1、第13章 DNA的生物合成复制（Replication）本章主要内容： 中心法则DNA复制的半保留性参与DNA复制的酶类和蛋白因子 DNA的复制过程 DNA的损伤和修复 反转录现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点-在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位， 而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。1.1.中心法则中心法则2. DNA的半保留复制的半保留复制半保留复制(semiconservative replication)：复复制时，亲代的双链制时，亲代的双链DNA解开成两条单解开成两条单链，然后各自作为模板指导合成新的互补链
2、。链，然后各自作为模板指导合成新的互补链。所形成的两个子代所形成的两个子代DNA分子与亲代分子与亲代DNA分子分子碱基顺序完全相同碱基顺序完全相同复制。每个子代复制。每个子代DNA分子中的一条链来自亲代，另一条链为新合成分子中的一条链来自亲代，另一条链为新合成的的半半保留。保留。2. DNA的半保留复制的半保留复制半保留复制实验依据1958年M.Messelson 等用实验加以证实双螺旋结构是半保留复制的分子基础半保留复制的意义复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。复制DNA的生物合成逆转录复制（复制（replication）：）：即DNA的生物合成，以亲
3、代DNA为模板合成两个完全相同的子代DNA分子的过程。复制的反应复制的反应d ATPd CTPd GTPd TTPDNA聚合酶聚合酶DNA模板模板DNA+（n1+n2+n3+n4)PPiPPiPPi随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。随即被焦磷酸酶水解，从而推动聚合反应的进行。DNA 复制是在酶的催化下的脱氧核苷酸聚合复制是在酶的催化下的脱氧核苷酸聚合过程。需要过程。需要4种种dNTP为底物外，还需要多种酶、为底物外，还需要多种酶、蛋白因子、亲代蛋白因子、亲代DNA单链模板及单链模板及RNA引物。引物。3. DNA的复制过程的复制过程3.1 与复制有关的酶和因子原核生物：以大肠杆菌为例
4、1. 原料： 4种dNTP2. 解开成单链的DNA模板3. 引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的 3-OH。4. 引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物5. DnaA蛋白， 与复制起始部位上（Ori C）特定的序列结合。E.Coli上固定的复制起始点称为 Ori.C6. DnaB （解螺旋酶 helicase ，rep 蛋白）：由多种蛋白因子协助在复制的起始点上解开双螺旋。7. 单链结合蛋白（SSB，single strandedbinding protein）：稳定已经解开成两股的DNA单链，防止其退火复性。8. 拓扑异构酶（DNAt
5、opoisomerase）拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的现象。拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。I 型酶II 型酶DNA拓扑异构酶（DNAtopoiSOmerase）108局部解链后9. DNA聚合酶（DNA polymerase）全称：依赖全称：依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 （DNA-dependent DNA polymerase, DNA-pol或或DDDP）DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNA聚合酶：聚合酶：聚合酶 I ：用于切除引物
6、RNA,并填补留下的空隙53 聚合酶活性，延伸多核苷酸链35 外切酶的作用，切除可能错配的核苷酸53 外切酶的作用是切除引物小片段323个氨基酸5 核酸外切酶活性大片段/ Klenow 片段604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶聚合酶II ：活性弱53 聚合酶活性，延伸多核苷酸链3 5 核酸外切酶活性聚合酶III ：主要的复制酶，并有校读、纠错的功能53 聚合酶活性，延伸多核苷酸链，活性很强，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料 dNTP与游离的3 -OH上连接，同时释出一个PPi 。35 核酸外切酶活性，切除可能错配的核苷酸DNA-po
7、l III:由由10种种亚基组成的不对称聚合体亚基组成的不对称聚合体 催化效率最高催化效率最高其中其中亚基具有亚基具有53聚合聚合DNA的酶活性，因而具有的酶活性，因而具有复制复制DNA的功能；而的功能；而亚基具有亚基具有35外外切酶的活性，因而与切酶的活性，因而与DNA复制的校正功复制的校正功能有关能有关。负责链的延长负责链的延长(活性高活性高)切去引物物切去引物物RNARNA，补上，补上正确的的正确的的DNADNA片段片段与修复有关与修复有关(活性低活性低)DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶原原核核生生物物 DNADNA聚合聚合酶酶53533535核酸外切核酸外切 核酸外切核
8、酸外切聚合聚合功功 能能DNA聚合酶聚合酶 5353大肠杆菌3种DNA聚合酶的性质比较催化活性催化活性真核生物的DNA聚合酶在复制延长中起催化作用在没有其他DNA-pol时才发挥催化作用在线粒体DNA复制中起催化作用在复制延长中起催化作用在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用DNA - pol DNA - pol DNA - pol DNA - pol DNA - pol 10. DNA连接酶（ligase）将不连续的DNA片段以磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATPSM哺乳动物的细胞周期哺乳动物的细胞周期DNA合成合成 (synthesis)
9、 期期G1分分为为起始、延长、终止三个阶段起始、延长、终止三个阶段3.DNA3.DNA的复制过程的复制过程G2聚合反应的特点：1、聚合反应具有方向性: 5 3 2、DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3 - OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。3.DNA3.DNA的复制过程的复制过程DNA聚合酶延伸多核苷酸链总是53方向聚合酶催化的链延长反应相关的几个概念：1、复制起始点（E.coli-OriC）复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。复制从特定的位点开始，这一位置叫复制原点。原核生物的原核生物的DNA上一般只有一个复制原点，但在上一般只有一个复制
10、原点，但在迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启迅速生长时期，第一轮复制尚未完成，就在起点处启动第二轮复制。动第二轮复制。真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制真核生物则有多个复制原点，可以同时启动复制过程。过程。5 3 新链3 5 3 2、复制叉（replication fork）复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种 Y字形的结构称为复制叉。5 3 5 亲代DNA复制方向A放射自显影图像orioriori复制示意B图形3、双向复制原核生物例如E.coli，是从固定的复制起始点开始，同时向两个方向进行复制，称为双向复制。复制起始点真核原核复
11、制叉3.DNA3.DNA的复制过程的复制过程3.2 DNA复制过程3.2.1 复制的起始需要解决两个问题：1、 DNA解开成单链，提供模板2、合成引物，提供3 -OH 末端DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白协助DnaB在多种蛋白质参与下，DNA双螺旋解开，形成单链SSB维持单链稳定OH合成引物Dna ADna B、 Dna CDNA拓扑异构酶引物酶SSB5 3 3 5 总结：复制的起始在原核生物只有一个起始点（Ori.C），而在真核生物有多个起始点。 DnaA， DnaB（解螺旋酶，rep蛋白）和DnaC参与解链，形成复制叉（replication fork）
12、，SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。辨认功能起始点并结合于位点解开DNA双链协助解螺旋酶催化RNA引物生成稳定解开的单链理顺DNA链E.coli的复制起始点名称DnaA蛋白(四聚体)解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）DnaC蛋白引物酶（ DnaG蛋白）SSB拓扑异构酶oriC（245bp的DNA组分）参与复制起始的各种因子和酶原核生物复制的起始535DNA-pol DNA-polDNA-polDNA-poldGTPdTTPdCTPd
13、TTPdATPdGTPdATPdCTP3.2.2 DNA链的延伸DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链3末端，使其不断延长。半不连续复制示意图这种前导链连续合成，随后链断续合成的这种前导链连续合成，随后链断续合成的方式，称为方式，称为半不连续复制半不连续复制。随后链中合成的多个随后链中合成的多个DNA 片段，称为片段，称为冈崎冈崎片片 段段 。 冈冈 崎崎 片片 段段 的的 长长 度度 原原 核核 细细 胞胞 中中 约约 1000-2000 个核苷酸，真核细胞中约个核苷酸，真核细胞中约100-200 个核苷个核苷酸。酸。复制叉的推进复制叉的推进 先导链的合成先导链的合成引物酶在复制原点附近
14、合成一段引物酶在复制原点附近合成一段 RNA引物；引物；DNA聚合酶聚合酶 (原核细胞原核细胞)在引物的在引物的3末末端逐个添加脱氧核苷酸。端逐个添加脱氧核苷酸。随着复制叉的推进，亲代随着复制叉的推进，亲代DNA双螺旋不双螺旋不断被解开，先导链也不断延伸。断被解开，先导链也不断延伸。 随后链的合成随后链的合成引物的合成引物的合成 ：随后链的每个冈崎片段都需要合成：随后链的每个冈崎片段都需要合成RNA引物。也是由引物酶催化。引物。也是由引物酶催化。冈崎片段的合成冈崎片段的合成：DNA聚合酶聚合酶(原核细胞原核细胞)在引物的在引物的3末端使末端使DNA链延伸，直至链延伸，直至抵抵达其下游的达其下游
15、的另一个冈崎片另一个冈崎片段的段的RNA引物的引物的5端。端。冈崎片段的连结冈崎片段的连结：DNA聚合酶聚合酶一面以其一面以其DNA聚合活聚合活性在上游冈崎片段的性在上游冈崎片段的 3-OH末端添加脱氧核苷酸，一面末端添加脱氧核苷酸，一面以以其其53核酸外切活性切除引物，直至将引物全部核酸外切活性切除引物，直至将引物全部切切除。除。DNA连接酶将最后的缺口补好。连接酶将最后的缺口补好。 先导链和随后链中先导链和随后链中DNA的延伸由同一个的延伸由同一个DNA聚合聚合酶酶全酶二聚体催化全酶二聚体催化随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方随后链的模板回折成环，从而使冈崎片段的延伸方向与先导链
16、的延伸方向一致，它们的向与先导链的延伸方向一致，它们的3末端分别落在末端分别落在DNA聚合酶聚合酶全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶全酶的双活性部位。因此，随着聚合酶的移动，两条链同时延伸。的移动，两条链同时延伸。复制叉的结构由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化在真核线性DNA的末段形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成端粒（telomere）。3.2.3 复制的终止连接酶将DNA片段连接起来完成复制DNA聚合酶I正在一边切除RNA引物，一边合成新的DNA以填补空隙引物冈崎片段大肠杆菌DNA的复制至少依赖三
17、种机制1、遵守严格的碱基配对规律。聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）。2、复制出错时有即时的校读功能3、切除引物4、聚合时的方向5、修复作用复制忠实性的保证聚合酶催化的链延长反应胸腺嘧啶二聚体DNA的突变有点突变（碱基的错配）、碱基的缺失、DNA片段的重排等形式。4. DNA的损伤与修复的损伤与修复4.1 DNA的损伤DNA的突变(损伤)大多数是自发的，是进化与分化的基础。环境中的理化因素，如紫外辐射引起两个嘧啶碱基的共价聚合。许多化学诱变剂，它们常是致癌物,如亚硝酸盐，常导致DNA突变。直接修复：如光复活酶,普遍存在在生物机体中,可以把嘧啶二聚体恢复正常状态。切除修复：
18、找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。重组修复： 先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤处留下缺口，先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口。SOS系统：复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。4. DNA的损伤与修复的损伤与修复4.2 DNA损伤的修复重组修复切除修复逆转录酶 ( reverse transcriptase )逆转录 ( reverse transcription )以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。逆转录酶逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶5. 逆转录作用逆转录作用以RNA为模板合成D
19、NA逆转录也称反转录，是某些生物（如鸡的肉瘤病毒、HIV等）的特殊复制方式。它们的遗传信息载体是RNA而不是DNA。因此，在感染细胞时，首先经过逆转录作用成为双链DNA，才能整合到宿主基因组中去。这个过程由逆转录酶催化，它具有以RNA为模板合成DNA，水解杂交链上的RNA以及以DNA为模板合成DNA三种活性。逆转录现象和逆转录酶（reversetranscriptase）（H.Temin，1970）是分子生物学研究中的重大发现，是对经典中心法则重RNADNA以RNA为模板，合成 DNA的过程。反转录酶反转录酶有三个作用以RNA为模板合成 DNA(cDNA）水解RNA模板第二以新合成单链 DNA
20、为模板合成条DNA逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA 模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA*逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具有遗传物质的传代与表达功能。AAAASI核酸酶逆转录酶A AA AT T T T碱水解T T T TDNA聚合酶分子生物学研究可应用逆转录酶，合成DNA以mRNA为模板 ，逆转录合成与 mRNA 碱基序列互补的DNA链，称为cDNA complementaryDNA RNA杂交双链单链DNA双链DNA细胞中试管内聚合酶连锁反应DNAchain（polymerasereactionPCR,）是一个温度和时间可以控制的反应体系含有双链DNA模板耐热的DNA聚合酶（如Taq酶）一对设计适当的 RNA引物，dNTP原料，并且过量经“变性-退火-延伸”多次循环使目的 DNA得以扩增8. 拓扑异构酶（DNA topoisomerase）拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的现象。I 型酶： 切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口的3端可通过自由转动一周再与5端磷酸连接，不需ATP。II 型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位，通过切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所要求的负超螺旋状态。
