在琼脂平板上，复以复以硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜，保温培养待菌落生长保温培养待菌落生长后，取下滤膜。后，取下滤膜。 用碱处理使滤膜上的用碱处理使滤膜上的细菌裂解细菌裂解，菌体，菌体DNADNA变变性释放到纤维素膜上，性释放到纤维素膜上，将膜在将膜在80C80C烘干，使烘干，使DNADNA牢固地吸附在滤膜牢固地吸附在滤膜上。上。四川省精品课程 生物化学用预先制备好的用预先制备好的带带放射性标记的探针放射性标记的探针（与目标（与目标DNADNA有互补有互补碱基顺序

49、的小段碱基顺序的小段DNADNA或或RNARNA）与滤膜上的）与滤膜上的变性变性DNADNA进行原位杂进行原位杂交，洗去未杂交的探交，洗去未杂交的探针。针。 四川省精品课程 生物化学 将滤膜用将滤膜用放射自显影法放射自显影法检测，含有与探针互补检测，含有与探针互补碱基顺序的重组碱基顺序的重组DNADNA可可与探针互补结合，其所与探针互补结合，其所在菌落呈放射阳性。在菌落呈放射阳性。 与原培养基平板上的菌与原培养基平板上的菌落位置对照，即可挑出落位置对照，即可挑出与其与其对应的菌落对应的菌落，此即，此即为含有目标基因重组体为含有目标基因重组体的克隆株。的克隆株。四川省精品课程 生物化学六、外源基

50、因的正确表达六、外源基因的正确表达 根据已掌握的基因工程知识，要使外源基因在宿主根据已掌握的基因工程知识，要使外源基因在宿主细胞中克隆和高效表达产物，必需具备几个条件：细胞中克隆和高效表达产物，必需具备几个条件：（1 1）高效转录的条件：）高效转录的条件：应该把外源基因插在转录效应该把外源基因插在转录效率高的强启动子下游。率高的强启动子下游。（2 2）正确翻译的条件：）正确翻译的条件：为使插入基因表达正常的翻为使插入基因表达正常的翻译产物，应将外源基因插入到翻译起始密码子译产物，应将外源基因插入到翻译起始密码子ATGATG之前，之前，SDSD序列之后的适当位置。序列之后的适当位置。四川省精品课