1、1第一节第一节 核酸降解和核苷酸代谢核酸降解和核苷酸代谢第二节第二节 DNA的生物合成的生物合成第三节第三节 RNA的生物合成的生物合成第四节第四节 核酸代谢的调节核酸代谢的调节 212第一节第一节 核酸降解和核苷酸代谢核酸降解和核苷酸代谢一、核酸和核苷酸的分解代谢一、核酸和核苷酸的分解代谢二、核苷酸的合成代谢二、核苷酸的合成代谢3一、核酸和核苷酸的分解代谢一、核酸和核苷酸的分解代谢1、核酸的解聚作用、核酸的解聚作用2、核苷酸的降解、核苷酸的降解3、嘌呤的分解、嘌呤的分解4、嘧啶的分解、嘧啶的分解41、核酸的解聚作用、核酸的解聚作用核苷核苷核酸核酸核苷酸核苷酸许多个许多个戊糖戊糖磷酸磷酸51、
2、核酸的解聚作用、核酸的解聚作用 核糖核酸核糖核酸酶与脱氧核酶与脱氧核糖核酸酶糖核酸酶 核酸内切核酸内切酶与核酸外酶与核酸外切酶切酶 限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶62、核苷酸的降解、核苷酸的降解核苷核苷碱基碱基戊糖戊糖磷酸磷酸 各种单核苷酸受细胞内各种单核苷酸受细胞内磷酸单酯酶磷酸单酯酶或或核苷核苷酸酶酸酶的水解作用成为核苷和磷酸的水解作用成为核苷和磷酸 72、核苷酸的降解、核苷酸的降解碱基碱基戊糖戊糖磷酸磷酸 非特异性的磷酸单酯酶，其水解位点可以是核苷的非特异性的磷酸单酯酶，其水解位点可以是核苷的2、3或或5 特异性强的磷酸单酯酶只能水解特异性强的磷酸单酯酶只能水解3-或或5-核苷酸磷酸核
3、苷酸磷酸 82、核苷酸的降解、核苷酸的降解碱基碱基戊糖戊糖 核苷酶按底物不同可分为嘌呤核苷酶和嘧啶核苷酶核苷酶按底物不同可分为嘌呤核苷酶和嘧啶核苷酶 按催化反应的不同可以分为按催化反应的不同可以分为核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶和和核苷水核苷水解酶解酶92、核苷酸的降解、核苷酸的降解碱基碱基戊糖戊糖核苷 + H2O嘌呤碱或嘧啶碱 + 戊糖核苷水解酶10 腺嘌呤腺嘌呤( (A) ) 鸟嘌呤鸟嘌呤( (G) ) H2O H2O NH3 NH3 次黄嘌呤次黄嘌呤 黄嘌呤黄嘌呤( (Xan) ) H2O+O2 H2O2 H2O+O2 H2O2 尿囊素尿囊素 尿酸尿酸 H2O CO2+H2O2 2H2O+O2
4、 尿囊酸尿囊酸 尿素尿素 + + 乙醛酸乙醛酸 H2O 2H2O 4NH3 + + 2CO2（人类和灵长类动物、（人类和灵长类动物、爬虫、鸟类）爬虫、鸟类）（灵长类以外的哺乳动物）（灵长类以外的哺乳动物）（植物）（植物）（鱼类、两栖类）（鱼类、两栖类）（海洋无脊椎动物）（海洋无脊椎动物）腺嘌呤脱氨酶腺嘌呤脱氨酶鸟嘌呤脱氨酶鸟嘌呤脱氨酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤黄嘌呤氧化酶氧化酶尿酸氧化酶尿酸氧化酶尿囊尿囊素酶素酶尿囊酸酶尿囊酸酶脲酶脲酶3、嘌嘌呤呤的的分分解解11（1）鸟嘌呤的分解）鸟嘌呤的分解鸟嘌呤酶鸟嘌呤酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶鸟嘌呤鸟嘌呤黄嘌呤黄嘌呤尿酸尿酸（2）腺嘌呤的分解）腺嘌
5、呤的分解腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶尿酸尿酸腺苷腺苷黄嘌呤黄嘌呤腺苷酸脱氨酶腺苷酸脱氨酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶尿酸尿酸腺苷酸腺苷酸黄嘌呤黄嘌呤3、嘌呤的分解、嘌呤的分解12腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤3、嘌呤的分解、嘌呤的分解13腺苷腺苷肌（次黄）苷肌（次黄）苷腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶H2ONH3嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶Pi磷酸核糖磷酸核糖次黄嘌呤次黄嘌呤3、嘌呤的分解、嘌呤的分解14鸟苷鸟苷嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶Pi磷酸核糖磷酸核糖鸟嘌呤鸟嘌呤3、嘌呤的分解、嘌呤的分解15腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤腺嘌呤脱氨酶
6、腺嘌呤脱氨酶 H2O,NH3鸟嘌呤脱氨酶鸟嘌呤脱氨酶 H2O,NH33、嘌呤的分解、嘌呤的分解16黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶H2O O2H2O2尿酸尿酸尿酸氧化酶尿酸氧化酶2H2O O2H2O2CO2尿囊素尿囊素3、嘌呤的分解、嘌呤的分解17尿囊素酶尿囊素酶 H2O尿囊素尿囊素尿囊酸尿囊酸尿囊酸酶尿囊酸酶 H2O尿素尿素乙醛酸乙醛酸 尿酶尿酶2H2O4NH32CO23、嘌呤的分解、嘌呤的分解18 尿酸是人、猿及鸟类等体内嘌呤代谢的最终产物。尿酸是人、猿及鸟类等体内嘌呤代谢的最终产物。尿酸因动物的种类而异可进一步分解，成为尿囊素、尿酸因动物的种类而异可进一步分解，成为尿囊素、尿素、乙醛
7、酸及尿素、乙醛酸及NH3和和CO2。尿酸尿酸尿囊素尿囊素尿素尿素乙醛酸乙醛酸NH3和和CO2尿酸酶尿酸酶 尿囊酶尿囊酶（非灵长类（非灵长类的哺乳类）的哺乳类）（鱼类、两栖类）（鱼类、两栖类）尿尿酶酶H2O（甲壳类）（甲壳类）3、嘌呤的分解、嘌呤的分解19尿素尿素乙醛酸乙醛酸腺苷酸腺苷酸次黄苷酸次黄苷酸腺苷腺苷腺嘌呤腺嘌呤次黄苷次黄苷 次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤尿酸尿酸尿囊素尿囊素黄嘌呤黄嘌呤尿囊酸尿囊酸鸟嘌呤鸟嘌呤3、嘌呤的分解、嘌呤的分解20胞嘧啶胞嘧啶( (C) ) 尿嘧啶尿嘧啶( (U) ) 二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶 H2O NH3 NAD(P)H+H+ NAD(P)+ H2O - -丙氨
8、酸丙氨酸 - -脲基丙酸脲基丙酸 H2O 胸腺嘧啶胸腺嘧啶( (T) ) 二氢胸腺嘧啶二氢胸腺嘧啶 NAD(P)H+H+ NAD(P)+ H2O - -氨基异丁酸氨基异丁酸 -脲基异丁酸脲基异丁酸 H2O 胞嘧啶脱氨酶胞嘧啶脱氨酶二氢尿嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶脱氢酶二二氢氢嘧嘧啶啶酶酶脲基丙酸酶脲基丙酸酶二氢尿嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶脱氢酶二氢嘧啶酶二氢嘧啶酶脲基丙酸酶脲基丙酸酶NH3+CO2+NH3+CO2+4、嘧啶的分解、嘧啶的分解21尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶4、嘧啶的分解、嘧啶的分解22二氢尿嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶脱氢酶NADPHNADP+H+尿嘧啶尿嘧啶5, 6二氢二氢尿嘧啶尿嘧
9、啶二氢嘧啶水化酶二氢嘧啶水化酶H2O-脲基丙酸脲基丙酸-丙氨酸丙氨酸脲基丙酸酶脲基丙酸酶H2O4、嘧啶的分解、嘧啶的分解23二氢尿嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶脱氢酶NADPHNADP+H+二氢嘧啶水化酶二氢嘧啶水化酶H2O脲基丙酸酶脲基丙酸酶H2O胸腺嘧啶胸腺嘧啶5, 6二氢二氢胸腺嘧啶胸腺嘧啶-脲异丁酸脲异丁酸-氨基异丁酸氨基异丁酸4、嘧啶的分解、嘧啶的分解24尿嘧啶与胸腺嘧啶尿嘧啶与胸腺嘧啶 二氢衍生物二氢衍生物 -脲基丙氨酸及脲基丙氨酸及-脲基异丁酸脲基异丁酸 -丙氨酸及丙氨酸及-异丁酸异丁酸+ CO2 + NH3胞嘧啶具有氨基，所以要先在胞嘧啶脱氨酶的作用胞嘧啶具有氨基，所以要先在胞嘧啶脱氨酶
10、的作用下水解脱氨基下水解脱氨基 胞嘧啶胞嘧啶+H2O尿嘧啶尿嘧啶+ NH34、嘧啶的分解、嘧啶的分解25二、核苷酸的合成代谢二、核苷酸的合成代谢1、嘌呤核糖核苷酸的生物合成、嘌呤核糖核苷酸的生物合成2、嘧啶核糖核苷酸的生物合成、嘧啶核糖核苷酸的生物合成3、脱氧核糖核苷酸的生物合成、脱氧核糖核苷酸的生物合成4、核糖三磷酸和胸苷酸的生物合成、核糖三磷酸和胸苷酸的生物合成261、嘌呤核糖核苷酸的生物合成、嘌呤核糖核苷酸的生物合成PRPP从头合成IMPAMPGMPAGI补救合成补救合成补救合成CO2一碳单位氨基酸天冬氨酸嘧啶环UMPCMPdTMPC补救合成从头合成补救合成UPRPP 从头合成：从头合成
11、：以氨基酸等简单物质为原料从头合成核以氨基酸等简单物质为原料从头合成核苷酸。苷酸。 补救途径：补救途径：以现有的碱基和核苷为原料合成核苷酸。以现有的碱基和核苷为原料合成核苷酸。271、嘌呤核糖核苷酸的生物合成、嘌呤核糖核苷酸的生物合成N1C2N36C5C4CN7N9C8天冬氨酸天冬氨酸一碳单一碳单位位一碳单一碳单位位CO2甘氨酸甘氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺281、嘌呤核糖核苷酸的生物合成、嘌呤核糖核苷酸的生物合成（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成（2）嘌呤核苷酸的补救合成）嘌呤核苷酸的补救合成（3）嘌呤核苷酸的相互转变）嘌呤核苷酸的相互转变29PRPP合成酶合成酶5-磷
12、酸核糖焦磷酸核糖焦磷酸（磷酸（PRPP）的合成的合成（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成30谷氨酰胺谷氨酰胺PRPP酰胺基转移酶酰胺基转移酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成931磷酸核糖甘氨磷酸核糖甘氨酰胺合成酶酰胺合成酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成457932磷酸核糖甘氨酰磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶胺转甲酰基酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成8945733磷酸核糖甲酰甘磷酸核糖甲酰甘氨咪唑合成酶氨咪唑合成酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成38945734磷酸核糖氨基磷酸核糖氨基咪唑合成酶咪唑合成酶（1）嘌呤核苷酸
13、的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成38945735磷酸核糖氨基磷酸核糖氨基咪唑羧化酶咪唑羧化酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成389457636磷酸核糖氨基咪唑磷酸核糖氨基咪唑-琥珀琥珀酸酸-甲酰胺合成酶甲酰胺合成酶3894571637腺苷酸腺苷酸-琥琥珀酸裂解酶珀酸裂解酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成3894571638磷酸核糖氨基咪唑磷酸核糖氨基咪唑甲酰胺转甲酰基酶甲酰胺转甲酰基酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成38945716239IMP-环化环化水解酶水解酶（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成38945716240AMP和和G
14、MP的合成的合成（1）嘌呤核苷酸的从头合成）嘌呤核苷酸的从头合成41腺嘌呤 + PRPP腺苷酸焦磷酸化酶腺苷酸 + PPi鸟嘌呤 + PRPP鸟苷酸焦磷酸化酶鸟苷酸 + PPi嘌呤 + 1-磷酸核糖核苷磷酸化酶嘌呤核苷Pi+嘌呤核苷核苷磷酸激酶ATPADP嘌呤核苷酸（2）嘌呤核苷酸的补救合成）嘌呤核苷酸的补救合成42（3）嘌呤核苷酸的相互转变）嘌呤核苷酸的相互转变432、嘧啶核糖核苷酸的生物合成、嘧啶核糖核苷酸的生物合成N3C2N14C5C6CCO2天冬氨酸天冬氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺442、嘧啶核糖核苷酸的生物合成、嘧啶核糖核苷酸的生物合成（1）嘧啶核苷酸的从头合成）嘧啶核苷酸的从头合成（2）嘧
15、啶核苷酸的补救合成）嘧啶核苷酸的补救合成45嘧啶核苷酸的从头合成嘧啶核苷酸的从头合成氨甲酰磷氨甲酰磷酸合成酶酸合成酶Asp-氨甲酰氨甲酰基转移酶基转移酶二氢乳二氢乳清酸酶清酸酶乳清酸脱氢酶乳清酸脱氢酶（1）嘧啶核苷酸的从头合成）嘧啶核苷酸的从头合成46乳清酸磷酸核乳清酸磷酸核糖基转移酶糖基转移酶乳清核苷乳清核苷酸脱羧酶酸脱羧酶（1）嘧啶核苷酸的从头合成）嘧啶核苷酸的从头合成47尿嘧啶 + PRPP核苷-5-磷酸焦磷酸酶UMP + PPi（2）嘧啶核苷酸的补救合成）嘧啶核苷酸的补救合成483、脱氧核糖核苷酸的生物合成、脱氧核糖核苷酸的生物合成494、核糖三磷酸的生物合成、核糖三磷酸的生物合成 核
16、苷酸不直接参加核酸的生物合成而是先转化成核苷酸不直接参加核酸的生物合成而是先转化成相应的核苷三磷酸后再参入相应的核苷三磷酸后再参入DNA或或RNA (d)NMP+ATP (d)NDP+ADP ATP作为磷酸的供体，催化酶为（脱氧）腺苷酸作为磷酸的供体，催化酶为（脱氧）腺苷酸激酶，此酶对核糖没有专一性，而对碱基有专一性激酶，此酶对核糖没有专一性，而对碱基有专一性 (d)NDP+ATP (d)NTP+ADP 催化酶为一种激酶，它没有专一性催化酶为一种激酶，它没有专一性5012第二节第二节 DNA的生物合成的生物合成一、一、DNA的复制的复制二、二、DNA的损伤与修复的损伤与修复3三、逆转录三、逆转
17、录51一、一、DNA的复制的复制1、半保留复制、半保留复制2、复制的起点和方式、复制的起点和方式3、参与、参与DNA复制的酶和蛋白因子复制的酶和蛋白因子4、DNA的半不连续复制的半不连续复制5、原核生物、原核生物DNA复制的特点复制的特点6、真核生物、真核生物DNA复制的特点复制的特点521、半保留复制、半保留复制 定义：定义：由亲代由亲代DNA生成子代生成子代DNA时，每个新形成的时，每个新形成的子代子代DNA中，一条链来自亲代中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是而另一条链则是新合成的新合成的 实验证据：实验证据：1958年年Meselson和和Stahl用同位素用同位素15N标记标记大
18、肠杆菌大肠杆菌DNA，首先证明了，首先证明了DNA的半保留复制的半保留复制复制复制53亲代亲代第一代第一代第二代第二代15NDNA14N- 15NDNA14NDNA实验证明实验证明542、复制的起点和方式、复制的起点和方式 复制叉：复制叉： DNA复制进行时，在复制眼中发生的复制进行时，在复制眼中发生的DNA合成反应的分支点合成反应的分支点 复制子：复制子：在在DNA复制原点的控制下能够独立进复制原点的控制下能够独立进行行DNA复制的单位。一个复制子可以有一个或两复制的单位。一个复制子可以有一个或两个复制叉个复制叉 复制方向：复制方向：单向和双向单向和双向55起点起点起点起点起点起点起点起点起
19、点起点未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制复制叉复制叉复制叉复制叉复制叉复制叉562、复制的起点和方式、复制的起点和方式真核细胞染色体的复制真核细胞染色体的复制573、参与、参与DNA复制的酶和蛋白因子复制的酶和蛋白因子（1）DNA聚合酶聚合酶（2）DNA连接酶连接酶（3）与解除）与解除DNA高级结构相关的高级结构相关的酶及蛋白因子酶及蛋白因子（4）引发体）引发体58以以DNA为模板合成为模板合成DNA的酶。的酶。催化催化DNA新链合成时需有新链合成时需有4种种dNTP作为底作为底物，还需物，还需Mg2+、DNA模板及与模板模板及与模板DNA互互补的一小段多核苷酸引物。补的一小段
20、多核苷酸引物。有有DNA聚合酶聚合酶I、II、III、IV、V。（1）DNA聚合酶聚合酶59DNA聚合酶聚合酶IDNA聚合酶聚合酶IIDNA聚合酶聚合酶III真核细胞的真核细胞的DNA聚合酶聚合酶（1）DNA聚合酶聚合酶60 1956年，年，A. Kornberg发现发现 分子量为分子量为109,000，由一条单一多肽链组，由一条单一多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子成，多肽链中含有一个锌原子 大肠杆菌有大肠杆菌有400个个DNA聚合酶聚合酶I61 53方向聚合作方向聚合作用用 35核酸外切作核酸外切作用用 53核酸外切作核酸外切作用用DNA聚合酶聚合酶I62活性部位在肽段上的分布：活性部位在
21、肽段上的分布：53外切外切35外切外切53聚合聚合蛋白酶NC小片段，小片段，3500Klenow片段，片段，6800DNA聚合酶聚合酶I63 由由10个亚基组成的蛋白质，其中个亚基组成的蛋白质，其中、组组成的部分叫成的部分叫核心酶核心酶，核心酶与其它亚基组成，核心酶与其它亚基组成全全酶。酶。 亚基具有亚基具有5-3 聚合酶作用聚合酶作用 亚基亚基3-5外切酶活性外切酶活性 亚基组建复制起始复合物亚基组建复制起始复合物DNA聚合酶聚合酶II64 大肠杆菌有大肠杆菌有10个个 聚合酶活性比聚合酶活性比DNA聚合酶聚合酶I高高15倍倍 现在认为它是现在认为它是E. coli细胞内真正负责重新细胞内真
22、正负责重新合成合成DNA的复制酶的复制酶DNA聚合酶聚合酶III65DNA聚合酶聚合酶全酶全酶 核心酶核心酶Pol III Pol III延长因子延长因子DNA聚合酶聚合酶二聚体二聚体66DNA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应3 5 模板链模板链5 RNA引物引物子链子链3 3 5 5 3 3 5 5 3 67DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能聚合酶聚合酶错配碱基错配碱基复制方向复制方向正正 确确核苷酸核苷酸5 5 5 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸68功能功能polpolpol 聚合作用聚合作用53+外切酶活性外切酶活性35+外切酶活性外切酶活性53+-焦磷酸解和焦
23、磷酸交换作用焦磷酸解和焦磷酸交换作用+-+完整的完整的DNA双链双链-带引物的长单链带引物的长单链DNA+-带缺口的双链带缺口的双链DNA+-双链而有间隙的双链而有间隙的DNA+相对分子量相对分子量109 000120 00014 0000每个细胞中的分子数每个细胞中的分子数400171001020结构基因结构基因pol Apol Bpol CDNA聚合酶聚合酶I、II 和和III的不同点的不同点69真核细胞有真核细胞有5种种DNA聚合酶：聚合酶：DNA聚合酶聚合酶：引物酶活性引物酶活性DNA聚合酶聚合酶：修饰作用修饰作用DNA聚合酶聚合酶：线粒体线粒体DNA的复制的复制DNA聚合酶聚合酶：具
24、有具有5-3 聚合酶作用和聚合酶作用和3-5外切外切酶活性；合成前导链和滞后链酶活性；合成前导链和滞后链DNA聚合酶聚合酶：DNA修复修复真核细胞的真核细胞的DNA聚合酶聚合酶70是指催化双链是指催化双链DNA切口处的切口处的5-磷酸基和磷酸基和3-羟基之间形成磷酸二酯键的酶，连接反应需要羟基之间形成磷酸二酯键的酶，连接反应需要供给能量，主要以供给能量，主要以ATP作为能量来源。作为能量来源。3535OH P3535DNA连接酶连接酶（2）DNA连接酶连接酶71（2）DNA连接酶连接酶3PTAOH53PCAPPA TGT35PATPAMP+PPiMg2+连接酶连接酶PTA53PCAPPA TG
25、T35P72 DNA解旋酶：解旋酶：催化催化DNA双螺旋分开成为两条链的双螺旋分开成为两条链的酶。酶。 DNA拓扑异构酶：拓扑异构酶：能够催化能够催化DNA链的断裂和结合，链的断裂和结合，从而控制从而控制DNA 的拓扑状态。的拓扑状态。 SSBs（单链结合蛋白）：（单链结合蛋白）：稳定已被解开的稳定已被解开的DNA单单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。（3）与解除）与解除DNA高级结构相高级结构相 关的酶及蛋白因子关的酶及蛋白因子73 引发体：引发体：是是DNA复制开始所必须的，由多种蛋白质复制开始所必须的，由多种蛋白质及酶组成的复合物及酶组成的复合物
26、 DnaA：能结合于能结合于DNA复制起始部位复制起始部位 DnaB：具有解链酶的作用具有解链酶的作用 DnaC：能结合于能结合于DNA复制起始部位，解开复制起始部位，解开DNA双链双链 引物酶：引物酶：DNA合成时候所需的引物合成时候所需的引物 （4）引发体）引发体744、DNA的半不连续复制的半不连续复制 定义：定义：两条两条DNA链同时作为模板进行复制时，一条链同时作为模板进行复制时，一条链（链（35）的复制是连续的，另一条链）的复制是连续的，另一条链（53）的复制是不连续的。）的复制是不连续的。 前导链和滞后链：前导链和滞后链：DNA聚合酶只能催化聚合酶只能催化DNA链从链从53方向合
27、成，因此新生方向合成，因此新生DNA链先按链先按53方方向连续合成一条链，这一条链叫前导链，不连续合成向连续合成一条链，这一条链叫前导链，不连续合成的另一条链叫滞后链。的另一条链叫滞后链。 Okazaki（冈崎）片断：（冈崎）片断：半不连续复制过程中出现半不连续复制过程中出现的的1000个左右核苷酸的个左右核苷酸的DNA小片段。小片段。754、DNA的半不连续复制的半不连续复制复制叉复制叉764、DNA的半不连续复制的半不连续复制774、DNA的半不连续复制的半不连续复制 RNA引物：引物：DNA复制时，除了需要复制时，除了需要DNA聚合酶、模聚合酶、模板和板和4种核苷酸底物及其它所需的小分子
28、外，还需要一种核苷酸底物及其它所需的小分子外，还需要一段段RNA作为引物，在其作为引物，在其3末端合成末端合成DNA新链。新链。 RNA引物的合成：引物的合成：是在是在DNA模板链的一定部位合成模板链的一定部位合成并互补于并互补于DNA链，合成方向也是链，合成方向也是53。催化该反。催化该反应的酶称为引物合成酶。引物的长度通常为应的酶称为引物合成酶。引物的长度通常为1530个个核苷酸。核苷酸。784、DNA的半不连续复制的半不连续复制Arthur Kornberg wonthe 1959 Nobel Prizein Medicine for hisdiscovery of the mechan
29、ism in the biological synthesis of deoxyribonucleic acid (before Watson and Crick won theirs!)The biologic synthesis of deoxyribonucleic acid794、DNA的半不连续复制的半不连续复制在多种蛋白质和酶的参与下，双链解开形成复制在多种蛋白质和酶的参与下，双链解开形成复制叉叉在一系列酶的作用下，在一系列酶的作用下，DNA双螺旋解开形成两股双螺旋解开形成两股单链进行复制单链进行复制两股单链分别在复制叉处按碱基配对原则进行反两股单链分别在复制叉处按碱基配对原则进行
30、反向平行复制，一条沿向平行复制，一条沿53方向连续进行复制，而另方向连续进行复制，而另一条则经形成冈崎片段进行不连续复制一条则经形成冈崎片段进行不连续复制冈崎片段经冈崎片段经DNA连接酶形成一条连续的连接酶形成一条连续的DNA链链DNA的复制步骤的复制步骤804、DNA的半不连续复制的半不连续复制8153复制叉的复制叉的移动方向移动方向ATPADPPiDNA旋旋转酶转酶解旋酶解旋酶SSB引物体引物体RNA引物引物DNA聚合酶聚合酶III复合物复合物DNA聚合酶聚合酶III在在RNA引物上开始作用引物上开始作用DNA聚合酶聚合酶IRNA引物的去处和引物的去处和被脱氧核苷酸取代被脱氧核苷酸取代被被
31、DNA连连接酶拼接接酶拼接3535前导链前导链滞后链滞后链SSB825、原核生物、原核生物DNA复制的特点复制的特点 方式（或方式（或Cairns方式）：方式）：大肠杆菌大肠杆菌 滚动环式：滚动环式：病毒病毒 取代环或取代环或D-环式环式：线粒体：线粒体DNA的复制的复制 单个复制起始点，单个复制子单个复制起始点，单个复制子复制方式复制方式836、真核生物、真核生物DNA复制的特点复制的特点 真核生物有多个复制起始点和复制子真核生物有多个复制起始点和复制子 真核生物的复制子从开始复制后一直复制到结束，真核生物的复制子从开始复制后一直复制到结束，期间不再重新开始期间不再重新开始 真核和原核生物真
32、核和原核生物DNA聚合酶不一样聚合酶不一样 真核生物复制时，首先真核生物复制时，首先DNA与组蛋白解开，复制完与组蛋白解开，复制完成后重新组装核小体成后重新组装核小体 引物及冈崎片段的长度均比原核细胞短引物及冈崎片段的长度均比原核细胞短 84真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点 多个起点复制多个起点复制起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点85PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）是）是体外酶促合成特异体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周低温
33、退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。 PCR又又称无细胞分子克隆或特异性称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶序列体外引物定向酶促扩增技术。促扩增技术。 特点特点：特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等。：特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等。应用范围应用范围：不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列：不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。的地方。86PCR模板模板DNA的变性的变性：模板模板DNA经加热至经加热
34、至94左右左右一定时间后，使模板一定时间后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的扩增形成的双链双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；为下轮反应作准备；模板模板DNA与引物的退火（复性）与引物的退火（复性）：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引物左右，引物与模板与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；工作原理工作原理87PCR引物的延伸引物的延伸：DNA模板模板引物结合物在引物结合物在DNA聚聚合酶的作用下，于合酶的作用下，于72左右，以左右，以dNT
35、P为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重链互补的半保留复制链。重复循环变性复循环变性退火退火延伸三过程，就可获得更多的延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需环的模板。每完成一个循环需24分钟，分钟，23小时小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。88PCR 引物引物 酶酶 dNTP 模板模板 Mg2+ 89引物设计引物设计 引物
36、长度：引物长度： 15-30bp，常用为，常用为20bp左右。左右。 引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增太少扩增效果不佳，效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机最好随机分布，避免分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。的扩增条带。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的
37、靶序列引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。无明显同源性。 DNAMAN DNAClub Oligo Primer PCR反应体系反应体系92PCR反应条件反应条件 第一阶段：第一阶段：94 预变性预变性4 min 第二阶段：第二阶段： 94 变性变性40 S 退火温度退火温度 30S 72 延伸延伸 1-2 min 第三阶段：第三阶段：72 延伸延伸10 min，使引物延
38、伸完全，并使，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链单链产物退火成双链 第四阶段：第四阶段：4 保存保存（2535）16S rRNA扩增电泳图扩增电泳图20001500M 1 2 3 41000500250100磷脂酶磷脂酶B的的PCR扩增产物扩增产物20001000750500250100M194二、二、DNA的损伤与修复的损伤与修复1、DNA的损伤的损伤突变突变2、DNA的修复的修复951、DNA的损伤的损伤突变突变 点突变点突变：DNA分子上一个碱基的变异。分子上一个碱基的变异。 缺失缺失：一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从：一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从DNA大分子上丢失。
39、大分子上丢失。 插入插入：一个原来没有的碱基或一段核苷酸序列插入：一个原来没有的碱基或一段核苷酸序列插入到到DNA大分子中去，引起移码突变，影响三联体密大分子中去，引起移码突变，影响三联体密码的阅读方式码的阅读方式 。96 DNA突变的类型突变的类型 -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-转换转换 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失T野生型基因野生型基因 -T-C-G
40、-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换（substitution）移码突变移码突变（frameshift mutation）97三、逆转录三、逆转录1、逆转录酶及其催化特性、逆转录酶及其催化特性2、逆转录过程、逆转录过程3、 cDNA文库文库981、逆转录酶及其催化特性、逆转录酶及其催化特性逆转录逆转录：逆转录酶催化的反应，即以逆转录酶催化的反应，即以RNA为模板为模板合成合成DNA的过程称为逆转录的过程称为逆转录逆转录酶逆
41、转录酶逆转录病毒逆转录病毒：需在逆转录酶的作用下首先将需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为转变为cDNA，再在，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。作用下扩增的一类病毒。 991、逆转录酶及其催化特性、逆转录酶及其催化特性RNA3 5 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶RNA3 5 核糖核酸酶核糖核酸酶H53 53 cDNA依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶cDNA杂交分子杂交分子35 53 双链双链DNA新合成的双链新合成的双链DNA整合到整合到寄主染色体寄主染色体DNA中中1002、逆转录过程、逆转录过程1013、cDNA文库文库 是以
42、特定的组织或细胞是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成为模板，逆转录形成的互补的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，克隆群，这样包含着细胞全部这样包含着细胞全部mRNA信息的信息的cDNA克隆集合称克隆集合称为该组织或细胞的为该组织或细胞的cDNA文库。文库。 cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库文库具有组织或细胞特异性具有组织或细胞特
43、异性。 1023、cDNA文库文库10312第三节第三节 RNA的生物合成的生物合成一、催化一、催化RNA合成的模板和酶合成的模板和酶二、转录过程二、转录过程43三、转录后修饰加工三、转录后修饰加工四、四、RNA的复制的复制104一、催化一、催化RNA合成的模板和酶合成的模板和酶1、转录模板、转录模板2、RNA聚合酶聚合酶3、RNA复制酶复制酶4、多核苷酸磷酸化酶、多核苷酸磷酸化酶5、模板与酶的辨认结合、模板与酶的辨认结合1051、转录模板、转录模板反义链（模板链、负链、非敏感链、非编码链）：反义链（模板链、负链、非敏感链、非编码链）：在在RNA的转录中，用作模板的的转录中，用作模板的DNA链
44、称为反义链链称为反义链有义链（编码链、正链、敏感链）：有义链（编码链、正链、敏感链）：在在RNA的转录中，的转录中，不作为模板的不作为模板的DNA链称为有义链链称为有义链1062、RNA聚合酶聚合酶 以以DNA为模板，以为模板，以4种核苷三磷酸（种核苷三磷酸（NTP）为底物，在二价阳离子参与下催化合成为底物，在二价阳离子参与下催化合成RNA的酶。的酶。 又称为依赖又称为依赖DNA的的RNA聚合酶。聚合酶。 1072、 RNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌的大肠杆菌的RNA聚合酶，其相对分子质量约聚合酶，其相对分子质量约为为465 000，由，由4种亚基种亚基、和和（sigma）组）组成的五聚体（成的五
45、聚体（2）+108ACPTPCPGAPP- P- POH53CPGPPPPOHUDNA指导下的指导下的RNA合成合成1092、RNA聚合酶聚合酶 真核生物的真核生物的RNA聚合酶：聚合酶：酶类型酶类型别别 名名细胞定位细胞定位合成合成RNA的的类型类型-鹅膏蕈碱抑制程鹅膏蕈碱抑制程度度（A酶）酶）rRNA聚聚合酶合酶核仁核仁rRNA抑制（不敏感）抑制（不敏感）10-3 mol/L（B酶）酶）不均一不均一RNA聚聚合酶合酶核质核质hnRNA 低浓度抑制（高低浓度抑制（高度敏感）度敏感）（C酶）酶） 小分子小分子RNA聚聚合酶合酶核质核质5SRNA，tRNA10-5抑制（中度抑制（中度敏感）敏感）
46、1103、RNA复制酶复制酶 依赖于依赖于RNA的的RNA聚合酶，以聚合酶，以RNA为模板，以为模板，以4种种核苷三磷酸为底物，合成核苷三磷酸为底物，合成RNA分子。分子。 RNA复制酶包括复制酶包括4个亚基，个亚基，3个亚基来自宿主细胞，个亚基来自宿主细胞，1个亚基在噬菌体感染过程中产生。个亚基在噬菌体感染过程中产生。 不仅存在于被噬菌体感染的细菌体内，而且也存在不仅存在于被噬菌体感染的细菌体内，而且也存在于被于被RNA病毒感染的高等动物和植物体内。病毒感染的高等动物和植物体内。1114、多核苷酸磷酸化酶、多核苷酸磷酸化酶 催化在体外合成多核苷酸的酶，不需任催化在体外合成多核苷酸的酶，不需任
47、何模板。何模板。 广泛存在于微生物体内，催化以核苷二广泛存在于微生物体内，催化以核苷二磷酸为底物的多核苷酸合成反应。磷酸为底物的多核苷酸合成反应。 人们推断该酶在生物体内的功能是催化人们推断该酶在生物体内的功能是催化RNA分解为核苷二磷酸，而不是合成分解为核苷二磷酸，而不是合成RNA。1125、模板与酶的辨认结合、模板与酶的辨认结合 操纵子：操纵子：包括若干结构基因及其上游的调控序列包括若干结构基因及其上游的调控序列 启动子启动子：与：与RNA聚合酶相结合的区域，也是控制转录的聚合酶相结合的区域，也是控制转录的关键部位关键部位 TTGACAAACTGTTATAATATATTA35（识别位）（识
48、别位）10（Pribnow框框）1起始部位起始部位DNA53原核生物启动子结构原核生物启动子结构113二、转录过程二、转录过程1、转录起始、转录起始2、转录延长、转录延长3、转录终止、转录终止1141、转录起始、转录起始（1）原核生物的转录起始）原核生物的转录起始 （2）真核生物的转录起始）真核生物的转录起始 115 原核生物依靠原核生物依靠因子辨认转录起始点，被辨认的因子辨认转录起始点，被辨认的DNA区段就是处在区段就是处在-35区的区的TTGACA序列。序列。-35-10转录方向转录方向上游上游下游下游因子因子原核物转录起始的识别原核物转录起始的识别（1）原核生物的转录起始）原核生物的转录
49、起始 116 真核生物真核生物RNA聚合酶辨认转录起始区上游的聚合酶辨认转录起始区上游的DNA序列，生成起始复合物。起始点上游大多有共同的序列，生成起始复合物。起始点上游大多有共同的5-TATA序列，称为序列，称为Hogness盒或盒或TATA盒。盒。AATAAGCGC-CAAT-TATA-ATG切离加尾切离加尾真正终止点真正终止点翻译起始翻译起始转录起始转录起始TATA盒盒CAAT盒盒GC盒盒增 强增 强子子内含子内含子外显子外显子（2）真核生物的转录起始）真核生物的转录起始 1172、转录延长、转录延长 原核和真核生物的转录延长过程没有显著原核和真核生物的转录延长过程没有显著区别，只是区别
50、，只是RNA聚合酶的不同。聚合酶的不同。53mRNA5351183、转录终止、转录终止（1）原核生物的转录终止）原核生物的转录终止 （2）真核生物的转录终止）真核生物的转录终止 119依赖依赖因子的转录终止因子的转录终止 （1）原核生物的转录终止）原核生物的转录终止 120不依赖不依赖因子的因子的转录终止转录终止（1）原核生物）原核生物 的转录终止的转录终止 121 在模板链读码框架的在模板链读码框架的3端之后，常有一组共同序列端之后，常有一组共同序列AATAAA，在下游还有相当多的，在下游还有相当多的CT序列，这些序列序列，这些序列称为称为转录终止的修饰点。转录终止的修饰点。 越过转录修饰点
