1、基因重组和基因工基因重组和基因工程程(ppt)优选基因重组和基因工程优选基因重组和基因工程自然界自然界DNADNA重组和基因转移是经常重组和基因转移是经常发生的发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature第一节第一节什么是什么是DNA重组？重组？DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。 DNA DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能和表达的
2、功能 DNA重组广泛存在于各类生物：重组广泛存在于各类生物：真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。源染色体之间的交换。原核生物来自不同亲代两组原核生物来自不同亲代两组DNADNA之间可通过多种之间可通过多种形式遗传重组。形式遗传重组。 意义意义：迅速增加群体遗传多样性、区分有利、不利突变、：迅速增加群体遗传多样性、区分有利、不利突变、 通过优化组合积累有意义的遗传信息通过优化组合积累有意义的遗传信息 参与许多重要的生物学过程参与许多重要的生物学过程转转 座座 (transposition)同源重组同源重组 (homologous r
3、ecombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination) 概念：发生在概念：发生在同源序列同源序列间的重组，通过链的断间的重组，通过链的断裂（裂（,配对）和再连接，在两个配对）和再连接，在两个DNA分子同源分子同源序列间进行单链或双链片段交换的过程。序列间进行单链或双链片段交换的过程。 又称基本重组（又称基本重组（general recombination)。 是最基本的是最基本的DNA重组方式重组方式一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式同源重组最初的证据来自细胞遗传学对减数分裂时染同源重组最初的证据来自细胞
4、遗传学对减数分裂时染色体行为的研究。真核生物在形成配子时，细胞染色色体行为的研究。真核生物在形成配子时，细胞染色体进行一次复制，细胞核进行两次分裂，由此从双倍体进行一次复制，细胞核进行两次分裂，由此从双倍体细胞产生单倍体细胞，故称减数分裂。体细胞产生单倍体细胞，故称减数分裂。前期，参与联会的同源染色体实际上已复制形成两条前期，参与联会的同源染色体实际上已复制形成两条姊妹染色体，从而出现有四条染色体构成的四联体。姊妹染色体，从而出现有四条染色体构成的四联体。在四联体的某些位置非姊妹染色单体之间可以发生交在四联体的某些位置非姊妹染色单体之间可以发生交换。换。n同源重组机制同源重组机制Hollida
5、y模型模型（1）两个同源染色体）两个同源染色体DNA排列整齐（任意两个排列整齐（任意两个同源同源DNA片断可以发生重组，但同源双链片断可以发生重组，但同源双链DNA分子必须紧密接触，方能交换）。分子必须紧密接触，方能交换）。 B C B C a b c a b c a b c a b c123 34 4 （2）一个）一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接对应的链连接5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 （3）通过分支移动产生异源双链）通过分支移动产生异源双链DNA，形成形成Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3
6、 5 3 片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) （4）Holliday中间体切开并修复，形成两个中间体切开并修复，形成两个双链重组体双链重组体DNA，分别为：，分别为：5 3 5 5 5 3 3 3 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)5 3 5 5 5 3 3 3 拼接重组体拼接重组体5 5 5 5 3 3 3 3 5 3 5 5 5 3 3 3 DNA连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 片段重组体片段重组体 （见模型图右
7、边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本本DNA。 拼接重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图左边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。 参与参与E.coli同源重组的主要酶同源重组的主要酶RecA蛋白：结合单链蛋白：结合单链DNA，形成的复合物，复合，形成的复合物，复合物可将物可将RecBCD：具有三种酶活性：具有三种酶活性：DNA解旋酶；
8、核解旋酶；核酸外切酶；单链内切酶的活性。酸外切酶；单链内切酶的活性。RuvC ：特异的识别：特异的识别Holliday分支点，并改变分支点，并改变DNA在在Holliday分支点处的构型，将两条单链切断，随分支点处的构型，将两条单链切断，随后由连接酶将切口连接后由连接酶将切口连接. 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holid
9、ay中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体 不需要特异不需要特异DNA序列，而是依赖两个分子间序列，而是依赖两个分子间序列的相同或相似性（同源性）；序列的相同或相似性（同源性）； 同源双链同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方分子必须紧密接触，相
10、对应方才能交换（联会）才能交换（联会）重组时，两个重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失（空隙）。有一段单链缺失（空隙）。二、细菌的基因转移与重组有四种方式二、细菌的基因转移与重组有四种方式细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组适应随时改变的环境。并通过基因重组适应随时改变的环境。这种遗传信息的流动不仅发生在种内，也发生这种遗传信息的流动不仅发生在种内，也发生在种间在种间如果被转移基因与内在基因部分同源就可以发如果被转移基因与内在基因部分同源就可以发生同源重组生同源重组（一）接合作用（一）接合作用
11、当细菌的细胞通过性菌毛相互接触时，当细菌的细胞通过性菌毛相互接触时，质粒质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞的过从一个细胞转移至另一细胞的过程称为接合作用程称为接合作用(conjugation)。供体细胞被定义为雄性供体细胞被定义为雄性受体细胞被定义为雌性受体细胞被定义为雌性 能够促使能够促使DNA转移的质粒称为致育因子，转移的质粒称为致育因子， F 因子因子(F factor) 与接合功能有关的蛋白质（性菌毛等）均与接合功能有关的蛋白质（性菌毛等）均由由F因子编码。因子编码。F质粒质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（中，使受体菌成为高
12、频重组（Hrf)菌株菌株若若F质粒的质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为体菌不能转化为F+F质粒的质粒的DNA可以被切割出来，有时可携带宿可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体主菌的染色体DNA，称作，称作F因子，因子， F因子携因子携带的基因可在受体菌表达。带的基因可在受体菌表达。（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细菌获得新的遗传性状的现象，使细菌获得新的遗传性状的现象，称为转化作用称为转化作用 (transformation)。具有摄取周围环境中游离具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的
13、细菌分子能力的细菌称为称为感受态细胞感受态细胞很多细菌在自然条件下就有吸收外源很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能的能力（如固氮菌、链球菌等），虽然感受态经常力（如固氮菌、链球菌等），虽然感受态经常是瞬间的。是瞬间的。自然条件下感受态的形成需要自然条件下感受态的形成需要10多种蛋白质参多种蛋白质参与与实验室：高浓度的实验室：高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受处理使细菌形成感受态态.游离游离DNA与细胞表面与细胞表面DNA结合结合蛋白结合，蛋白结合，.其中一股链被核酸酶降解，另一其中一股链被核酸酶降解，另一股链被吸收股链被吸收（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放当病
14、毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移转移及基因重组即为转导作用及基因重组即为转导作用(transduction)。通过噬菌体（病毒）将细菌（细胞）基通过噬菌体（病毒）将细菌（细胞）基因从供体转移到受体因从供体转移到受体噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)转导过程（四）细胞融合（四）细胞融合细胞质膜融合导致基因转移、重组细胞质膜融合导致基因转移、重组实验
15、室：溶菌酶除细菌细胞壁，人工促使原生实验室：溶菌酶除细菌细胞壁，人工促使原生质体融合，引起广泛的重组。质体融合，引起广泛的重组。三、位点特异重组，即特异位点间三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合发生的整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。 原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位点的同源区，这类重组称
16、作点的同源区，这类重组称作 噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒cDNA的长末端重复序列的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组如果一个如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重分子上两个特异位点之间发生重组，其后果有两种可能性：即两个位点之间的组，其后果有两种可能性：即两个位点之间的节段或被丢
17、失，或被颠倒。节段或被丢失，或被颠倒。倘若基因重组发生在调节基因或基因调控区，倘若基因重组发生在调节基因或基因调控区，就会影响某些基因的就会影响某些基因的“开关开关”机制。有些生物机制。有些生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达。能够利用这种重组倒置来控制基因的表达。两端各有一个两端各有一个14bp的反向重复序列（特异重组的反向重复序列（特异重组位点位点-hix），二者方向相反。），二者方向相反。中间是中间是hin基因，编码特异的重组酶基因，编码特异的重组酶-倒位酶，倒位酶，催化催化H片段片段倒位重组。倒位重组。 hin基因两端各有一个启动子（基因两端各有一个启动子（P)，其中一个，其中一个
18、启动子启动启动子启动hin基因表达产生倒位酶，另一个启动基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的子正向启动邻近的H2和和rH1基因表达，分别产生基因表达，分别产生H2鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻遏蛋白。阻抑蛋白可抑制远方阻抑蛋白可抑制远方H1基因的表达。因而结果是基因的表达。因而结果是H2表达而表达而H1不表达。不表达。H片段的组成和功能：片段的组成和功能：沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。 hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片段片段可在可在Hin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H片段上有两个启动子片
19、段上有两个启动子P，其一驱动，其一驱动hin基基因表达，另一正向时驱动因表达，另一正向时驱动H2和和rH1基因基因表达，反向表达，反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变四、转座重组四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座为转座(transposition)。 插入序列插入序列
20、(insertion sequences, IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition) 复制性转座复制性转座(duplicative transposition)当插入序列转座时，宿主靶部位双链被交错切当插入序列转座时，宿主靶部位双链被交错切开，经修复后形成短的正向重
21、复开，经修复后形成短的正向重复靶序列通常是任意的但交错切开的长度是固定靶序列通常是任意的但交错切开的长度是固定的。的。插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座 转座子转座子(transposons) 可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入
22、序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座由转座子介导的转座第二节第二节 重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Me
23、ndel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克
24、隆了多莉。一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆 技术水平：分子克隆技术水平：分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、传物质（同源的或异源的、原核的或真核的
25、、天然的或人工的天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具接合成一具有 自 我 复 制 能 力 的有 自 我 复 制 能 力 的 D N A 分 子分 子 复 制 子复 制 子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或分子，也称基因克隆或重组重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆 生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细
26、胞工程等 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶
27、酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而
28、无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，第二链合成，双链双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restric
29、tion endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 分类：分类： 作用：作用：类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAG
30、GCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功异源酶：同功异源酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘
31、性末端称为配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶名称 识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生突出末端:BamH 5GGATCC.3Bgl 5AGATCT.3EcoR 5GAATTC.3Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3切割后产生3突出末端:Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.3Kpn 5GGTACC.3Pst 5CTGCAG.3Sph 5GCATGC.3切割后产生
32、平末端:Alu 5AGCT.3EcoR 5GATATC.3Hae 5GGCC.3Pvu 5CAGCTG.3Sma 5CCCGGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（三）目的基因（三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA (通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。以单链。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染
33、色染色体及线粒体体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 （四）基因载体（四）基因载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些一些DNA分子。分子。 常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特
34、意设计的载体称为表达载体。多肽链而特意设计的载体称为表达载体。n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.1.质粒质粒 (plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予
35、宿主细胞一些遗传性状。 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病
36、毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）4.其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。基因组基因组DNA文库文库(gen
37、omic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第见第22章章) 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合
38、从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链c
39、DNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接
40、配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接1. 粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的
41、基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2. 平端连接
42、平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase) 的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机
43、械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5 由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 4. 人工接头人工接头(linker)连接连接人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTT
44、AAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等
45、如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选( (插入失活法插入失活法) ) 抗药性标记选择抗药性标记选择 互补互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法
46、免疫学方法 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 熟悉蛋白质的分子组成特点；氨基酸的化学结构、分熟悉蛋白质的分子组成特点；氨基酸的化学结构、分类、三字符号及理化性质；肽及多肽链的两端；谷胱类、三字符号及理化性质；肽及多肽链的两端；谷胱甘肽。甘肽。掌握蛋白质一至四级结构的概念、要点、主要化学键掌握蛋白质一至四级结构的概念、要点、主要化学键及模体及模体(motif)、结构域、结构域(domain)、
47、分子伴侣、分子伴侣(chaperon)的概念。的概念。掌握蛋白质重要的理化性质。掌握蛋白质重要的理化性质。熟悉蛋白质分离和纯化的方法及其原理。熟悉蛋白质分离和纯化的方法及其原理。掌握核酸的分类、生物学功能、分子组成、化学结构掌握核酸的分类、生物学功能、分子组成、化学结构特点。特点。掌握核酸一级结构的概念及连接键。掌握核酸一级结构的概念及连接键。掌握掌握DNA的碱基组成及的碱基组成及Chargaff规则、规则、DNA的双螺旋的双螺旋结构要点。结构要点。熟悉熟悉DNA的超螺旋结构、核小体的组成。的超螺旋结构、核小体的组成。掌握掌握RNA的分类、的分类、mRNA的结构特点、的结构特点、tRNA一级结
48、一级结构及二级结构的特点、构及二级结构的特点、rRNA的功能。的功能。掌握掌握DNA的变性、的变性、DNA的复性及分子杂交。的复性及分子杂交。掌握酶的概念。掌握酶的概念。熟悉酶的分子组成：全酶的组成、辅酶与辅基、金属离子熟悉酶的分子组成：全酶的组成、辅酶与辅基、金属离子的作用、维生素构成的辅酶与辅基。的作用、维生素构成的辅酶与辅基。掌握酶活性中心的概念、活性中心的必须基团。掌握酶活性中心的概念、活性中心的必须基团。掌握酶促反应的特点：高效性、特异性、可调节性。掌握酶促反应的特点：高效性、特异性、可调节性。掌握影响酶的反应动力学因素、米掌握影响酶的反应动力学因素、米-曼氏方程式、曼氏方程式、Km
49、与与Vm的意义、酶的最适温度、最适的意义、酶的最适温度、最适pH、可逆性抑制作用的概念、可逆性抑制作用的概念、类型及其特点。类型及其特点。熟悉不可逆性抑制作用的概念、类型及其特点。熟悉不可逆性抑制作用的概念、类型及其特点。掌握酶原及酶原激活的概念、酶共价修饰的概念、同工酶掌握酶原及酶原激活的概念、酶共价修饰的概念、同工酶的概念及特点。的概念及特点。熟悉酶原激活的机理；酶的变构调节；化学修饰调节的特熟悉酶原激活的机理；酶的变构调节；化学修饰调节的特点；乳酸脱氢酶同工酶的种类、分布、功能及临床意义。点；乳酸脱氢酶同工酶的种类、分布、功能及临床意义。 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步
50、骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达 标准：选择标志标准：选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列
