1、429572439gao课题3 酵母细胞的固定化429572439gao甜甜一、课题背景高果糖浆 高高果糖浆是果糖浆是果糖含量为果糖含量为42%42%左右的糖浆左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，不样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，不会对人的健康造成大的伤害会对人的健康造成大的伤害。葡萄糖异构酶果糖果糖葡萄糖葡萄糖1. 直接使用酶制剂天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，条件非常敏感，容易失活。容易失活。溶液中酶溶液中酶很难回收很难回收，不能再次利用
2、，不能再次利用，提高了生提高了生产成本。产成本。反应后，反应后，酶会混在产物中酶会混在产物中，影响产品质量，难以，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用在工业生产中广泛应用（1）优点（2）缺点催化效率高、低耗能、低污染催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食，大规模地应用于食品、化工等各个领域。品、化工等各个领域。1. 直接使用酶制剂（3）解决方案将酶固定在一定空间内的技术，如将酶固定在一定空间内的技术，如固定在不溶于水的载体上。固定在不溶于水的载体上。利用固定化酶技术生产利用固定化酶技术生产“高果糖浆高果糖浆”。 将固定好的酶颗粒装到一个将固定好的酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布
3、着反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。许多小孔的筛板。酶颗粒无法通酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。可以自由出入。 将葡萄糖溶液从反应柱上端将葡萄糖溶液从反应柱上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与葡萄糖异构酶接触，转化为果与葡萄糖异构酶接触，转化为果糖，从反应柱下端流出。糖，从反应柱下端流出。 酶既酶既能与反应物接触能与反应物接触，又，又能与产物分离能与产物分离，同时，同时，固定在载体上的酶还可以被固定在载体上的酶还可以被反复利用反复利用。缺点 一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，一种酶只能催化一种化
4、学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过很多产物的形成是通过一系列的酶促反应一系列的酶促反应才能得到。才能得到。 反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。提高果糖的产量和质量。将细胞固定在一定空间内的技术。将细胞固定在一定空间内的技术。 成本低、操作容易、成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收。以催化一系列的反应、容易回收。缺点 固定后的固定后的细胞与反应物不容易接近细胞与反应物不容易接近，可能导致可能导致反应效果下降，反应效果下降，由于由于大分子物质难以自由通过细胞大分子
5、物质难以自由通过细胞膜膜，因此固定化细胞的，因此固定化细胞的应用也受到限制。应用也受到限制。二、酶和细胞固定化方法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法化学结合法化学结合法 1. 固定化酶或固定化细胞：指利用指利用物理或化学方法物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间将酶或细胞固定在一定空间内的技术。内的技术。 2. 方法：将酶（或细胞）包埋在细微网将酶（或细胞）包埋在细微网格里格里将酶（或细胞）相互结合，将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。或将其结合到载体上。将酶（或细胞）吸附在载体表将酶（或细胞）吸附在载体表面上面上包埋法化学结合法物理吸附法固定化酶或固定化细胞采取的方法【比较】酶和细胞的
6、固定方法和特点酶分子很小，酶分子很小，容易从包埋材料中容易从包埋材料中漏出。漏出。细胞体积大，细胞体积大，难以被吸附或结难以被吸附或结合。合。三、实验操作：包埋法固定细胞 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。和聚丙烯酰胺等。 1. 包埋法固定细胞： 即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。的多孔性载体中。 2. 包埋时常用的载体包括：海藻酸钠： 一种天然一种天然多糖多糖，是由海带中提取的天然多糖碳水化，是由海带中提取的天然多糖碳水化合物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架材料合物，可作为食用的食品添加
7、剂，也可作为支架材料用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性使其适于作为释放或包埋药物。相容性使其适于作为释放或包埋药物。三、实验操作 请同学们分组讨论请同学们分组讨论“制制备固定化酵母细胞的的备固定化酵母细胞的的操作操作步骤及注意事项步骤及注意事项”小组活动：（一）制备固定化酵母细胞 在缺水状态下，微生物处于休眠状态。在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。的过程。1g1g干酵母干酵母10mL10mL蒸馏水蒸馏水50mL50mL烧杯烧
8、杯搅拌均匀搅拌均匀放放置置1h1h，使之活化。，使之活化。思考活化是指什么？操作提示 酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。溢出容器外。 1. 酵母细胞的活化：2. 配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl0.83gCaCl2 2150mL150mL蒸馏水蒸馏水200mL200mL烧杯烧杯溶解备用。溶解备用。思考为什么要用蒸馏水，而不用自来水？防止自来水中各种离子影响实验结果操作提示配制配制CaClCaCl2 2时要用蒸馏
9、水；时要用蒸馏水；溶解物质要彻底。溶解物质要彻底。3. 配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠海藻酸钠10mL水水50mL烧杯烧杯酒精灯酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到蒸馏水定容到10mL。 加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。思考为什么要用小火或间断加热，并不断搅拌？防止海藻酸钠发生焦糊。防止海藻酸钠发生焦糊。操作提示429572439gao4. 海藻酸钠溶液和酵母细胞混合 将溶化好的海藻酸钠溶液将溶化好的海藻酸钠溶液冷却冷却至室温，加入至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分已活化的酵母细胞，进行充
10、分搅拌搅拌，再转移至，再转移至注射器中。注射器中。以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌思考为什么要将海藻酸钠冷却至室温？ 海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。操作提示429572439gao 以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaClCaCl2 2溶溶液中，将形成的凝胶珠在液中，将形成的凝胶珠在CaClCaCl2 2溶液中浸泡溶液中浸泡30min30min左右。左右。思考 CaCl2溶液有什么作用？
11、 使胶体聚沉，形成结构稳定的凝胶珠。使胶体聚沉，形成结构稳定的凝胶珠。操作提示 滴加注射器中的溶液时，注射器距液面一定距离，滴加注射器中的溶液时，注射器距液面一定距离，滴加速度一定要恒定且缓慢，以便形成的凝胶珠呈均滴加速度一定要恒定且缓慢，以便形成的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。匀的圆形或椭圆形。 刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一段时间，溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。以便形成稳定的结构。429572439gao429572439gao（二）用固定化酵母细胞发酵将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2 23 3次
12、。次。将将150ml150ml质量分数为质量分数为1010的葡萄糖溶液转移至的葡萄糖溶液转移至200ml200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于2525C C下发酵下发酵24h24h思考 1. 为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？洗去凝胶珠表面多余的洗去凝胶珠表面多余的CaClCaCl2 2溶液。溶液。以免对实验造成影响。以免对实验造成影响。思考 2. 葡萄糖在这里有什么用？既可以既可以作为发酵底物作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的，也作为酵母菌细胞的营养物质营养物质。429572439gao1. 海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。特别注意： 将很难
13、形成凝胶珠。将很难形成凝胶珠。高浓度海藻酸钠只能用粗针高浓度海藻酸钠只能用粗针头注射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓头注射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓度海藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形度海藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形或是椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容易破裂。或是椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容易破裂。 形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。因为因为包埋不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的包埋不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的凝胶珠可能带细丝尾巴。凝胶珠可能带细丝尾巴。如果浓度过低：如果浓度过高： 刚
14、形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。段时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法列方法: : 一是一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。表明凝胶珠的制作成功。 二是二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是
15、成功的。2. 酵母细胞的固定化（一）观察凝胶珠的颜色和形状五、结果分析与评价（二）观察发酵的葡萄糖溶液如果制作的如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色：凝胶珠颜色过浅、呈白色：说明海藻酸钠的浓度偏说明海藻酸钠的浓度偏低低，固定的酵母，固定的酵母细胞数目较少细胞数目较少；如果如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：说明海藻酸钠的浓度偏高。说明海藻酸钠的浓度偏高。二者都说明制作失败，需要再作尝试。二者都说明制作失败，需要再作尝试。 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味到产生了很多气泡，同时会闻到酒味思考 1.
16、 发酵过程中锥形瓶为什么要密封？酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。思考 2. 锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的。酵母菌进行无氧呼吸产生的。类型优点不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。对环境条件非常敏感，容易对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。物中，可能影响产品质量。固定化酶酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。一种酶只能催化一种化学反一种酶
17、只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。酶促反应才能得到的。固定化细胞成本低，操作更容易。固定后的酶或细胞与反应物固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应不容易接近，可能导致反应效果下降等。效果下降等。类型优点不足课堂检测:1. 制备固定化酵母细胞的过程中错误的（制备固定化酵母细胞的过程中错误的（ ）A. 取干酵母，加入蒸馏水，使其活化取干酵母，加入蒸馏水，使其活化B. 配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸钠溶化为止钠溶化为止C. 将溶化好的海藻酸钠溶液
18、冷却至室温，加入将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞已活化的酵母细胞D. 将凝胶珠在将凝胶珠在CaCl2 2溶液中浸泡溶液中浸泡30 min左右左右B2. 下列叙述不正确的是（下列叙述不正确的是（ ）A. 从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶容易容易B. 固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小C. 固定化细胞固定的是一种酶固定化细胞固定的是一种酶D. 将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细胞技术择固定化细胞技术C课堂检测:3.3.使用固定化细胞的优点是
19、使用固定化细胞的优点是( )( )。A.A.能催化大分子物质的水解能催化大分子物质的水解 B.B.可催化一系列化学反应可催化一系列化学反应C.C.与反应物易接近与反应物易接近 D.D.有利于酶在细胞外发挥作用有利于酶在细胞外发挥作用B课堂检测:4.4.酶的固定方法不包括酶的固定方法不包括( )( )。A. A. 将酶吸附在固体表面上将酶吸附在固体表面上 B B将酶相互连接起来将酶相互连接起来C C将酶包埋在细微网格里将酶包埋在细微网格里 D D将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶酶D课堂检测:5.5.下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( )( )。A A酶分子很小，易采用包埋法酶分子很小，易采用包埋法 B B酶分子很小，易采用化学结合或物理吸酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶附法固定的酶C C细胞个大，难被吸附或结合细胞个大，难被吸附或结合 D D细胞易采用包埋法固定细胞易采用包埋法固定A课堂检测:6.6.如果反应物是大分子物质，采用那种方法如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制催化受限制( )( )。A A直接使用酶直接使用酶 B B使用化学方法结合的酶使用化学方法结合的酶C C使用固定化细胞使用固定化细胞 D D使用物理吸附法固定的酶使用物理吸附法固定的酶C课堂检测:谢 谢
