1、第五节第五节 基因扩增技术基因扩增技术 一、一、PCR的定义：的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。扩增技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。片段的技术。 PCRPCR技术：技术：19851985年由美国年由美国 Cetus Cetus 公司的公司的Kary Kary MullisMullis 首创，可以将微量目的首创，可以将微量目的DNADNA片段扩增一百万片段扩增一百万倍以上。倍以上。 优点：优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度
2、高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学等领域，并已普及到许多普通实验室，大大法医学等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。的基因进行分析、鉴定。 Kary MullisKary Mullis 本人因此获本人因此获19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。二、二、PCR技术的原理技术的原理1. 变性变性 (Denaturation)： 加热使模板加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单双链间的
3、氢键断裂而形成两条单链。链。95 2. 退火退火 (复性复性) (Annealling): 降低反应体系的温度使寡核苷酸降低反应体系的温度使寡核苷酸引物引物与与DNA模板模板互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。55 也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。物之间。 3. 延伸延伸 (Extension): 升高反应体系温度至升高反应体系温度至72 ，以，以4种种dNTP为原料，为原料，在在DNA聚合酶作用下，
4、从引物的聚合酶作用下，从引物的3-OH 端延伸，以端延伸，以变性后的单链变性后的单链DNA为模板，合成出为模板，合成出5 3 3的互补链。的互补链。 上述上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中步为一个循环，每经过一个循环，样本中的的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过轮循环的模板，经过2540个循环后个循环后DNA可扩增可扩增106 109 倍。倍。 变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-55C双链双链DNA分子分子双链断开双链断开循环循环1模板与引物结合模板与引物结合循环循环1循环循环1TaqTaq循环循环1双链断开
5、双链断开循环循环2模板与引物结合模板与引物结合循环循环2循环循环2PCRPCR循环次数与循环次数与DNADNA产量关系产量关系理论上，终产物DNA的量可用Yn=X2n计算但在实际扩增过程中，扩增效率不可能达到100% Yn=X（1+E）n 0E1 四、四、PCR的反应体系的反应体系1.模板模板DNA： 被复制的核酸片段，在用被复制的核酸片段，在用RNA作模板时，须先将作模板时，须先将RNA逆转录为逆转录为cDNA，再以，再以cDNA作为作为PCR反应的模板进行扩反应的模板进行扩增反应。增反应。2.引物：引物： 为化学合成的寡核苷酸，每条被扩增的模板有两条引为化学合成的寡核苷酸，每条被扩增的模板
6、有两条引物，其物，其决定着决定着PCR扩增产物的特异性和长度。扩增产物的特异性和长度。3.脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（ dNTP）：）： dATPdATP、 dGTP dGTP 、dCTPdCTP、dTTP dTTP 浓度为浓度为0.02 0.02 0.2 mmol/L0.2 mmol/L4. Taq DNA 聚合酶：聚合酶： 催化催化DNADNA的合成的合成 0.5 5 U / 100 l，偏高：引物非特异产物的扩增；偏低：，偏高：引物非特异产物的扩增；偏低：产物量降低产物量降低5. MgCl2: 1.5 2.0 mmol/L Taq 酶具有酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和
7、扩增片依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量段的产量 过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。降。6. 缓冲液：缓冲液： 10 50 mmol/L Tris- Cl (pH8.4) 维持维持 Taq 酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性 25 50 mmol/L KCl 促进引物退火，促进引物退火，50 mmol/L 会抑制会抑制 Taq 酶的活酶的活性。性。 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的用
8、，建议使用乙酰化的 BSA。五、注意事项五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作人员保护操作人员保护环境保护环境保护样品保护样品 临床临床PCRPCR实验室分区实验室分区试剂储存和准备区试剂储存和准备区标本制备区标本制备区扩增反应区扩增反应区产物分析区产物分析区PCR实验室平面设计在入口处设缓冲间缓冲间比专用走廊更有意义。PCR实验室各区的设备配置表 分区分区器材选配器材选配PCR试剂区PCR制备区PCR扩增区PCR分析区PCR仪器仪器生物安全柜生物安全柜加热模块、离心机加热模块、离心机产物分析仪产物分析仪冰箱、混匀器冰箱、混匀器移液器移液器可移动紫外车可移动紫外车办公用品
9、、耗材办公用品、耗材2.2.操作人员必须进行上岗培训：操作人员必须进行上岗培训：卫生部临床检验中心或由省级卫生行政部门指定并经卫生部卫生部临床检验中心或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临床检验中心认定的机构临床检验中心认定的机构3.3.分装试剂：分装试剂：在超净工作台内分装，然后低温保存在超净工作台内分装，然后低温保存4.4.实验操作注意事项：实验操作注意事项：l做好个人防护做好个人防护l避免反应液飞溅避免反应液飞溅4.实验操作注意事项：l应有完整、有效的去污措施应有完整、有效的去污措施实验前实验前：实验耗材（反应管、加样器吸头）必须经高压消：实验耗材（反应管、加样器吸头）必须经高压消毒毒实验后实验后：反应管、加样器吸头用：反应管、加样器吸头用10%10%次氯酸钠溶液消毒处次氯酸钠溶液消毒处理；实验台面和其他表面用理；实验台面和其他表面用10%10%次氯酸钠溶液或紫外线近次氯酸钠溶液或紫外线近距离照射距离照射4.实验操作注意事项：l设立阴性、阳性对照
