1、白光白光(太阳光太阳光)：由各种单色光组成的复合光：由各种单色光组成的复合光吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 有色物质的不同颜色是由于吸收了不同波长的光所致。溶液能选择性地吸收某些波长的光，而让其他波长的光透过，这时溶液呈现出透过光的颜色。透过光的颜色是溶液吸收光的互补色。有色溶液对各种波长的光的吸收情况，常用光吸收曲线来描述。将不同波长的单色光依次通过一定的有色溶液，分别测出对各种波长的光的吸收程度（用字母A表示）。以波长为横坐标，吸光程度为纵坐标作图，所得的曲线称为吸收曲线或吸收光谱曲线。能复合成白光的两种颜色的光叫能复合成白光的两种颜色的光叫互互补色光补色光。物质所显示的物质所显
2、示的颜色是吸颜色是吸收光的互补色。收光的互补色。 几乎所有的无机离子和许多有机化合物可以用分光光度法进行测定。如土壤中的氮、磷以及植物灰、动物体液中各种微量元素的测定。 通常，待测物质的含量1105时，能够用分光光度法准确测定。所以它主要用于测定微量组分。 光分析法：光分析法：基于物质基于物质发射发射的电磁辐射或电的电磁辐射或电磁辐射能量与磁辐射能量与待测物质待测物质相互相互作用后作用后所产生所产生的的辐射信号辐射信号与物质与物质组成及结构组成及结构关系所建立关系所建立起来的分析方法起来的分析方法 吸光度吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度
3、一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以或物质后的透射光强度比值的以10为底的为底的对数（即对数（即lg(Iin/Iout)，影响它的因素有溶剂、，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。浓度、温度等等。 简单的说，吸光度就是表示物质对光的简单的说，吸光度就是表示物质对光的吸收程度吸收程度（1）能源提供能量）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。）产生信号。 基本特点基本特点：（1）一般光分析法均包含三个基本过程；）一般光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于）选择性测量
4、，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。）涉及大量光学元器件。三个基本过程 溶液颜色与光吸收的关系 光波是一种电磁波。电磁波包括无线电波、光波是一种电磁波。电磁波包括无线电波、微波、红外光、可见光、紫外光、微波、红外光、可见光、紫外光、x x射线等。如果射线等。如果按照其频率或波长的的大小排列，可见光只是电按照其频率或波长的的大小排列，可见光只是电磁波中一个很小的波段。见表磁波中一个很小的波段。见表12121 1 在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法的分析方法称为吸光光度法,
5、 ,主要有主要有: : 红外吸收光谱：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围分子振动光谱，吸收光波长范围2.5 1000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围200 400 nm（近紫外区）（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围400 750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。，主要用于有色物质的定量分析。 吸收曲线的讨论 （1）同一种物质对不同波长光的吸光度不
6、）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长最大吸收波长max （2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似形状相似max不变。而对于不同物质，它们的不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和吸收曲线形状和max则不同。则不同。 （3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。之一。 （4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在有差异，在max处吸光度处吸光度
7、A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。 （5）在在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。KMnO4的颜色及吸收光谱叶绿素的结构和吸收光谱第二节 紫外可见分光光度计仪器仪器 紫外-可见分光光度计一、基本组成一、基本组成 general process光源单色器样品室检测器显示1. 1. 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可
8、见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。 2.2.单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。波长单色光的光学系统。 入射狭缝入射狭缝：光源的光由此进入单色器；：光源的光由此进入单色器； 准光装置准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； 聚焦装置聚焦装置：透镜或：透镜或凹面反射镜，将分光凹面反射镜，将分光后所得
9、单色光聚焦至后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝； 出射狭缝出射狭缝。3.3.样品室样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池紫外区须采用石英池，可见区一可见区一般用玻璃池。般用玻璃池。4.4.检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5. 5. 结果显示记录系统结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理二、分光光度计的类型二、分光光度计的类型1.1.单光束单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求
10、光源和检测器具有很高的稳定性。2.2.双光束双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。3.3.双波长双波长 将不同波长的两束单色光(1、2) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。= 12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。A 原理光栅光栅和棱和棱镜分镜分光原光原理理双光束光度计动画示意动 画双波长光度计光路示意图医疗器械产品对紫外吸光度的要求医疗器械产品对紫外吸光度的要求GB 8368-2005 、 GB 8369-2005 将浸提液通过孔径为将浸提液通过孔径为0.45m的滤膜进行过的滤膜进行过滤，以避免漫射光干扰。在制备后滤，以避免漫射光干扰。在制备后5h内，内，将该溶液放人将该溶液放人1cm的石英池中，空白液放入的石英池中，空白液放入参比池中，用扫描参比池中，用扫描UV分光光度计记录分光光度计记录250 nm-320 nm波长范围内的光谱。波长范围内的光谱。 以吸光度对应波长的记录图谱报告结果。以吸光度对应波长的记录图谱报告结果。 上述方法试验时，浸提液的吸光度应不大上述方法试验时，浸提液的吸光度应不大于于0.1
