1、选修选修3 3 现代生物技术专题现代生物技术专题专题专题1. 1.基因工程基因工程1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具一、基因重组技术的概念一、基因重组技术的概念二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具一、基因工程的概念一、基因工程的概念1 1手段：通过体外手段：通过体外_和和_等技等技术，赋予生物以新的术，赋予生物以新的_。2 2目的：按照人们的愿望进行严格的设计，创造出目的：按照人们的愿望进行严格的设计，创造出更符合人们需要的新的更符合人们需要的新的_ _和和_。3 3设计和施工水平：设计和施工水平：_水平，因此，基水平，因此，基因工程又叫做因工
2、程又叫做DNADNA重组技术。重组技术。DNADNA重组重组转基因转基因遗传特性遗传特性生物类型生物类型生物产品生物产品DNADNA分子分子1 1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”( (又称限制酶又称限制酶) )。(1)(1)来源：主要是从来源：主要是从_中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。(2)(2)功能：能够识别双链功能：能够识别双链DNADNA分子的某种特定的核苷酸序分子的某种特定的核苷酸序列 ， 并 且 使 每 一 条 链 中 特 定 部 位 的 两 个 核 苷 酸 之 间 的列 ， 并 且 使 每 一 条 链 中 特 定 部 位 的 两 个 核 苷 酸 之 间
3、的_断开，因此具有断开，因此具有_性。经限制酶切割产性。经限制酶切割产生的生的DNADNA片段末端通常有两种形式：片段末端通常有两种形式：_和和_。原核生物原核生物磷酸二酯键磷酸二酯键专一专一黏性末端黏性末端平末端平末端前者是限制酶在它识别序列的前者是限制酶在它识别序列的_将将DNADNA的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识别序列的别序列的_切开产生的。切开产生的。中心轴线两侧中心轴线两侧中心轴线处中心轴线处(3)(3)种类种类EcoREcoR和和SmaSma限制酶识别序列均为限制酶识别序列均为6 6个核苷酸，其中个核苷酸，其中EcoREcoR识别的序列
4、为识别的序列为_，从，从_和和_直接切割，产直接切割，产生的末端为生的末端为_;Sma_;Sma识别的序列为识别的序列为_,_,从从_和和_直接切割，产生的末端为直接切割，产生的末端为_GAATTCGA黏性末端黏性末端CCCGGGCG平末端平末端2 2DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”。(1)(1)作用：将作用：将_“_“缝合缝合”起来，恢复被限制酶起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的切开的两个核苷酸之间的_，形成重组，形成重组DNADNA分子。分子。(2)(2)种类。种类。E Ecolicoli DNA DNA连接酶：只能缝合连接酶：只能缝合DNADNA片段的片段的_。双链
5、双链DNADNA片段片段磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端黏性末端T T4 4DNADNA连接酶：既可缝合连接酶：既可缝合DNADNA片段的黏性末端，又片段的黏性末端，又可缝合可缝合DNADNA片段的片段的_，但连接后者的效率，但连接后者的效率_。3 3运载体运载体“分子运输车分子运输车”。(1)(1)作用：携带作用：携带_进入受体细胞。进入受体细胞。(2)(2)种类：质粒、种类：质粒、_的衍生物、动植物病毒等。的衍生物、动植物病毒等。平末端平末端低低外源基因外源基因噬菌体噬菌体 能 够 在 受 体 细 胞 中 进 行 能 够 在 受 体 细 胞 中 进 行 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
6、_ _ _ _ _ _ _ _ _ ， 或 整 合 到， 或 整 合 到_上，随染色体上，随染色体DNADNA进行同步复制。进行同步复制。有一个至多个有一个至多个_切割位点，供外源基因插入。切割位点，供外源基因插入。具有特殊的具有特殊的_，供重组，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。自我复制自我复制染色体染色体DNADNA限制酶限制酶遗传标记基因遗传标记基因(3)(3)特点特点: :一、目的基因的获取一、目的基因的获取有了目的基因，我们才能赋予有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传一种生物以另一种生物的遗传特性。特性。使目的基因在受体细胞中稳使目的基因在受体细胞中稳定存
7、在，并可进行遗传、表定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用达和发挥作用 。载体进入受体细胞稳定表达，载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。确表达。1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）目的基因（一）目的基因 主要指的
8、是编码蛋白质的主要指的是编码蛋白质的结构基因结构基因，也可以，也可以是一些具有调控作用的因子（是一些具有调控作用的因子（调节基因调节基因）。）。 对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该对基因组中某个基因通过克隆扩增，获得该基因进行研究或应用称这种基因为目的基因。基因进行研究或应用称这种基因为目的基因。1. 1.概念概念 凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都称凡是编码阻遏或激活结构基因转录的蛋白质的基因都称为调节基因。为调节基因。把基因区分为结构基因和调节基因把基因区分为结构基因和调节基因若着眼于这些基因所编码的蛋白质的作用：若着眼于这些基因所编码的蛋白质的作用：2.2.结构基因和调节
9、基因结构基因和调节基因 凡是编码酶蛋白、血红蛋白、胶原蛋白或晶体蛋白等蛋凡是编码酶蛋白、血红蛋白、胶原蛋白或晶体蛋白等蛋白质的基因都称为结构基因。白质的基因都称为结构基因。（一）目的基因（一）目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取启动子启动子终止子终止子启动子启动子终止子终止子 若转入目的基因都是为了合成所需的酶、抗体、蛋白质若转入目的基因都是为了合成所需的酶、抗体、蛋白质激素、结构蛋白质，则需转入结构基因。激素、结构蛋白质，则需转入结构基因。 若转入目的基因是为了调控某个结构基因的活动，则可转若转入目的基因是为了调控某个结构基因的活动，则可转入调节基因。入调节基因。2.2.结构基因和调
10、节基因结构基因和调节基因（一）目的基因（一）目的基因从基因工程的目的看从基因工程的目的看一、目的基因的获取一、目的基因的获取（1 1）基因文库的概念）基因文库的概念（二）目的基因的获取途径（二）目的基因的获取途径1. 1.从基因文库中获取从基因文库中获取一、目的基因的获取一、目的基因的获取 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到受片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因组文库基因组文库部分基因文库（部分基因文库（cDNAcDNA文库）文库）（2 2）基因文库的类型）基因文
11、库的类型（3 3）从基因组文库中获取目的基因）从基因组文库中获取目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因组文库概念基因组文库概念 如果基因文库包含了某种生物的所有基因，那么，如果基因文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。这种基因文库叫做基因组文库。一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存cDNAcDN
12、A文库的概念文库的概念（4 4）从）从cDNAcDNA文库中获取目的基因文库中获取目的基因（二）目的基因的获取途径（二）目的基因的获取途径 如果基因文库只包含了某种生物的一部分基因，如果基因文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。这种基因文库叫做部分基因文库。一、目的基因的获取一、目的基因的获取cDNAcDNA文库的构建文库的构建提取某种生物的某器官或提取某种生物的某器官或特定特定发育时期的发育时期的mRNAmRNA重组载体重组载体与载体连接与载体连接双链双链cDNAcDNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶cDNAcDNA文库文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存单链单链
13、DNADNA反（逆）转录酶反（逆）转录酶反（逆）转录法反（逆）转录法一、目的基因的获取一、目的基因的获取非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区RNARNA聚合酶聚合酶转录转录mRNA前体前体剪接有关的酶剪接有关的酶剪接剪接mRNA单链单链DNA逆转录酶逆转录酶逆转录逆转录DNA聚合酶聚合酶复制复制cDNA不含不含非编码非编码系列系列。即不。即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子cDNAcDNA文库的构建文库的构建反反（逆）转录法（逆）转录法一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcD
14、NA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库文库小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以区别区别一、目的基因的获取一、目的基因的获取联系联系基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库文库一、目的基因的获取一、目的基因的获取（二）目的基因的获取途径（二）目的基因的获取途径2.2.鸟枪法鸟枪法 这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中
15、目标，都能把鸟打下来。粒击中目标，都能把鸟打下来。（1 1）概念）概念 又叫又叫“散弹射击法散弹射击法”。将目的。将目的DNADNA随机地处理成大小随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。( (直接分离法直接分离法) )一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.鸟枪法鸟枪法（2 2）过程）过程供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段限制酶限制酶受体细胞受体细胞导入导入产生特定性状产生特定性状目的基因目的基因分离分离一、目的基因的获取一、目的基因的获取表达运载体表达运载体与载体连接与载体连接DN
16、ADNA连接酶连接酶2.2.鸟枪法鸟枪法（2 2）过程）过程一、目的基因的获取一、目的基因的获取3.3.化学合成法化学合成法（二）目的基因的获取途径（二）目的基因的获取途径一、目的基因的获取一、目的基因的获取已知序列已知序列DNADNA合成仪合成仪3.3.化学合成法化学合成法已知序列已知序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测一、目的基因的获取一、目的基因的获取（二）目的基因的获取途径（二）目的基因的获取途径4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（1 1）概念）概念 多聚酶链式反应，是
17、一种用于放大扩增特定的多聚酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNADNA片片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNADNA复制，复制，PCRPCR的最大特点，是能短时间内将微量的的最大特点，是能短时间内将微量的DNADNA大幅增加。大幅增加。 这项技术是由穆里斯（这项技术是由穆里斯（K.Mullis）等人于）等人于1988年发明的，年发明的，为此，穆里斯在为此，穆里斯在1993年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。一、目的基因的获取一、目的基因的获取4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（2 2）原理）原理 DNA
18、 DNA双链半保留复制的原理，在体外将基因的核苷酸双链半保留复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。（3 3）前提条件）前提条件一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。一、目的基因的获取一、目的基因的获取（4 4）条件）条件四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物（左引物和右引物）：引物（左引物和右引物）：热稳定热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）模板模板DNADNA： 原原 料：料：4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一
19、小段单链一小段单链DNADNADNADNA聚合酶（耐高温）：聚合酶（耐高温）：目的基因目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（5 5）扩增方式）扩增方式（6 6）结果）结果以指数方式扩增，即以指数方式扩增，即2 2n n（n n为扩增循环的次数）。为扩增循环的次数）。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。一、目的基因的获取一、目的基因的获取4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（7 7）过程（变性、退火、延伸）过程（变性、退火、延伸）一、目的基因的获取一、目的基
20、因的获取变性变性 加热至加热至90909595双链双链DNADNA模板在热作用下，氢键断裂，模板在热作用下，氢键断裂，形成单链的形成单链的DNADNA； 冷却至冷却至555560 60 引物与模板的单链引物与模板的单链DNADNA的特定互补部的特定互补部位相配对和结合，形成局部双链；位相配对和结合，形成局部双链；退火退火4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（7 7）过程（变性、退火、延伸）过程（变性、退火、延伸）一、目的基因的获取一、目的基因的获取 加热至加热至70707575在在TaqTaq酶酶的作用下，以目的基因为模板，的作用下，以目的基因为模板，合成互补的新合成互
21、补的新DNADNA链链 。延伸延伸一、目的基因的获取一、目的基因的获取反应的条件反应的条件热变性热变性退火（复性）退火（复性）延伸延伸（7 7）过程）过程4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取（7 7）过程）过程4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一、目的
22、基因的获取一、目的基因的获取（7 7）过程）过程理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取（8 8）扩增结果的曲线图）扩增结果的曲线图具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。好、易自动化等突出优点。4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（9 9）优点）优点一、目的基因的获取一、目的基因的获取（1010）PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较
23、复制的比较DNADNA复制复制 PCRPCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATPATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物引物DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋边复制边解旋边复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子热稳定的热稳定的DN
24、ADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶、解旋酶等聚合酶、解旋酶等4.4.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建小结小结从基因文库中获取从基因文库中获取鸟枪法获取鸟枪法获取化学合成法获取化学合成法获取PCRPCR技术获取技术获取从基因组文库中获取从基因组文库中获取从从cDNAcDNA文库中获取文库中获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。也是基因工程的核心。二、基因表达载体的
25、构建二、基因表达载体的构建1. 1.过程过程（1 1）用一定的）用一定的限制酶限制酶切割质粒，使切割质粒，使其出现一个切口，露出其出现一个切口，露出黏性末端黏性末端。（2 2）用）用同一种限制酶同一种限制酶切断目的基因，切断目的基因，使其产生相同的使其产生相同的黏性末端黏性末端。（3 3）将切下的目的基因片段插入）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量质粒的切口处，再加入适量DNADNA连连接酶接酶，形成了一个重组，形成了一个重组DNADNA分子分子（重组质粒重组质粒）。）。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1. 1.过程过程质粒质粒DNADNA分子分子一个切口一个切口两个
26、黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶处理限制酶处理同一种同一种二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建2.2.连接结果连接结果（1 1）运载体与目的基因的连接）运载体与目的基因的连接（2 2）目的基因与目的基因的连接）目的基因与目的基因的连接（3 3）运载体与运载体的连接）运载体与运载体的连接二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.目的目的（1） 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。遗传给下一代。（2 2）使目的基因
27、能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。为什么要构建表达载体？为什么要构建表达载体？作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（成任务吗？为什么？（P15P15） 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。体内没有表达。 然后在插入抗
28、虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子( (抗虫基抗虫基因首端因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。有抗虫能力。 科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终终止子止子( (抗虫基因尾端抗虫基因尾端) )，导入棉花受精卵，结果成长的，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。植株，有了抗虫能力。 二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建4.4.表达载体的结构表达载体的结构（2 2）启动子）启动子（3 3）终止子）终止子（4 4）标记基因）标记基因位于基因的首端位于基
29、因的首端, ,是是mRNAmRNA结合位点结合位点位于基因的末端位于基因的末端, ,终止转录终止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞（1 1）目的基因）目的基因 不可以。不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：（1 1）作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完）作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（成任务吗？为什么？
30、（P15P15）5.5.几个问题几个问题二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 a. a.生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因受体生物自身基因的启动的启动子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；b.b.通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；入受体生物中无法转录；c. c.目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；d.d.为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控为了增强目的基因的表达水平
31、，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；元件，如增强子等；e. e. 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：5.5.几个问题几个问题（2 2）表达载体为什么一定要有启动子？）表达载体为什么一定要有启动子？a. a.生物之间进行基因交流，只
32、有使用受体生物自身基因的启生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；动子才能有利于基因的表达；b.b.通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。列导入受体细胞无法转录。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。的基因的细胞筛选出来。（4 4）标记基因有什么作用？）标记基因有什么作用？5.5.几个问题几个问题 终止子是位于基因尾端的一段特殊的终止子是位于基因
33、尾端的一段特殊的DNADNA片断，能终片断，能终止止mRNAmRNA的转录。的转录。（3 3）终止子的作用是什么？）终止子的作用是什么？二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。终止子三部分结构。注意注意用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连接酶连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸
34、二酯键。将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携必需以表达载体的方式携带进去。带进去。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建（一）转化（一）转化 三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的的细胞的DNADNA而使它的基因型和表现型发生相应变
35、化的现象。而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。该现象首先发现于细菌。（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1. 1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（1 1）农杆菌转化法
36、）农杆菌转化法农杆菌农杆菌 是普遍存在于土壤中的一种革兰是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位（物的受伤部位（受伤处的细胞会分泌受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物、中性糖，从而使农大量酚类化合物、中性糖，从而使农杆菌移向这些细胞杆菌移向这些细胞），并诱导产生冠），并诱导产生冠瘿瘤或发状根。瘿瘤或发状根。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞根癌农杆菌根癌农杆菌 能在自然条件下趋化性地感染能在自然条件下趋化性地感染140140多种双子叶植物多种双子叶植物或
37、裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。 引发冠瘿瘤的原因是，引发冠瘿瘤的原因是，TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA上有上有8 8个左个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。发根农杆菌发根农杆菌 发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。其高度分支的根系。其RiRi质粒上有一段质粒上有一段T-DNAT-DNA。（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法三、将目的
38、基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有TiTi质粒和质粒和RiRi质质粒，其上有一段粒，其上有一段T-DNAT-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将可将T-DNAT-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。基础。原理原理 TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细可以转
39、移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的胞染色体的DNADNA上。上。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 科研人员将目的基因插入到经过改造的科研人员将目的基因插入到经过改造的T-DNAT-DNA区，借助农区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。叶植物
40、（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。原理原理三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞TiTi质粒质粒表达表达新性状新性状目的基因目的基因表达载体表达载体构建构建转入转入含有含有VirVir致病致病基因基因农杆菌农杆菌导入导入植物外植体细胞植物外植体细胞插入插入植物细胞染色植物细胞染色DNADNA新的植物个体新的植物个体植物组培技术植物组培技术转化过程转化过程: :为什么？为什么？为什么？为什么？转化过程转化过程: :DNA三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 利用农杆菌对植利用农杆菌对植物进行转化，首先物进行转化，首先将目的基因插入到将目的基因插入到TiTi质粒衍生的
41、转化质粒衍生的转化载体上，形成重组载体上，形成重组DNADNA，然后将重组，然后将重组DNADNA转入含有转入含有VirVir致致病基因的农杆菌，病基因的农杆菌，再通过上述农杆菌再通过上述农杆菌侵染植物外植体。侵染植物外植体。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化过程转化过程: : 植物伤口处的细胞分泌大量的植物伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物、中性糖酚类化合物、中性糖，酚类，酚类化合物如化合物如乙酰丁香酮（乙酰丁香酮（ASAS）和羟基乙酰丁香酮（）和羟基乙酰丁香酮（HO-ASHO-AS）等，等，一些中性糖如一些中性糖如L- L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-D-木糖木糖等，上述物
42、质既是根瘤农杆菌等，上述物质既是根瘤农杆菌的的趋化物趋化物，又是农杆菌中毒性基因，又是农杆菌中毒性基因VirVir表达的表达的诱导物诱导物，在它们的，在它们的作用下，导致作用下，导致T-DNAT-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。研究的加工和转移，从而侵染植物细胞。研究表明，作为主要诱导物的乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮等酚类表明，作为主要诱导物的乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮等酚类物质，主要在物质，主要在双子叶植物细胞壁中合成双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶，通常不存在于单子叶植物中，因此根瘤农杆菌不易直接侵染单子叶植物。植物中，因此根瘤农杆菌不易直接侵染单子叶植物。三、将目的基因导入
43、受体细胞三、将目的基因导入受体细胞为什么农杆菌只侵染双子叶植物和裸子植物而不能侵染单子为什么农杆菌只侵染双子叶植物和裸子植物而不能侵染单子叶植物呢？叶植物呢？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你认为应该怎样做？你认为应该怎样做？ 要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物。都可以侵染单子叶植物。 要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆使农杆
44、菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的菌的VirVir区（诱导性）的基因，使区（诱导性）的基因，使T-DNAT-DNA转移并插入到染色转移并插入到染色体体DNADNA上。上。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：但要注意两点：若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你认为应该怎样做？你认为应该怎样做？三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞优点优点 农杆菌农杆菌TiTi质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具质粒转化系统与其他基因转
45、化体系相比，具有许多突出的优点：有许多突出的优点： A. A.该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好；成功率高，效果好； B. B.农杆菌农杆菌TiTi质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；成熟，应用也最广泛；三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 C. C.农杆菌农杆菌TiTi质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此
46、转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料；此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料； D. D.农杆菌农杆菌TiTi质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。设备简单，易于推广。优点优点 农杆菌农杆菌TiTi质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点：有许多突出的优点：三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（2 2）基因枪法）基因枪法 该法又称粒子轰击，高速粒子喷该法又称粒子轰击，高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术，是由美康射技术或基因枪轰击技术，是由美康奈尔大学生物化学系奈尔
47、大学生物化学系John.C.SanfordJohn.C.Sanford等于等于19831983年研究成功。年研究成功。是是利用压缩气利用压缩气体产生的动力体产生的动力，将包裹在金属颗粒表，将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打入受体细胞中打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。使目的基因与其整合并表达的方法。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞定义定义 将直径将直径4um4um的钨粉或金粉在供体的钨粉或金粉在供体DNADNA中浸泡，然后用中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处
48、理多个细胞的优点，但转化效率较低。另外这种方法也用于基多个细胞的优点，但转化效率较低。另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。基因枪法过程基因枪法过程三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 植物花粉在柱头上萌发后，花粉植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物法就是在植物受粉后受粉后，花粉形成的，花粉形成的花花粉管还未愈合前粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，剪去柱头，然后，滴加滴加D
49、NADNA（含目的基因含目的基因），），经过珠心经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞胞壁的合子或早期胚胎细胞( (被整合到被整合到受体细胞的基因组中受体细胞的基因组中) )，随着受精卵的，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。发育而成为带转基因的新个体。过程过程（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞实例：抗虫棉的培育实例：抗虫棉的培育2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法）方法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞思考：为什么要用受精卵而不用
50、体细胞？思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？显微注射法显微注射法 将基因表达载体提纯，用显微仪注射到将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中中显微注射法（显微注射法（microinjectionmicroinjection） 是利用管尖极细（是利用管尖极细（0.10.1至至0.5m0.5m）的玻璃微量注射针，）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。源基因嵌
