1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )目的基因主要是目的基因主要是_,_,也可是一些具有调控作用的因子。目的基因的获也可是一些具有调控作用的因子。目的基因的获取方法主要有取方法主要有_和和_两大两大类类编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因（二）获取目的基因的常用方法有哪些（二）获取目的基因的常用方
2、法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成法（反转录法和化学合成法）、人工合成法（反转录法和化学合成法）如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因等。基因、与工业用酶相关的基因等。直接分离法直接分离法人工合成法人工合成法1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因（1 1）基因文库）基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不
3、同基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。同基因，称为基因文库。种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNAcDNA文库文库1、原核细胞基因结构：、原核细胞基因结构：基因基因非编码区：非编码区：非编码区：非编码区：调控序列调控序列编码区：编码区：编码蛋白质编码蛋白质终止子：终止子：终止转录终止转录启动子：启动转录启动子：启动转录，RNARNA聚
4、合酶结合识别位点聚合酶结合识别位点mRNAmRNA翻译翻译特定功能的蛋白质特定功能的蛋白质转录转录特点：特点： 编码区是连续的，非编码区起调控作用编码区是连续的，非编码区起调控作用DNADNA分子分子2：真核细胞基因结构：真核细胞基因结构：基因基因非编码区：非编码区：非编码区：非编码区：编码区：编码区：编码蛋白质编码蛋白质终止子终止子启动子启动子前体前体mmRNARNA外显子和内含子都转录外显子和内含子都转录特点：特点：编码区间隔不连续！分为编码区间隔不连续！分为内含子内含子和和外显子外显子。编码蛋白质编码蛋白质不编码蛋白质不编码蛋白质剪切掉内含子转录的部分剪切掉内含子转录的部分mRNAmRN
5、ADNADNA分子分子提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA适当的限制酶适当的限制酶一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组重组DNADNA分子分子基因组文库基因组文库导入受体菌导入受体菌（2 2）基因文库的构建方法）基因文库的构建方法基因组文库的构建基因组文库的构建有启动子和内含子有启动子和内含子提取某生物提取某生物特定发育时期特定发育时期的的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌导入受体菌 cD
6、NA文库的构建文库的构建-逆逆转转录法：录法： 部分基因：基因部分基因：基因的选择性表达的选择性表达无启动子和内含子无启动子和内含子 真核生物的基因用逆转录法得到真核生物的基因用逆转录法得到的的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？原核生物基因呢？思考？思考？真核生物：无非编码区和内含子真核生物：无非编码区和内含子原核生物：无非编码区原核生物：无非编码区（3 3）构建基因文库的目的）构建基因文库的目的 怎样从基因文库中得到我们所怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢需的目的基因呢? ? 便于在便于在不知道目的基不知道目的基因核苷酸序因核苷酸序列列的情
7、况下，获得所需的目的基因。的情况下，获得所需的目的基因。依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法）从基因文库中得到目的基因的方法2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 原理：原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式
8、反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制前提前提_一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模的作用下，合成与模板互补的板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链
9、d.重复重复a.b.ca.b.c步骤步骤：每：每重复重复一次，目的基因增加一次，目的基因增加_倍倍一一：以：以_方式扩增，方式扩增， 指数指数方式：方式：条件：条件：模板模板DNADNA（含目的基因）（含目的基因）四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸1 1对引物对引物热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶酶) )一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列过程：过程：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测3 3、人工合成法、人工合成法基因较小，核苷酸序
10、列已知（化学合成法）基因较小，核苷酸序列已知（化学合成法） 化学法合成的目化学法合成的目的基因含的基因含内含子、启内含子、启动子和终止子动子和终止子吗？吗？需要模板吗？需要模板吗？逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性
11、末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程: :3 3、基因表达载体的组成？、基因表达载体的组成？使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以，并且可以遗传遗传给下一代给下一代使目的基因能够使目的基因能够表达和发挥作用表达和发挥作用2 2、基因表达载体基因表达载体构建的目的构建的目的？（？（P162P162）目的基因必须在启动子与终止子之间目的基因必须在启动子与终止子之间目的基因目的基因启动子：启动子： 基因的首端，基因的首端，RNARNA聚合酶识别聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转和结合的部位，驱动基因转
12、录出录出mRNAmRNA终止子：终止子： 基因的尾端，基因的尾端， 终止转录终止转录标记基因：标记基因：鉴别受体细胞中是否含有鉴别受体细胞中是否含有目的基因目的基因思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流
13、，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确
14、定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因
15、和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意第三步：第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导将目的基因导入植物细胞入植物细胞将目的基因导将目的基因导入动物细胞入动物细胞将目的基因导将目的基因导入微生物细胞入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微
16、注射法目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细内，并且在受体细胞内维持胞内维持_和和_的过程的过程CaCa2+2+处理法处理法1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点: :能感染双子叶植物和祼子植物能感染双子叶植物和祼子植物, ,对对大多数单子叶植物无感染能力大多数单子叶植物无感染能力TiTi质粒的质粒的T TDNADNA可转移至受体可转移至受体细胞并整合到其染色体上细胞并整合到其染色体上转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基目的基因因构建构建基基因因表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞整合整合植物细胞植物细胞染色体染色体DNAD
17、NA上上表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2 2）基因枪法基因枪法微弹轰击法微弹轰击法特点：成本高特点：成本高（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法: :显微注射技
18、术显微注射技术操作程序操作程序: :提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射早期胚胎早期胚胎新性状动物新性状动物早期胚胎培养技术早期胚胎培养技术输卵管或子宫输卵管或子宫胚胎移植技术胚胎移植技术受体细胞？原因？受体细胞？原因？受体细胞：受精卵受体细胞：受精卵 受精卵的全能性高受精卵的全能性高一定是体内受精吗？一定是体内受精吗？不，可以体内受精不，可以体内受精也可体外受精也可体外受精3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：常用菌常用菌：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：过程：过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态
19、感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNACaCa2+2+处理法处理法大肠杆菌大肠杆菌繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少CaCa2+2+ 改变细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收改变细胞膜的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中周围环境中DNADNA分子的生理状态分子的生理状态植物基因植物基因工程工程动物基因动物基因工程工程微生物基微生物基因工程因工程常用方法常用方法受体细胞受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转农杆菌转化法化法显微注显微注射法射法Ca2+处处理法
20、理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便结构简单、操作方便 B繁殖速度快繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌大肠杆菌 枯草杆菌枯草杆菌 支原体支原体 动植物细胞动植物细胞A B C DBD3、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基
21、因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C抗虫鉴定抗虫鉴定 抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等（一）分子水平检测（一）分子水平检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因，上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。DNADNA分子分子杂交杂交技术技术 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种
22、生物的DNADNA分子的单分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。的单链。 探针：用放射性同位素标记的含有目的基因的探针：用放射性同位素标记的含有目的基因的DNADNA片段片段 （二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA，这是检测目的基，这是检测目的基因是
23、否发挥功能作用的第一步。因是否发挥功能作用的第一步。3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分子杂交技术分子杂交技术方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程: :用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA如抗虫棉：让棉铃虫啃食棉铃，看其是否死亡如抗虫棉：让棉铃虫啃食棉铃，看其是否死亡目的基因表达成功的标志目的基因表达成功的标志： 通过转录、翻译产生相应的蛋白质。通过转录
24、、翻译产生相应的蛋白质。基因工程成功的标志基因工程成功的标志: : 生物个体表现出特定的性状生物个体表现出特定的性状练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）练
25、习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。水稻新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用 技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定
26、耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交作探针进行分子杂交检测，又要用检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。的耐盐性。（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到类胰岛素，这一过程涉及到A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性分子是否导入受
27、体细菌内并表达出性状状D.筛选出能产生胰岛素的筛选出能产生胰岛素的“工程菌工程菌” 培养培养培养培养培养培养导入导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完全培养基的完全培养基含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆两种培养基均不能生长大肠杆菌菌 Ca2+ 处理细胞处理细胞形成感受态细胞形成感受态细胞检测检测（培养不具有氨苄青霉素（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素只有氨苄青霉素抗性基因质粒抗性基因质粒只具有氨苄青霉素只具有氨苄青
28、霉素抗性基因大肠杆菌抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉不具有氨苄青霉素素 抗性基因和抗性基因和四环素抗性积基四环素抗性积基因的大肠杆菌因的大肠杆菌完全培养基完全培养基导入导入接种培养接种培养接种培养接种培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大肠杆菌不含大肠杆菌不含抗四环素基因抗四环素基因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明： 大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因存活存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活存活导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大肠杆菌不含大肠杆菌不含抗四环素基因抗四环素基因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大肠杆菌含抗大肠杆菌含抗四环素基因四环素基因证明：证明： 大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因完全培养基完全培养基存活存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？
