1、微生物细胞破壁及破碎率的微生物细胞破壁及破碎率的测定测定一、实验目的一、实验目的1、 了解微生物细胞破碎的方法。2、 掌握研磨法、超声波、酶解法破碎细胞的原理、方法。3、 掌握细胞破碎率的测定方法。二、实验原理二、实验原理1、微生物细胞的破碎、微生物细胞的破碎 细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支撑细胞的作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，由于不同微生物细胞壁的结构的不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同。细胞破碎的方法很多，归纳起来可分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法等。（1） 研磨法研磨法 研磨研磨：将细胞
2、悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞破碎。搅拌或研磨，使细胞破碎。 实验室设备：实验室设备：Mickle高速组织捣碎机高速组织捣碎机和和Braun匀浆器匀浆器，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。 主要缺点主要缺点：温度迅速升高，需冷却温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用另外，较大量的细胞可用胶质磨胶质磨来处理。来处理。 特点：特点： 超声波破碎是应用较多的一种破碎方法。其特点是简便、快捷、超声波破碎是应用较多的一种破碎方法。其特点是简便、快捷、效果好，特别适用于微生物细胞的破碎。效果好，特
3、别适用于微生物细胞的破碎。 原理：原理： 超声波破碎机通常在超声波破碎机通常在15-25 kHz的频率下操作，细胞是由于超的频率下操作，细胞是由于超声波的空穴作用而破碎。空穴泡受到超声波的冲击而产生很强声波的空穴作用而破碎。空穴泡受到超声波的冲击而产生很强的冲击波压力，引起粘滞性旋涡，在介质中悬浮细胞上造成了的冲击波压力，引起粘滞性旋涡，在介质中悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声波破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系，同时受细胞波破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系，同时受细胞浓度、溶液粘度、浓度
4、、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等因素有关。值、温度以及离子强度等因素有关。 缺点及适用范围缺点及适用范围： 超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在细胞悬液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。细胞悬液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。 对于不同菌种，超声波处理的效果不同，对于不同菌种，超声波处理的效果不同，杆菌比球菌杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎，对酵母易破碎，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎，对酵母菌的效果差菌的效果差。 影响超声波破碎效率的参数影响超声波破碎效率的参数: 振幅振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋
5、白质释放的比速度振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 细胞悬浮液的粘度细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。粘度影响能耗并会抑制空穴现象。 表面张力表面张力 被处理悬浮液的体积被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。 珠粒的体积和直径珠粒的体积和直径 添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且产生辅助成有帮助，而且产生辅助 “研磨研磨”效应，从而提高破效应，从而提高破碎效率。碎效率。 探头的形状和材料探头的形状和材料 细胞悬浮液的流速细胞悬浮
6、液的流速 在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时间，并影响破碎的总收率。时间，并影响破碎的总收率。 声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很困难的。够的能量是很困难的。 原理原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁目的。而达到破壁目的。 （3） 酶解法酶解法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶：溶菌酶： 主要用于细菌类主要用于细菌类蛋白酶蛋白酶甘露糖酶
7、甘露糖酶糖苷酶糖苷酶肽键内切酶肽键内切酶壳多糖酶壳多糖酶利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。适当的酶，并确定相应的次序。如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘甘露糖结构，使两者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，露糖结构，使两者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。优点优
8、点: 产品释放的选择性高产品释放的选择性高; 抽提的速率和收率高抽提的速率和收率高; 产品的破坏最少产品的破坏最少; 对对pH值和温度等外界条件要求低值和温度等外界条件要求低; 不残留细胞碎片。不残留细胞碎片。缺点：缺点：溶酶价格高，通用性差（不同菌种需选择不同的酶），溶酶价格高，通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。产物抑制的存在。 如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。抑制葡聚糖酶。2、破碎率的测定 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即百分比
9、数，即:Y(%)(N0- N)/N0 100 由于由于N0(原始细胞数量原始细胞数量)和和N (经经t时间操作后保留下时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此破碎不能很清楚的确定，因此破碎率的评价非常困难。率的评价非常困难。 目前目前N。和和N主要通过下面的方法获得。主要通过下面的方法获得。 （1）、）、 直接测定法直接测定法 利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数，利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放的物质如的物质如DNA和其他聚合物
10、组分会干扰计数，此时可和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开，用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开，以便于计数。以便于计数。 例如例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜色，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜色，利用利用革兰氏染色法革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。损害的酵母细胞呈现亮红色。（2）、测定释放的蛋白质量或酶的活力）、测定释放的蛋白质量或酶的活力 测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬
11、浮液离心，测定上清液中蛋白通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与质的含量或酶的活力，并与100破碎所获得的标准数值破碎所获得的标准数值比较；比较；（3）、测定导电率）、测定导电率 导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。 因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此应预先采用其他方法来进行标化。
12、应预先采用其他方法来进行标化。三、材料准备三、材料准备1. 酵母、巨大芽孢杆菌等。2. 超声波破碎机、离心机、紫外分光光度计、研钵。3. 烧杯（250ml）、塑料管（80ml）。4. 无菌水、冰水、0.2mol/l磷酸盐缓冲液。5. 显微镜（油镜）。6. 载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯及火柴。7. 结晶紫染液、Lugols碘液、95乙醇、番红染液。8.溶菌酶四、实验步骤四、实验步骤1、研磨法 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中，37振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎缓冲
13、液中。 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研磨10min。 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1、媒染1、脱色20-30、复染4）、镜检计数。2.超声波破碎细胞培养和收集：将活化巨大芽孢杆菌种接入肉汤液体培养基中，37振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎缓冲液中。超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1、媒染1、脱色20-30、复染4）、镜检计数。3.酶解法 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤液体培养基中，37振荡培
14、养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎缓冲液中。 酶解：称取适量酶，加入菌悬液中，使酶最终浓度为4mg/ml，37条件下反应1h。 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1、媒染1、脱色20-30、复染4）、镜检计数。附录缓冲液配制 pH 7.5， 0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的配制： 0.2mol/LNa2HPO4溶液（ 84.0 mL）0.2mol/LNaH2PO4溶液（ 16.0 mL） 混匀NaH2PO42H2O：Mr=178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L;
15、 NaHPO412H2O：Mr=358.22，0.2mol/L溶液为71.64g/L; NaH2PO42H2O：Mr=156.03，0.2mol/L溶液为31.21g/L; NaH2PO4H2O：Mr=138.01，0.2mol/L溶液为27.6g/L。超声波破碎机的使用步骤超声波破碎机的使用步骤1功率调整到最小值的位置。2设定：工作次数、超声时间（工作时间）、间隙（间歇）时间。3打开开关，开机后电源指示灯亮。4保护复位；工作复位。5显示屏开始显示工作的设定数据。6调节功率至所需数值。7工作至总次数为零时候，仪器处于停振状态。如重复实验，可按工作复位键；否则，关机，并切断电源。超声波破碎机使用注意事项超声波破碎机使用注意事项 1. 按样品的多少选择适当的容器（试管或各种烧杯及离心管），固定好，调节好振动系统的位置。2. 变幅杆末端插入样品液面1015mm，并使其在容器的中心位置，不得让变幅杆与容器相接触。变幅杆末端离容器一般应大于30mm，量小时，功率开小情况下可大于10mm。3. 设定：工作时间不宜开的过长，110秒内选用；间隙时间应大于工作时间。4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰浴冷却。作业1. 细胞破碎的方法有哪些？2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
