1、第第15章章 流式细胞技术的原理和应用流式细胞技术的原理和应用陈鲤翔 副教授Email：流式细胞技术（流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。量分析和分选的技术。流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部起来的对
2、细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。速测量并可分类收集的高技术。30年代：设想使细胞检测自动化年代：设想使细胞检测自动化50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术1973年：第一台商用流式细胞仪年：第一台商用流式细胞仪FACS I发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提发展方向：荧光染料的开发、细
3、胞的制备方法、提高电子信号的处理能力等高电子信号的处理能力等流式细胞仪的发展史流式细胞仪的发展史BD公司流式细胞仪公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统超高速流式分选系统Gallios流式细胞仪流式细胞仪Beckman公司公司流式细胞仪流式细胞仪Navios流式细胞分析系统流式细胞分析系统 测量测量速度快，最快可在速度快，最快可在1 1秒钟内计测数万个细胞；秒钟内计测数万个细胞； 可可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内进行多参数测量，可以对同
4、一个细胞做有关物理（如大小、内部结构）、化学特性（如部结构）、化学特性（如DNADNA、RNARNA）的多参数测量，并具有明）的多参数测量，并具有明显的统计学意义；显的统计学意义； 是是一门综合性的高科技方法，它综合了一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术激光技术、计算机技术计算机技术、显微荧光光度技术显微荧光光度技术、分子生物学技术分子生物学技术、免疫学技术免疫学技术、流体力学流体力学、细胞化学细胞化学、图像技术图像技术等众多等众多领域的知识和成果；领域的知识和成果； 既是既是细胞分析技术，又是精确的分选技术细胞分析技术，又是精确的分选技术。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流
5、式细胞术的特点流式细胞术的特点应用应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药理学，遗传学及临床检验学等理学，遗传学及临床检验学等细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核核- -特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子, PH, PH值值, , 膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性 液流液流系统系统 光学光学系统系统 数据处理系统数据处理系统一、流式细胞技
6、术原理一、流式细胞技术原理1、流式细胞仪的基本结构：、流式细胞仪的基本结构： 由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成 待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染荧光染料标记的单抗对其染色色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统）液流系统Fluorescence
7、SignalFocused Laser BeamShealth Fluid液流系统示意图液流系统示意图Injector Tip样本管鞘液管 激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/ /短波长，通过短短波长，通过短/ /长波长长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：光电倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3,
8、FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统）光学系统光学系统示意图光学系统示意图 散射光的测定散射光的测定细胞在液柱中与激光束相交时向周围细胞在液柱中与激光束相交时向周围360360立体角方向立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为粒折射等有关，主要分为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。光信号的测定光信号的测定前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（
9、side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同
10、特征。线性放大器和对数放大器l荧光测定荧光测定l荧光补偿荧光补偿FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光荧光补偿补偿PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - % PE signalAf
11、ter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电l细胞分选 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液分选速度：单位时间内分选的细胞数量
12、。与悬液中细胞的含量成正比。中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。分选的技术要求分选的技术要求（3）数据处理系统）数据处理系统FS：反映颗粒的大
13、小：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少参数参数 单参数直方图单参数直方图 双参数点图、二维等高图双参数点图、二维等高图 三参数直方图三参数直方图 多参数分析多参数分析数据显示方式数据显示方式 由一维参数由一维参数(散射散射光或荧光光或荧光)与颗粒与颗粒计数计数(COUNT)构构成，反映同样散成，反映同样散射光或荧光强度射光或荧光强度的颗粒数量的多的颗粒数量的多少。少。单参数直方图单参数直方图双参数点图双参数点图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确
14、定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。二维等高图二维等高图三参数直方图三参数直方图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。多参数分析多参数分析 Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其
15、中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 门（门（Gate）设置）设置A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性粒细胞A、B、C均为任意门区阈（区阈（region, Rregion, R）与门）与门(gate, G ) (gate, G ) 是两个相关的概念，区是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。阈可与门对应，但是也可以包含于门。Region设置设置D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字门分析时，就可
16、以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。 样本制备：样本制备：单细胞悬液单细胞悬液 标记染色：标记染色：光谱不重叠光谱不重叠 阴性对照的阴性对照的设置：设置：检测检测标本的重复性标本的重复性 质量控制质量控制 二、流式细胞仪免疫分析的技术要求二、流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备：淋巴细胞分离液分离外周血外周血淋巴细胞样品的制备：淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。中单个核细胞。FicollFicoll，40kd40kd，高密度，低渗透压，无毒，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为性。（比重为1.01771.01770.0010.001的分层液的分层液) )样本制备
17、样本制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图。细胞分析的二维散色光点图。 培养细胞的样品培养细胞的样品制备：单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管制备：单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的吹打的方法使方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成制备成单细胞悬单细胞悬液。液。 新鲜实体组织单细胞悬液的新鲜实体组织单细胞悬液的制备制备u机械法：剪碎法、网搓法、研磨法机械法：剪碎法、网搓法
18、、研磨法。u酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。等。u化学试剂处理化学试剂处理法：法：EDTA、EGTA等。等。u表面活性剂处理表面活性剂处理法：法：Triton-x100、皂素等、皂素等。防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法：、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、冷乙醇、75%的甲醇。的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分
19、析不受影响。细胞表面荧光染色分析不受影响。单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存适用条件适用条件: : 有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数 对对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性常用的荧光染料与标记染色常用的荧光染料与标记染色FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞细胞悬液悬液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋
20、白类藻胆蛋白类几种常见的荧光染料几种常见的荧光染料名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PH敏敏感性感性特点特点异硫氰酸荧光素FITC488绿绿 525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texas red568红红 615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488别藻青蛋白APC633红红670能量传递复合染料PEcy5488红红670易不敏感减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在用化学法将两种不同激发波长的染料结合在
21、一起，在488nm488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料Laser488nmPECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白能量传递复合染料机制荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组合标记：免疫荧光标记免疫荧光标记FI
22、TC+PE 488 525 、575 绿色、橙色绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色绿色 568 615 红色红色FITC+PeCy5 488 525、 675 绿色、绿色、 红色红色FITC+ ECD 488 525、 625 绿色、橙红色绿色、橙红色F+P +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、绿、橙、红色红色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 绿、绿、 橙红色、橙红色、红色红色F+P+APC 488 525 、 575 绿色、橙色绿色、橙色 633 670 红色红色荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm) 发射波长（发射波长（n
23、m) 颜色颜色双或多参数荧光抗体的组合标记双或多参数荧光抗体的组合标记 适当的制备方式适当的制备方式 处理红细胞处理红细胞 实体组织来源标本用机械法实体组织来源标本用机械法 温度温度25-3725-37，PH7.0-7.2PH7.0-7.2质量控制质量控制单细胞悬液制备的质控单细胞悬液制备的质控免疫荧光染色的质控免疫荧光染色的质控 温度温度 PHPH 染料浓度染料浓度 固定剂固定剂 光路与流路校正光路与流路校正: : 确保激光光路与样品流处于正交状确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（态，减少变异（CVCV）。）。 PMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准: : 保证样品检测时仪
24、器处于保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准绝对计数校准: : 保证计数的准确性。保证计数的准确性。仪器操作的质控仪器操作的质控同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标未标记单抗记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制全程质量控制：在：在流式检测中，样品标记、溶血流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、洗涤、仪器质、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接量控制和上机检测的过程都会直接影响影响检测结果。采用标准质控检测结果。采用标准质控样品来进行
25、全程质控样品来进行全程质控，使得，使得同类实验室建立质控比对，数据可以同类实验室建立质控比对，数据可以互用。互用。免疫检测的质控免疫检测的质控三、流式细胞技术应用三、流式细胞技术应用以细胞免疫功能测定为例以细胞免疫功能测定为例 淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群 活化的活化的T T淋巴细胞淋巴细胞 抗原特异性免疫细胞抗原特异性免疫细胞 调控性调控性T T细胞细胞 树突状细胞树突状细胞 先天免疫细胞先天免疫细胞淋巴细胞亚群T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)名名 称称功功 能能辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th
26、)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8- 有调节功能的T细胞,其表达 / T细胞受体(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+ 记忆性T淋巴细胞 病菌感染时升高,
27、 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群活化活化T淋巴细胞淋巴细胞名名 称称功功 能能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+ 活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味着HIV患者的预后较差CD19+CD23+ 活化的B细胞过敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD
28、5+CD23+ 慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞 自身免疫性疾病时降低, 而病毒感染时升高 CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆 Th1Th2细胞因子分泌细胞测定细胞因子分泌细胞测定根据产生的细胞因子的类型和生根据产生的细胞因子的类型和生物学功能物学功能,人的人的4+细胞可以分为细胞可以分为1、21细胞产生细胞产生 2、 12、 、 等细胞因子等细胞因子,主要参与细主要参与细胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应,并在清除病毒等细胞内致病因子方面并在清除病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用起着重要作用2细胞分泌细胞分泌 4、 5、 6、 10、 13
29、等细胞因子等细胞因子,主要促进主要促进体液免疫反应体液免疫反应,中和胞外病原体中和胞外病原体相应地，相应地，CD8+T细胞也可以分为细胞也可以分为Tc1和和Tc2Th1细胞：介导细胞免疫、细细胞：介导细胞免疫、细胞毒性胞毒性T细胞的细胞的生长和活化、生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损炎等的发病和免疫病理损伤。伤。Th2细胞细胞 ：介导体液免疫，促：介导体液免疫，促进进B细胞的生
30、长、活化和分细胞的生长、活化和分化，是化，是IgG1和和IgE类抗体的类抗体的转换因子，其功能亢进将转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参导致特异性过敏反应，参与高与高IgE综合症和嗜酸性粒综合症和嗜酸性粒细胞增多症。细胞增多症。淋巴细胞亚群数量检查项目和意义淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病疾病CD3CD3CD4CD4CD8CD8CD4/CD8CD4/CD8NKNK自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低AIDSAIDS降低降低严重严重降低降低增高增高降低降低SARSSARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝慢性活动性肝炎、肝硬化硬化降低降低正常正常或或增高增高降低降低降低降低肿瘤肿瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低THANK YOU
