1、 嘌呤核苷酸的合成 嘧啶核苷酸的合成 脱氧核糖核苷酸的生成 核酸的分解代谢 DNA的复制l作为核酸合成的原料，是核酸的基本组成单位； l体内能量的利用形式，ATP是重要能量货币； l参与代谢和生理调节，cAMP是第二信使； l组成辅酶，如NAD、 FAD、 CoA等； l活化中间代谢物，其衍生物是许多生化反应的中间供体 ，如UDPG 、SAM等。 肝肝 主要途径主要途径 ( (de novo synthesis pathway) ) 脑脑 、骨髓等，也很重要。骨髓等，也很重要。 ( (salvage synthesis pathway) )核糖、氨基酸、核糖、氨基酸、CO2、一碳单位、一碳单位
2、核糖核苷酸核糖核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸辅酶辅酶RNA核苷核苷碱基碱基脱氧核苷脱氧核苷DNA指利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及二指利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及二氧化碳等物质为原料，经过一系列酶促反应，氧化碳等物质为原料，经过一系列酶促反应，合成嘌呤核苷酸的途径，合成嘌呤核苷酸的途径， 不经过碱基和核苷的不经过碱基和核苷的阶段。阶段。 主要器官是主要器官是肝，肝，其次是其次是小肠和胸腺小肠和胸腺，而，而脑、脑、骨髓骨髓则无法进行此途径。则无法进行此途径。1.定义定义2.合成部位合成部位 IMP的合成的合成 AMP和和GMP的生成的生成 ATP和和GTP的生成的生成CO2天冬氨酸天冬氨酸甲酰基
3、甲酰基（一碳单位）（一碳单位）甘氨酸甘氨酸甲酰基甲酰基（一碳单位）（一碳单位）谷氨酰胺谷氨酰胺（酰胺基）（酰胺基）两个阶段两个阶段 5-5-磷酸核糖磷酸核糖 次黄嘌呤核苷酸次黄嘌呤核苷酸（IMPIMP） IMP AMPIMP AMPGMPGMPR-5-P（5-磷酸核糖）磷酸核糖）ATPAMPPRPP合成酶合成酶PP-1-R-5-P（磷酸核糖焦磷酸）（磷酸核糖焦磷酸）在谷氨酰胺、甘氨酸、在谷氨酰胺、甘氨酸、一碳单位、二氧化碳及一碳单位、二氧化碳及天冬氨酸的逐步参与下天冬氨酸的逐步参与下IMP AMP GMPH2N-1-R-5 -P（5 -磷酸核糖胺）磷酸核糖胺）谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸酰胺转
4、移酶酰胺转移酶5-磷酸核糖磷酸核糖 次黄嘌呤核苷酸（次黄嘌呤核苷酸（IMP）OHCH2OHOHOOP-OOO-+ATPOCH2OHOHOOP-OOO-POO-OPOO-O-+AMP D-ribose-5-phosphateRibosephosphatepyrophosphokinase5-Phospho- D-ribosyl-1-pyrophosphate (PRPP)磷酸核糖磷酸核糖焦焦磷酸激酶磷酸激酶5-5-磷酸核糖焦磷酸核糖焦磷酸（磷酸（PRPPPRPP）5-磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸焦磷酸转酰转酰氨酶氨酶5-磷酸核糖胺磷酸核糖胺合合成成酶酶甘氨酰胺核苷酸甘氨酰胺核苷酸甘氨酰胺核苷酸甘氨酰胺
5、核苷酸转甲酰转甲酰基酶基酶甲酰甘氨酰甲酰甘氨酰胺核苷酸胺核苷酸合成酶合成酶甲酰甘氨咪甲酰甘氨咪核苷酸核苷酸5-氨基咪氨基咪唑核苷酸唑核苷酸合成酶合成酶甲酰甘氨咪核苷酸甲酰甘氨咪核苷酸羧化酶羧化酶5-氨基咪唑氨基咪唑-4-羧酸核苷酸羧酸核苷酸合成酶合成酶5-氨基咪唑氨基咪唑-4-(N-琥珀琥珀基基)氨甲酰氨甲酰核苷酸核苷酸裂解酶裂解酶5-氨基咪唑氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸氨甲酰核苷酸转甲酰基酶转甲酰基酶5-甲酰胺基甲酰胺基咪唑咪唑-4-氨甲氨甲酰核苷酸酰核苷酸水解酶水解酶次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸核苷酸5-磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸焦磷酸磷酸核磷酸核糖焦磷糖焦磷酸转酰酸转酰氨酶氨酶5-磷酸核磷酸核糖胺糖
6、胺甘氨酰胺甘氨酰胺核苷酸核苷酸甘氨酰甘氨酰胺核苷胺核苷酸转甲酸转甲酰基酶酰基酶甲酰甘氨酰甲酰甘氨酰胺核苷酸胺核苷酸甲酰甘氨酰甲酰甘氨酰胺核苷酸胺核苷酸甲酰甘氨咪甲酰甘氨咪核苷酸核苷酸甲酰甘氨咪核苷甲酰甘氨咪核苷酸酸5-氨基咪唑核氨基咪唑核苷酸苷酸氨基咪唑氨基咪唑核苷酸合核苷酸合成酶成酶N5-羧基氨基咪唑核苷羧基氨基咪唑核苷酸酸氨基氨基咪唑咪唑羧化羧化酶酶5-氨基咪唑核氨基咪唑核苷酸苷酸5-氨基咪唑氨基咪唑-4-羧酸羧酸核苷酸核苷酸N5-羧基氨基咪唑核苷酸羧基氨基咪唑核苷酸5-氨基咪唑氨基咪唑-4-羧酸羧酸核苷酸核苷酸合成合成酶酶5-氨基咪唑氨基咪唑-4-(N-琥珀琥珀基基)氨甲酰核苷酸氨甲酰核
7、苷酸5-氨基咪唑氨基咪唑-4-(N-琥珀基琥珀基)氨甲酰核苷酸氨甲酰核苷酸裂解裂解酶酶5-氨基咪唑氨基咪唑-4-氨甲酰核氨甲酰核苷酸苷酸5-氨基咪唑氨基咪唑-4-氨甲酰核氨甲酰核苷酸苷酸转甲酰转甲酰基酶基酶5-甲酰胺基咪唑甲酰胺基咪唑-4-氨甲酰核氨甲酰核苷酸苷酸5-甲酰胺基咪唑甲酰胺基咪唑-4-氨甲氨甲酰核苷酸酰核苷酸水解水解酶酶次黄嘌呤核苷酸次黄嘌呤核苷酸（IMP）腺苷酸代琥珀酸合成酶腺苷酸代琥珀酸合成酶 IMP脱氢酶脱氢酶腺苷酸代琥珀酸裂解酶腺苷酸代琥珀酸裂解酶 GMP合成酶合成酶AMPADPATPADPATP腺苷激酶腺苷激酶ADPATP激酶激酶GMPGDPGTPADPATP鸟苷激酶鸟苷
8、激酶ADPATP激酶激酶l嘌呤核苷酸是在磷酸核糖分子上逐步合成的；嘌呤核苷酸是在磷酸核糖分子上逐步合成的；l形成的第一个核苷酸是次黄嘌呤核苷酸形成的第一个核苷酸是次黄嘌呤核苷酸(IMP)；lIMP的合成需的合成需5个高能磷酸键；个高能磷酸键；lAMP或或GMP的合成又各需的合成又各需1个个ATP。利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简单的反应，利用腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄单的反应，利用腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，合成嘌呤核苷酸嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，合成嘌呤核苷酸的过程，称为补救合成（或重新利用）途径。的过程，称为补救合成（或重新利
9、用）途径。1.1.定义定义腺嘌呤磷酸核糖转移酶腺嘌呤磷酸核糖转移酶( (adenine phosphoribosyl transferase, APRT) )次黄嘌呤次黄嘌呤- -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶( (hypoxanthine- guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT) )2.2.参与补救合成途径的酶参与补救合成途径的酶腺嘌呤腺嘌呤 + + PRPPAMP + PPiAPRT次黄嘌呤次黄嘌呤 + + PRPPIMP + PPiHGPRT鸟嘌呤鸟嘌呤 + + PRPPHGPRTGMP + PPi3.3.合成过程合成过程腺嘌呤核苷
10、腺嘌呤核苷腺苷激酶腺苷激酶ATPADPAMP4.4.补救合成的生理意义补救合成的生理意义l 补救合成途径可以节省从头合成途径时补救合成途径可以节省从头合成途径时所需的能量和一些氨基酸的消耗。所需的能量和一些氨基酸的消耗。l 体内某些组织器官，如脑、骨髓等只能体内某些组织器官，如脑、骨髓等只能进行补救合成。进行补救合成。一、嘧啶核苷酸的补救合成途径一、嘧啶核苷酸的补救合成途径嘧啶嘧啶 + + PRPP嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸 + + PPi嘧啶磷酸核糖转移酶嘧啶磷酸核糖转移酶尿嘧啶核苷尿嘧啶核苷 + + ATP尿苷激酶尿苷激酶UMP +ADP 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 + + ATP胸苷激酶胸苷激酶
11、TMP +ADP嘧啶核苷酸的结构嘧啶核苷酸的结构二、嘧啶核苷酸的从头合成途径二、嘧啶核苷酸的从头合成途径主要是肝细胞胞液主要是肝细胞胞液指利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及指利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及二氧化碳等物质为原料，经过一系列酶促反二氧化碳等物质为原料，经过一系列酶促反应，不经过碱基和核苷的阶段，直接合成嘧应，不经过碱基和核苷的阶段，直接合成嘧啶核苷酸的途径。啶核苷酸的途径。 1.定义定义 2.合成部位合成部位3. 嘧啶环上各原子的来源嘧啶环上各原子的来源氨甲酰氨甲酰 磷酸磷酸天冬氨酸天冬氨酸4. 4.合成过程合成过程合成原料：合成原料： 谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、CO
12、CO2 2、磷酸核糖。、磷酸核糖。 合成特点：合成特点： （1 1）用原料先合成嘧啶环；）用原料先合成嘧啶环； （2 2）再与磷酸核糖连接生成嘧啶核苷酸；）再与磷酸核糖连接生成嘧啶核苷酸； （3 3）合成的第一个核苷酸是乳清酸核苷酸；）合成的第一个核苷酸是乳清酸核苷酸； （4 4）乳清酸核苷酸再转变为）乳清酸核苷酸再转变为UMPUMP。5. 5. 尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的合成尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的合成ATPADP尿苷酸激酶尿苷酸激酶UDP二磷酸核苷激酶二磷酸核苷激酶ATPADPUTPCTP合成酶合成酶谷氨酰胺谷氨酰胺ATP谷氨酸谷氨酸ADP+Pi脱氧核苷酸的生成脱氧核苷酸的生成在核苷
13、二磷酸水平上生成在核苷二磷酸水平上生成TMP合酶合酶N5, N10-甲烯甲烯FH4FH2FH2还原酶还原酶FH4NADP+NADPH+H+dUMPdTMPdTMP的生成的生成嘌呤核苷酸的抗代谢物是一些嘌呤、氨基酸或嘌呤核苷酸的抗代谢物是一些嘌呤、氨基酸或叶酸等的类似物。叶酸等的类似物。嘌呤类似物嘌呤类似物氨基酸类似物氨基酸类似物叶酸类似物叶酸类似物6- 6-巯基嘌呤巯基嘌呤6- 6-巯基鸟嘌呤巯基鸟嘌呤8- 8-氮杂鸟嘌呤等氮杂鸟嘌呤等氮杂丝氨酸氮杂丝氨酸等等氨基蝶呤氨基蝶呤氨甲蝶呤氨甲蝶呤等等次黄嘌呤次黄嘌呤(H)6-巯基嘌呤巯基嘌呤(6-MP)6-巯基嘌呤的结巯基嘌呤的结构构 氨基蝶呤和氨
14、甲蝶呤（叶酸拮抗物）在癌症治氨基蝶呤和氨甲蝶呤（叶酸拮抗物）在癌症治 疗中的应用原理（如何影响核酸合成）？疗中的应用原理（如何影响核酸合成）？ 二者都是叶酸的类似物，竞争性地抑制由叶酸转化为二氢叶酸和四氢叶酸时的二氢叶酸还原酶的活性，使叶酸无法有效地转变为二氢叶酸和四氢叶酸； 影响嘌呤和嘧啶核苷酸合成中一碳单位的转移，减少脱氧胸苷酸的合成，使快速分化的癌细胞由于缺乏dTMP而不能合成DNA，达到使细胞死亡的目的。嘧啶类似物嘧啶类似物胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶(5-FU)5-F-尿嘧啶的抗癌原理尿嘧啶的抗癌原理 5-F-尿嘧啶是胸腺嘧啶核苷酸合成酶的抑制剂； 在体内转化为相应的核
15、苷一磷酸和核苷三磷酸后，它可以与酶上的SH基结合，再与四氢叶酸形成三元复合物； 酶不能去除F，而干扰了脱氧尿嘧啶的甲基化，进而不能合成dTMP，也就使快速分化的癌细胞由于缺乏dTMP而不能合成DNA，达到使癌细胞死亡的目的。 食物核蛋白食物核蛋白蛋白质蛋白质核酸（核酸（RNA及及DNA）胃酸胃酸核苷酸核苷酸胰核酸酶胰核酸酶核苷核苷磷酸磷酸胰、肠核苷酸酶胰、肠核苷酸酶碱基碱基戊糖戊糖核苷酶核苷酶指所有可以水解核酸的酶。指所有可以水解核酸的酶。 依据底物不同分类依据底物不同分类nDNA酶酶(deoxyribonuclease, DNase)：专一降解专一降解DNA的酶。的酶。nRNA酶酶 (rib
16、onuclease, RNase)：专一降解专一降解RNA的酶。的酶。 依据切割部位不同依据切割部位不同n核酸内切酶核酸内切酶：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 非限制性核酸内切酶非限制性核酸内切酶n核酸外切酶核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切酶核酸外切酶外切核酸酶对核酸的水解位点外切核酸酶对核酸的水解位点5 p p p pOHB p p p p3 BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶（ 5 5 端外切端外切5 5得得3 3）蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶（ 3 3 端外切端外切3 3得得5 5）内切核酸酶对内切核酸酶对RNA的水解的水解位点位点5 p p p pOHPyPuPyPy
17、1 p p pGACU p p pGA3 RNAase IRNAase IRNAase T1RNAase T1Pu ：嘌呤嘌呤 Py：嘧啶：嘧啶 实际上就是碱基的分解代谢实际上就是碱基的分解代谢 人类嘌呤碱的最终人类嘌呤碱的最终代谢产物代谢产物AMPAMPGMPGMPH H（次黄嘌呤）（次黄嘌呤）G GX X（黄嘌呤）（黄嘌呤）黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤黄嘌呤氧化酶氧化酶一、嘌呤核苷酸的分解一、嘌呤核苷酸的分解人类和排尿酸动物尿酸为终产物其它哺乳动物尿囊素鱼类、两栖类尿囊酸无脊椎动物、甲壳类NH3+CO2痛风痛风与嘌呤代谢平衡发生障碍有关，其基本生化特征是高尿酸血症，由于尿酸的溶解度很低，
18、尿酸以钠盐或钾盐的形式沉积于软组织及关节等处，形成尿酸结石或关节炎。二、嘧啶核苷酸的分解二、嘧啶核苷酸的分解嘧啶碱嘧啶碱1-磷酸核糖磷酸核糖嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸核苷核苷 核苷酸酶核苷酸酶PPi核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶胞嘧啶胞嘧啶NH3尿嘧啶尿嘧啶二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶 H2OCO2 + NH3-丙氨酸丙氨酸胸腺嘧啶胸腺嘧啶-脲基异丁酸脲基异丁酸-氨基异丁酸氨基异丁酸H2O丙二酸单酰丙二酸单酰CoA乙酰乙酰CoATCA肝肝尿素尿素甲基丙二酸单酰甲基丙二酸单酰CoA琥珀酰琥珀酰CoATCA糖异生糖异生NNHONH2HNNHOOHNNHOOH2NCONHCH2CH2COOHNH3+CO2+H2NCH2
19、CH2COOHHNNHOOCH3HNNHOOCH3H2NCONHCH2CHCOOH+H2O-NH3NAD(P)H+H+NAD(P)+NAD(P)H+H+NAD(P)+H2OH2Oabd+H2OccbH2OdNH3+CO2+ H2NCH2CHCOOHCH3CH3胞嘧啶尿嘧啶二氢尿嘧啶胸腺嘧啶二氢胸腺嘧啶-脲基异丁酸-脲基丙酸-丙氨酸-氨基异丁酸图13-6 嘧啶碱的分解代谢 Watson和和Crick在提出在提出DNA双螺旋结构之后，双螺旋结构之后，又提出了又提出了DNA复制的假说：复制的假说：DNA半保留复制半保留复制模型；模型； 1958年，年，Meselson米西尔森和米西尔森和Stanl斯
20、坦尔采斯坦尔采用含用含15N重同位素的重同位素的NH4Cl培养大肠杆菌，放在正培养大肠杆菌，放在正常的培养液里繁殖，然后用梯度离心技术测定分常的培养液里繁殖，然后用梯度离心技术测定分裂时裂时DNA复制时的密度变化，证实了复制时的密度变化，证实了DNA的的半保半保留复制留复制。实验结论：实验结论：DNA的复制是以半保留的方式进行的复制是以半保留的方式进行指在DNA聚合酶的作用下，以一个亲代DNA分子的两条链为模板，合成两个结构上完全相同的子代DNA分子的过程。 体细胞有丝分裂的体细胞有丝分裂的间期间期、有性生殖细胞减、有性生殖细胞减数分裂第一次分裂的数分裂第一次分裂的间期间期。1. 破坏氢键，打
21、开破坏氢键，打开DNA双链双链2. 游离核苷酸与母链碱基互补配对游离核苷酸与母链碱基互补配对3. 配对的游离核苷酸联结为子链配对的游离核苷酸联结为子链4. 子链与模板母链盘绕成双螺旋结构子链与模板母链盘绕成双螺旋结构 DNA分子利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，使得DNA双链的氢键断裂，这样使得螺旋结构的DNA双链解开。 以解开的每段DNA链（母链）为模板，以周围环境中游离的脱氧核苷酸为原料，在相关酶的作用下，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链。 复制出来的子代DNA分子，通过细胞的分裂，被分配到子代细胞中。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。 1.
22、 模板：模板： 解旋的解旋的DNA分子；分子；2. 原料：原料： 细胞中游离的脱氧核苷酸细胞中游离的脱氧核苷酸3. 能量：能量：ATP 4. 酶：解旋酶、聚合酶等酶：解旋酶、聚合酶等可以进行人工模拟复制可以进行人工模拟复制1. DNA分子是分子是边解旋边复制边解旋边复制的；的；2. 半保留复制半保留复制； 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。双向复制双向复制
23、DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制。由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。5以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为(lagging strand)。 由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时
24、，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。 在引物的3端按53方向连续不断地合成的DNA链。在引物的3端按53方向不连续合成的DNA链。随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物） 以四种脱氧核糖核酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。 DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。 通过通过DNA分子的复制，把亲代的遗传信分子的复制，把亲代的遗传信息传给子代，从而使得前后代保持了一定的息传给子代，从而使得前后代保持了一定的连
25、续性。连续性。 1. DNA分子具有独特的双螺旋结构；分子具有独特的双螺旋结构； 2. 连接两条链的碱基有互补配对能力。连接两条链的碱基有互补配对能力。 DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。 DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。 DNA的复制、转录和翻译过程构成了遗传学的中心法则。 不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一
26、溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。复性复性RNADNA是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中存在的特定基因。将生物大分子物质，核酸或蛋白质进行凝胶电泳分离成若干条带后，转移（印迹）到固化介质（常用NC膜、尼龙膜）上，再与探针进行杂交的反应。 DNA印迹印迹 (Southern Blot)：用于基因组特异基因的定位及检测，重组质粒和
27、噬菌体的分析。 RNA印迹印迹 (Northern Blot)：用于RNA的定性分析，比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况。 蛋白质的印迹蛋白质的印迹 (Western Blot)：用于蛋白质定性,半定量及蛋白质相互作用研究。 其他：其他：斑点印迹 (dot blotting) 、原位杂交 (in situ hybridization)、DNA芯片技术 (DNA chip)1 1、概念：、概念： 将经凝胶电泳分离的将经凝胶电泳分离的DNADNA片段转移到合片段转移到合适的固相支持物上，再通过特异性探针的杂适的固相支持物上，再通过特异性探针的杂交检测被转移的交检测被转移的DNADNA片段的一种
28、方法。片段的一种方法。 这是这是由由 E.SouthernE.Southern于于19751975年首先设计应用的，因而年首先设计应用的，因而以其姓氏命名。以其姓氏命名。2 2、基本过程：、基本过程：（1）用限制性内切酶消化DNA样品（2）通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段按小分离（3）将含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性（4）使胶中的DNA分子转移到固相支持物 （NC膜或尼龙膜）上（5）在80真空条件下加热或在紫外交联仪内 处理使DNA固定于膜上（6）3 3、应用：、应用：用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。1 1、概念：、概念：利用与利用与DN
29、ADNA印迹相类似的技术分析印迹相类似的技术分析RNARNA就称为就称为RNA blotRNA blot。RNARNA印迹技术正好与印迹技术正好与DNADNA相对应，故被称为相对应，故被称为Northern blotNorthern blot。2 2、基本过程：、基本过程： 与Southern Blot相似，但有以下不同：RNA分子较小，在转移前无需进行限制性内切酶切割变性RNA的转移效率比较高 3 3、应用：、应用：（1）检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平（2）比较不同组织和细胞中的同一基因的 表达情况1 1、概念：、概念：蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再
30、与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。相对于DNA的Southern Blot和RNA的Southern Blot，蛋白质印迹被称为Western Blot。2 2、基本过程：、基本过程： 一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。 最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。 蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。 前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。 封闭
31、可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。 现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛奶中可能含有要用Westem印迹法检测的蛋白质时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。 特异性抗体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分子结合.碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或放射性核素标记的二抗与之反应。 二抗需根据一抗进行选择。 用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度.放放射射自自显显影影照照片片3 3、应用：、应用：（1 1）检测样品中特异蛋白质的存在）检测样品中特异蛋白质的
32、存在（2 2）细胞中特异蛋白质的半定量分析）细胞中特异蛋白质的半定量分析（3 3）蛋白质分子的相互作用研究）蛋白质分子的相互作用研究l能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。l PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。 。http:/“I do my best thinking “I do my best thinking while driving”wh
33、ile driving”1993 Nobel prize 在体外对目的DNA进行大量扩增的技术，当目的DNA加热变性时，使其成为单链，与一对特异性引物在退火时进行杂交，在耐热的DNA聚合酶作用下进行反应，并循环进行几十次，使目的DNA得到大量的扩增。基本理论建立在DNA变性、复性及分子杂交的基础之上。 单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在一百万倍以上，即可将极微量(pg级)DNA，扩增到紫外光下可见的水平(g级)。 它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。 PCR扩增的特异性依赖于两个引物设计的特异性， 依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火的温度对特异性
34、也有影响. 在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜，采用高温启动法PCR 扩增的特异性是相当高的。 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。 模板模板DNADNA 特异引物特异引物 底物底物dNTPdNTP 耐热性耐热性DNADNA聚合酶（如聚合酶（如TaqDNATaqDNA聚合酶）聚合酶） Mg2+Mg2+缓冲液缓冲液 thr
35、ee steps:three steps:DenaturationDenaturation ( (变性变性): 90): 909797AnnealingAnnealing ( (退火退火): 45): 455555ExtensionExtension ( (延伸延伸): ): aroundaround 7272将反应体系加热至90-97，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。当温度突然降低至45-65,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。将温度升高至70-74下，在Taq DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿
36、着模板DNA延伸。 以上三个步骤构成一个循环，新合成的以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（续作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530）次即）次即可达到扩增可达到扩增DNA片段的目的。片段的目的。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。5 5 Essential ComponentsEssential Components of of PCR ReactionPCR Reaction salts (ions)
