1、3 微生物代谢调节微生物代谢调节第二节第二节 微生物次级代谢微生物次级代谢初级代谢与次级代谢定义：初级代谢与次级代谢定义： 初级代谢：初级代谢：为生物提供能量、合成中间体及其关键大分为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子，如子，如Pr、核酸等的各种相互关联的代谢网络、核酸等的各种相互关联的代谢网络(包括分解包括分解与合成与合成)。 次级代谢：次级代谢：主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常在生长后期开始形成。通常在生长后期开始形成。 次级代谢物：次级代
2、谢物： 也曾被称为也曾被称为分化代谢物分化代谢物(idiolites)、特殊代谢物。、特殊代谢物。 分化代谢物是指在最低培养基上给突变株提供次级分化代谢物是指在最低培养基上给突变株提供次级代谢物的前体才能形成的。代谢物的前体才能形成的。 微生物产生的次级代谢物有：微生物产生的次级代谢物有：抗生素抗生素色素色素生物碱生物碱毒素毒素、种类繁多，结构特殊，含不常见化合物：、种类繁多，结构特殊，含不常见化合物：一、一、 微生物次级代谢的特性微生物次级代谢的特性例如：例如： 氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、戊二酰胺、吲哚衍生物、内酯、萘、角生物碱、戊二酰
3、胺、吲哚衍生物、内酯、萘、核苷、杂肽、吩嗪、聚乙炔、多烯、吡咯、喹核苷、杂肽、吩嗪、聚乙炔、多烯、吡咯、喹啉、萜烯、四环类抗生素等；啉、萜烯、四环类抗生素等； 、含有少见的化学键：、含有少见的化学键：例如：例如： -内酰胺环、聚乙烯和多烯的不饱和内酰胺环、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内酯的大环和含有普通键、大环内酯的大环和含有普通AA和经修和经修饰的饰的AA组成的环肽等；组成的环肽等； 、 一种一种M所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的化合物。化合物。举例：举例： 产黄青霉能产生产黄青霉能产生5种具有相同母核、不同侧链的天种具有相同母核、不同侧链的天然抗
4、生素，然抗生素，结构上的差别使它们具有不同的生物活性。结构上的差别使它们具有不同的生物活性。 组分的比例取决于遗传和环境因素，这是由于参与组分的比例取决于遗传和环境因素，这是由于参与次级代谢物合成的酶的专一性不强所致；次级代谢物合成的酶的专一性不强所致； 、 一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物。级代谢物。 例如：例如：灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等；灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等；、不同种类的、不同种类的微生物微生物亦能产生同一种次级代谢物亦能产生同一种
5、次级代谢物. . 例如：例如：如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；、 次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。 例如：例如： 生长可在生长可在0.3300 mmol/L磷酸盐浓度磷酸盐浓度下进行，而次级代谢物合成的最适浓度为下进行，而次级代谢物合成的最适浓度为0.110mmol/L。 研究微生物次级代谢的意义：研究微生物次级代谢的意义：二、二、 次级代谢物的生物合成次级代谢物的生物合成a) 获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用于设获得与次级代
6、谢有关的基础理论知识，并用于设计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改造它们，以获得所需的生物性质；造它们，以获得所需的生物性质；b) 有助于优化次级代谢产物的工业生产。有助于优化次级代谢产物的工业生产。c)c) 借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变株。株。 次级代谢物生物合成步骤次级代谢物生物合成步骤： 养分摄入；养分摄入； 通过中枢代谢途径养分转化为中间体；通过中枢代谢途径养分转化为中间体； 次级代谢物前体的生物合成
7、；次级代谢物前体的生物合成； 如有必要，改变其中的一些中间体；如有必要，改变其中的一些中间体； 前体进入次级代谢物生物合成专有途径；前体进入次级代谢物生物合成专有途径； 次级代谢的主要骨架形成后作最后的修饰，成为产物。次级代谢的主要骨架形成后作最后的修饰，成为产物。1、前体的定义、前体的定义（一）、（一）、 前体的概况和来源前体的概况和来源Rose的定义（的定义（1979）：）：前体前体(precursor)是在细胞内生成的，或由培养基是在细胞内生成的，或由培养基提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。Stanbury等的定义等的定义(1984)：前体指加入
8、到某一培养基中的一些化学物质被直接前体指加入到某一培养基中的一些化学物质被直接结合到所需产物中。结合到所需产物中。前体现代定义：前体现代定义： 指加入到发酵培养基中的某些化合物能被指加入到发酵培养基中的某些化合物能被M直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。变化，且具有促进产物合成的作用。 中间体：中间体： 指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。的终产物。 前体与中间体的区
9、别：前体与中间体的区别： 前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中去；有时指同一物质。去；有时指同一物质。 次级代谢物前体的种类：次级代谢物前体的种类： Betina认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的中间体：中间体：、糖类；、糖类；、莽草酸和、莽草酸和(或或)芳香芳香AA；、非芳香、非芳香AA；、C1化合物；化合物；、脂肪酸、脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸尤其是乙酸和丙酸)；、TCA环的中间体；环的中间体；、嘌呤和嘧啶。、嘌呤和嘧啶。 Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中等将可作为次级代谢物前
10、体的初级代谢的中间体分为：间体分为：、短链脂肪酸；、短链脂肪酸；、异戊二烯单位；、异戊二烯单位；、AA；、糖与氨基糖；、糖与氨基糖；、环己醇与氨基环己醇；、环己醇与氨基环己醇；、脒基；、脒基；、嘌呤与嘧啶碱；、嘌呤与嘧啶碱；、芳香中间体与芳香、芳香中间体与芳香AA；、甲基、甲基(C1库库)。 次级代谢物的生物合成过程除了在前体的形成和次级代谢物的生物合成过程除了在前体的形成和聚合过程外，遵循一般的生物合成规律。聚合过程外，遵循一般的生物合成规律。 次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和组成代谢紧密相关。谢和组成代谢紧密相关。 其前体通常是正常的
11、或经修饰的初级代谢的中间其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。体。小结：小结：（1）养分转化为中枢途径的中间体）养分转化为中枢途径的中间体2、前体的来源、前体的来源 糖经分解代谢反应转化为较小的糖经分解代谢反应转化为较小的5-C，4-C，3-C和和2-C单位单位(如戊糖，丁糖，丙糖，乙酸盐，如戊糖，丁糖，丙糖，乙酸盐，-KG，OXA等等)。 有些中间体可直接用作前体。但有些需经有些中间体可直接用作前体。但有些需经修饰才能作为前体。修饰才能作为前体。 （2）芳香中间体）芳香中间体A 莽草酸途径的中间体或终产物：莽草酸途径的中间体或终产物：形成许多次级代形成许多次级代谢物的芳香部分。谢物的
12、芳香部分。B 芳香氨基酸生物合成途径：芳香氨基酸生物合成途径：负责大多数放线菌和负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成。许多植物次生代谢物的生物合成。C C 聚多酮途径：聚多酮途径：大多数真菌产生的芳香代谢物是由大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚多酮途径合成的。乙酸通过聚多酮途径合成的。 举例：举例： 、氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生、氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生的。的。 、利福霉素的芳香成分来自莽草酸。、利福霉素的芳香成分来自莽草酸。 、绿脓菌素的吩嗪骨架源自邻氨基苯甲酸。、绿脓菌素的吩嗪骨架源自邻氨基苯甲酸。 、新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。、
13、新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。 、放线菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环源、放线菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环源白色氨酸。白色氨酸。 （3）经修饰的糖前体）经修饰的糖前体 、氨基糖苷类抗生素：、氨基糖苷类抗生素： 其糖其糖大多数来自葡萄糖，其碳架以整体方式结合到抗生素中。但往往需要经过修饰或转化。 糖的修饰：糖的修饰：差向异构化，异构化，氨化，去羟基，重排(生成分枝糖)，脱羧，氧化和还原。 糖的转化：糖的转化：以核苷二磷酸衍生物，如UDP-葡萄糖形式进行。UDP-葡萄糖由葡萄糖-1-P的葡萄糖基转给UTP获得。、大环内酯类抗生素的糖的生物合成、大环内酯类抗生素的糖的生物合成： 是
14、以TDP-衍生物作为中间体形式进行的。、己糖胺的形成：、己糖胺的形成： 是通过己酮糖和谷氨酰胺的转氨作用完成的。 、有些次级代谢物完全由糖组成、有些次级代谢物完全由糖组成(如氨基环多醇抗生素如氨基环多醇抗生素)；另一些糖以糖苷的形式存在于次级代谢物中。另一些糖以糖苷的形式存在于次级代谢物中。举例：举例：TDP-葡萄糖衍生物是泰乐菌素生物合成的中间体。葡萄糖衍生物是泰乐菌素生物合成的中间体。UDP-葡萄糖参与新生霉素的生物合成。葡萄糖参与新生霉素的生物合成。CDP-葡萄糖则参与核苷类抗生素。葡萄糖则参与核苷类抗生素。有些抗生素带有甲基化糖。有些抗生素带有甲基化糖。（5）甲基的来源）甲基的来源 抗
15、生素生物合成中的所有甲基化作用均以抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以Met作为甲基供体，通过作为甲基供体，通过甲基转移酶甲基转移酶进行。进行。 而而Met的甲基源自的甲基源自N5-四氢叶酸四氢叶酸。 转甲基时转甲基时Met先活化，即在先活化，即在Mg2+和和ATP存在下存在下生成高能甲基供体：生成高能甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以。以SAM进行甲基化后自己变成进行甲基化后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸腺苷酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。（1）抗生素建筑材料）抗生素建筑材料（二）、（二）、 前体的作用前体的作用例
16、如：例如： 丙酮酸可用于丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等等的合成，是几种的合成，是几种肽类抗生素肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要合成的重要中间体。中间体。 次级代谢物通常由次级代谢物通常由初级中间体初级中间体产生，将初级中间体转产生，将初级中间体转化为次级终产物有三个生化过程：化为次级终产物有三个生化过程：、生物氧化和还原；、生物氧化和还原；、生物甲基化；、生物甲基化；、生物卤化。、生物卤化。 、氧化还原反应：、氧化还原反应：一般涉及醇的氧化或羰基的还一般涉及醇的氧化或羰基的还原，双键的引入或还原，氧原子的引入和芳香环的氧化原，双键的引入或还原，氧原子的
17、引入和芳香环的氧化裂解，这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。裂解，这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。 、生物甲基化、生物甲基化是各种代谢物，特别是聚酮化物的是各种代谢物，特别是聚酮化物的生物合成中的重要反应。生物合成中的重要反应。 、卤化作用、卤化作用对分子中含卤元素对分子中含卤元素(大多数是氯大多数是氯)的次级的次级代谢物是很重要的。代谢物是很重要的。其特征如下：其特征如下：许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。例如：例如： 、大环内酯类抗生素：、大环内酯类抗生素：其糖苷配基是由脂肪酸衍生其糖苷配基是由脂肪酸衍生的，其糖部分是由葡萄糖
18、衍生的。的，其糖部分是由葡萄糖衍生的。 、真菌毒素和橘霉素：、真菌毒素和橘霉素：是由五个是由五个C2单位单位(Ac-CoA加加上上4个丙二酰个丙二酰CoA)，2个甲基和由个甲基和由C1库来的羧基合库来的羧基合成的。成的。 、新生霉素：、新生霉素：具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、莽草酸、莽草酸、GLN、C1库、库、Tyr和乙酸或和乙酸或Leu合成的。合成的。（2）诱导抗生素生物合成）诱导抗生素生物合成 前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下。中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下。例例
19、1： 在带小棒链霉菌中头霉素在带小棒链霉菌中头霉素C的一种前体，的一种前体，-氨基氨基己二酸是由赖氨酸合成途径来的。它与己二酸是由赖氨酸合成途径来的。它与Pr合成竞争此合成竞争此前体的供应。加入过量的前体的供应。加入过量的Lys， Lys途径中间体，二途径中间体，二氨基庚二酸或氨基庚二酸或-氨基己二酸到发酵液中可增加头霉素氨基己二酸到发酵液中可增加头霉素的发酵单位。的发酵单位。例例2： 产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素N，除去青霉素除去青霉素N的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。侧的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。侧链的置换取决于发酵液中含有适当的
20、前体，如苯乙酸或链的置换取决于发酵液中含有适当的前体，如苯乙酸或苯氧乙酸苯氧乙酸11则。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限则。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限制性苯乙酸的增加而提高制性苯乙酸的增加而提高例例3： L-Val被认为是环孢菌素被认为是环孢菌素A的前体和生物合成的诱的前体和生物合成的诱导物。加入导物。加入Val可促进可促进Tinflatum固定化细胞合成环固定化细胞合成环孢菌素孢菌素A。例例4： 赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入3-甲基甲基-3,5-二羟基戊酸克服。二羟基戊酸克服。例例5： 丙醇和丙酸具有促进红霉素生产的作用，丙酸的丙醇和丙酸具有
21、促进红霉素生产的作用，丙酸的作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全是由于起前体的作用，现已清楚，除了作为前体外，是由于起前体的作用，现已清楚，除了作为前体外，它还能诱导红霉素链霉菌的它还能诱导红霉素链霉菌的AC-CoA羧化酶。此诱导作羧化酶。此诱导作用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素D可可以阻抑这种作用。以阻抑这种作用。（3）前体与诱导物的区别）前体与诱导物的区别 诱导作用在次级代谢物的合成控制上
22、起重要作诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用还是前体的作用。用还是前体的作用。、诱导物与前体的作用时期不同。、诱导物与前体的作用时期不同。 一般把那些能在生长期内生产期前促进抗生素生物一般把那些能在生长期内生产期前促进抗生素生物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用，甚至作用，甚至Pr合成受阻的情况下也行。合成受阻的情况下也行。 、诱导物应能被非前体的结构类似物取代。、诱导物应能被非前体的结构类似物取代。 如如Met除了可作为头孢菌素合成的
23、前体，提供除了可作为头孢菌素合成的前体，提供S的的作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者的多寡影响头孢菌素的合成。的多寡影响头孢菌素的合成。 Met可被可被Leu取代。取代。 、诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。、诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。 如诱导链霉素形成的如诱导链霉素形成的A因子，其诱导系数为因子，其诱导系数为106。 （三）、（三）、 前体的限制性前体的限制性前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。例例1：在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈
24、促进苄青霉素的生产；素的生产；例例2：丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。例例3：肽类抗生素的形成中非蛋白的肽类抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限制成分通常是限制因素。因素。例例4：缺少缺少Ac-CoA会限制四环素的生产。会限制四环素的生产。例例5：金色链霉菌低产菌株的特征是金色链霉菌低产菌株的特征是Ac-CoA倾向于走倾向于走TCA循环而被氧化；高产菌株没有这一倾向。循环而被氧化；高产菌株没有这一倾向。例例6：诺尔斯链霉菌合成制霉菌素的能力的提高与其前诺尔斯链霉菌合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有关。体，丙二酸和甲
25、基丙二酸合成的增加有关。 （1）前体合成的分子调节机制前体合成的分子调节机制 如初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体，则如初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体，则低浓度的前体需先满足生长的需要。低浓度的前体需先满足生长的需要。 例例1、这在抗生素链霉菌的营养缺陷型的放线菌素生产这在抗生素链霉菌的营养缺陷型的放线菌素生产中获得证实。中获得证实。AA营养缺陷型所需的营养缺陷型所需的AA正好是放线菌素的正好是放线菌素的组成部分时，这种营养缺陷型必然是低产菌株。组成部分时，这种营养缺陷型必然是低产菌株。 例例2、低浓度的氯化物限制含氯的抗生素，灰黄霉素的低浓度的氯化物限制含氯的抗生素，灰黄霉素
26、的生产。生产。高浓度的前体是抗生素合成所必需的，除去前体生物合成高浓度的前体是抗生素合成所必需的，除去前体生物合成的反馈调节机制有可能使抗生素增产。的反馈调节机制有可能使抗生素增产。 例如：例如：金黄色假单孢菌的耐金黄色假单孢菌的耐Trp结构类似物的结构类似物的突变株的硝吡咯菌素高产原因是由于促进所需前体，突变株的硝吡咯菌素高产原因是由于促进所需前体，色氨酸的生物合成。色氨酸的生物合成。（2）前体导向抗生素的合成）前体导向抗生素的合成 次级代谢物的前体源自初级代谢，前体叉向次级次级代谢物的前体源自初级代谢，前体叉向次级代谢物合成途径的第一个酶往往是关键。代谢物合成途径的第一个酶往往是关键。 因
27、为：因为：它决定前体流向抗生素合成的数量，其代它决定前体流向抗生素合成的数量，其代谢流的分布和抗生素的产量。途径中可能存在其他限谢流的分布和抗生素的产量。途径中可能存在其他限制性酶。制性酶。 这些酶往往受到反馈、碳、氮或磷的调节。另一这些酶往往受到反馈、碳、氮或磷的调节。另一些酶可能受到高浓度前体的诱导。些酶可能受到高浓度前体的诱导。 引向初级和次级代谢物的支路途径的生理调节随不同引向初级和次级代谢物的支路途径的生理调节随不同的的M及其代谢途径而有所不同。及其代谢途径而有所不同。 例如：例如：莽草酸途径的关键中间体分枝酸在初级代谢中莽草酸途径的关键中间体分枝酸在初级代谢中一方面引向一方面引向P
28、he和和Tyr；另一方面导向对；另一方面导向对-羟苯甲酸和对羟苯甲酸和对-氨氨基苯甲酸；另一分枝途径形成各种吩嗪基苯甲酸；另一分枝途径形成各种吩嗪(phenazine)次级代次级代谢物和谢物和Trp。（3）添加前体的策略添加前体的策略 研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。 举例：举例：青霉素青霉素G生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵培养基中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。培养基中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。苯乙酸具有促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中和苯乙酸具有促进青霉素生物合
29、成的作用，可在基础料中和过程中添加，其理论用量为过程中添加，其理论用量为0.47g苯乙酸苯乙酸/g青霉素青霉素G；0.50g苯乙酸苯乙酸/g青霉素青霉素V。实际用量应考虑利用率。高产菌。实际用量应考虑利用率。高产菌株对前体的利用率株对前体的利用率(可可90)比低产菌株高许多。比低产菌株高许多。 添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的残留浓度在适当范围。残留浓度在适当范围。 例如：例如：苯乙胺浓度在苯乙胺浓度在0.050.08。 前体一旦合成，便流向次级代谢物生物合成的专用途前体一旦合成，便流向次级代谢物生物合成的专用途径。径。 在某些情况下
30、单体聚合成聚合物，如聚多酮、寡肽和在某些情况下单体聚合成聚合物，如聚多酮、寡肽和聚醚类抗生素等。这些特有的生物合成中间产物需作后几聚醚类抗生素等。这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰，进行的深度取决于产生菌的生理条件。步的结构修饰，进行的深度取决于产生菌的生理条件。 有些复杂抗生素是由来自不同生物合成途径的几个部有些复杂抗生素是由来自不同生物合成途径的几个部分组成的。分组成的。（四）、（四）、 把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径 了解这方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是专了解这方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是专用途径的第一个酶用途径的第
31、一个酶，因它决定了前体进入次级代谢物合，因它决定了前体进入次级代谢物合成途径的通量、中间体的流向和途径的生产能力。成途径的通量、中间体的流向和途径的生产能力。 途径的其他关键酶也可能是控制步骤，这类酶常受途径的其他关键酶也可能是控制步骤，这类酶常受碳、氮分解代谢物的阻遏以及磷和反馈调节。其中有些碳、氮分解代谢物的阻遏以及磷和反馈调节。其中有些酶可能受胞内积累的高浓度前体的诱导。酶可能受胞内积累的高浓度前体的诱导。例如：例如： 二甲基丙烯基色氨酸二甲基丙烯基色氨酸(DMAT)合成酶合成酶(麦角生麦角生物合成第一个酶物合成第一个酶)，苯恶嗪酮，苯恶嗪酮(phenoxazinone)合成合成酶酶(形
32、成放线菌素苯恶嗪酮生色团的酶形成放线菌素苯恶嗪酮生色团的酶)，脒基转移，脒基转移酶酶(L-Arg，磷酸肌糖胺脒基转移酶，是链霉素链，磷酸肌糖胺脒基转移酶，是链霉素链霉胍部分的生物合成的关键酶霉胍部分的生物合成的关键酶)，鸟苷三磷酸，鸟苷三磷酸-8-甲甲酰水解酶酰水解酶(催化吡咯嘧啶核苷类抗生素的吡咯环催化吡咯嘧啶核苷类抗生素的吡咯环)，对氨基苯甲酸合成酶对氨基苯甲酸合成酶(把分枝酸转化为对氨基苯甲把分枝酸转化为对氨基苯甲酸，是杀假丝菌素生物合成的第一个特异性酶酸，是杀假丝菌素生物合成的第一个特异性酶)（参阅表（参阅表3-4）。）。 次级代谢专用的关键酶通常受次级代谢物的控制：次级代谢专用的关键
33、酶通常受次级代谢物的控制：例例1：麦角生物碱生物合成的第一个酶受麦角生物碱生物合成的第一个酶受Trp或其类似物或其类似物的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的Trp库存量导致库存量导致DMAT合成酶的浓度增加。合成酶的浓度增加。 例例2：苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，受葡萄糖分解代谢物阻遏。受葡萄糖分解代谢物阻遏。 例例3：磷酸阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的磷酸阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的形成。形成。 通过前体单体聚合的次级代谢物有：通过前体单体聚合的次级代谢物有： 四环类、大
34、环内酯类、安莎霉素类、真菌芳香化合物四环类、大环内酯类、安莎霉素类、真菌芳香化合物的聚多酮类和肽类抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗的聚多酮类和肽类抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。生素。 这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。 （五）、（五）、 前体聚合作用过程前体聚合作用过程聚合反应是由高相对分子质量的合成酶催化的：聚合反应是由高相对分子质量的合成酶催化的：例如：肽类抗生素合成酶例如：肽类抗生素合成酶 聚多酮合成酶聚多酮合成酶 聚合后许多次级代
35、谢物的化学结构通过多步酶反聚合后许多次级代谢物的化学结构通过多步酶反应修饰完成。应修饰完成。（六）、（六）、 次级代谢物结构的后几步修饰次级代谢物结构的后几步修饰例例1： 在四环类抗生素生物合成中聚合的九酮化物中间在四环类抗生素生物合成中聚合的九酮化物中间体通过闭环转化为体通过闭环转化为6甲基四环化物，后者经几步转甲基四环化物，后者经几步转换，包括换，包括C-4的氧化，的氧化，C-7的氯化的氯化(金霉素合成的情况金霉素合成的情况下下)，C-4的氨化，随后在氨基上的甲基化和在的氨化，随后在氨基上的甲基化和在C-6上上(金色链霉菌金色链霉菌)、C-5上上(龟裂链霉菌龟裂链霉菌)的羟基化。的羟基化。
36、 例例2： 红霉素生物合成的最后几步红霉素生物合成的最后几步(即红霉内酯形成后即红霉内酯形成后)为连接两个脱氧糖，和这些糖的为连接两个脱氧糖，和这些糖的O-甲基，甲基，N-甲基或甲基或C-甲基化。甲基化。 例例3： 头孢菌素生物合成的最后几步为去乙酰氧头孢头孢菌素生物合成的最后几步为去乙酰氧头孢菌素菌素C(经闭环和扩环步骤产物经闭环和扩环步骤产物)被羟基化为去乙酰被羟基化为去乙酰头孢菌素头孢菌素C。 某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，（某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，（例如同例如同型肽型肽）。）。 许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。（许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。（例如，例如
37、，杂肽类抗生素是由氨基酸和脂肪酸组装成的杂肽类抗生素是由氨基酸和脂肪酸组装成的）。）。 （七）、（七）、 复合抗生素中不同部分的装配复合抗生素中不同部分的装配例例1：在缩酚：在缩酚(depsi)肽抗生素中肽抗生素中AA与羟酸连接。与羟酸连接。 例如，缬氨霉素含有乳酸和2-羟异戊酸(图3- 14.)。 例例2：链霉素、诺卡菌素：链霉素、诺卡菌素A、杀假丝菌素和新生霉素是由、杀假丝菌素和新生霉素是由几种不同前体组装的典型抗生素。几种不同前体组装的典型抗生素。 、链霉素：、链霉素：由由N-甲基甲基-L-葡萄糖胺、链霉糖和链霉胍葡萄糖胺、链霉糖和链霉胍三部分组成。三部分组成。 、新生霉素：、新生霉素：
38、由新生霉糖、香豆素、对氨基苯甲酸和由新生霉糖、香豆素、对氨基苯甲酸和异戊烯四个部分组成的。异戊烯四个部分组成的。、杀假丝菌素：、杀假丝菌素：由对氨基苯甲酸与由对氨基苯甲酸与4个丙酸，个丙酸，15个乙酸个乙酸和一个丁酸单位缩合组装的，并连接上一个罕见的碳霉糖和一个丁酸单位缩合组装的，并连接上一个罕见的碳霉糖胺胺。 、诺卡菌素：、诺卡菌素：由由L-高丝氨酸、修饰过的高丝氨酸、修饰过的L-对羟苯甘氨对羟苯甘氨酸酸、L-Ser和未经修饰的和未经修饰的L-对羟苯甘氨酸组成对羟苯甘氨酸组成 。 次级代谢物合成酶往往只具有次级代谢物合成酶往往只具有簇的专一性簇的专一性，即对基质，即对基质分子的某一部分有要求
39、，对分子的其他部分无绝对要求。分子的某一部分有要求，对分子的其他部分无绝对要求。（八）、（八）、 次级代谢物合成酶的专一性次级代谢物合成酶的专一性例如：例如：产黄青霉的青霉素酰基转移酶能催化青霉素产黄青霉的青霉素酰基转移酶能催化青霉素N N的的a-a-氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰基侧氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰基侧链。此反应的专一性较高，因它不能酰化链。此反应的专一性较高，因它不能酰化7-7-氨基头氨基头孢霉烷酸孢霉烷酸(7-ACA)(7-ACA)，但接受广泛的内源与外源酰基，但接受广泛的内源与外源酰基CoACoA衍生物。衍生物。 参与初级代谢物和次级代谢物生物合成的基参与初级代谢
40、物和次级代谢物生物合成的基本差别之一在于引物和延长单位的异质性。本差别之一在于引物和延长单位的异质性。 例如：例如：如由于缺少高度专一性，乙酰如由于缺少高度专一性，乙酰CoA、丙二酰、丙二酰CoA和丙二酰胺和丙二酰胺CoA可在四环类抗生素合成中作引物。同可在四环类抗生素合成中作引物。同样，样，杀假丝菌素合成中杀假丝菌素合成中几种芳香酰基几种芳香酰基CoA衍生物也可作引衍生物也可作引物。物。 例如：例如：大环内酯生物合成中的延长单位有丙二酸、甲大环内酯生物合成中的延长单位有丙二酸、甲基丙二酸和丁酸。基丙二酸和丁酸。 然而，不是所有参与次级代谢物合成的酶然而，不是所有参与次级代谢物合成的酶都缺乏基
41、质专一性。有些具有高度专一性。都缺乏基质专一性。有些具有高度专一性。 例例1：红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接受甲基丙二酰受甲基丙二酰CoA作为延长单位，而不用丙二酰作为延长单位，而不用丙二酰CoA单位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当单位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当的前体单位。的前体单位。 通过基因操纵可以改变次级代谢物合成酶的专通过基因操纵可以改变次级代谢物合成酶的专一性。一性。其突变株常能形成特殊的次级代谢物，形成新其突变株常能形成特殊的次级代谢物，形成新的终产物。的终产物。 第三节第三节 代谢工程代谢工程 代谢工程代谢工
42、程(metabolic engineering)是指藉某些特是指藉某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组组DNA技术来创造新的化合物。技术来创造新的化合物。 代谢工程的要素：代谢工程的要素：将分析方法运用于将分析方法运用于物流的定物流的定量化量化，用分子生物技术来，用分子生物技术来控制物流控制物流以实现以实现所需的遗所需的遗传改造传改造。3.3 代谢工程代谢工程 代谢工程所采用的概念来自代谢工程所采用的概念来自反应工程反应工程和用于生化和用于生化反应途径分析的反应途径分析的热力学热力学。它强调整体的代谢途径而不。它强调整体的代谢途径而不
43、是个别反应。是个别反应。 代谢工程涉及完整的生物反应网络、途径合成的代谢工程涉及完整的生物反应网络、途径合成的问题、热力学可行性、途径的物流及其控制。要想提问题、热力学可行性、途径的物流及其控制。要想提高某一方面的代谢和细胞功能应从整个代谢网络的反高某一方面的代谢和细胞功能应从整个代谢网络的反应而不是一个个反应去考虑。重点应放在途径物流的应而不是一个个反应去考虑。重点应放在途径物流的放大和重新分配上。放大和重新分配上。 想通过单个酶的超表达来提高代谢途径的物流是行不通想通过单个酶的超表达来提高代谢途径的物流是行不通的，除非此酶具有高的物流控制系数。假定能成功超表达途的，除非此酶具有高的物流控制
44、系数。假定能成功超表达途径受限制的酶，该酶固然不再受反馈抑制，但瓶颈可能落在径受限制的酶，该酶固然不再受反馈抑制，但瓶颈可能落在途径下游的酶上，从而导致代谢中间体的大幅度的增加。途径下游的酶上，从而导致代谢中间体的大幅度的增加。同同时和协调地超表达途径中的大多数酶，原则上可大大提高代时和协调地超表达途径中的大多数酶，原则上可大大提高代谢物流而不至于改变各代谢物的浓度。谢物流而不至于改变各代谢物的浓度。 另一种选择是增加途径产物的需求，这或许可通过提高另一种选择是增加途径产物的需求，这或许可通过提高产物的分泌速率办到。产物的分泌速率办到。 对代谢和信息途径的性质，它们的相互对代谢和信息途径的性质
45、，它们的相互作用及其物流的控制了解得很少。这方面的作用及其物流的控制了解得很少。这方面的了解对于运用重组了解对于运用重组DNA技术和与应用分子技术和与应用分子生物学有关的方法来合理修饰途径是必需步生物学有关的方法来合理修饰途径是必需步骤。骤。有关术语：有关术语： 途径途径(pathway)：指催化总的代谢物的转化，信息传递指催化总的代谢物的转化，信息传递和其他细胞功能的酶反应的集合。和其他细胞功能的酶反应的集合。 物流物流(通量通量)(flux)：指物质或信息通过途径被加工的速率，：指物质或信息通过途径被加工的速率，它与个别反应速率不同。它与个别反应速率不同。 代谢物流分析：代谢物流分析：一种
46、计算流经各种途径的通量的技术，一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。3.3.1 代谢通量的概念代谢通量的概念 代谢控制分析代谢控制分析(metabolic controlanalysis)的概念认为，的概念认为，物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，比他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的即用一途径的物流和以物流控制系数
47、来定量表示酶活之间的关系。关系。 物流控制系数物流控制系数(flux control coefficient，FCGs)是系统的是系统的性质，大体上可用物流的百分比变化除以一酶活性质，大体上可用物流的百分比变化除以一酶活(该酶能引该酶能引起物流的改变起物流的改变)的百分比变化表示。的百分比变化表示。 物流求和理论物流求和理论(flux summation theory)是如果将一代谢是如果将一代谢系统中的某一物流的所有酶的物流控制系数加在一起，其和系统中的某一物流的所有酶的物流控制系数加在一起，其和为为1。 弹性系数弹性系数(elascity coefficients)表示酶催化反应速率对代表
48、示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏性。弹性系数是个别酶的特性。谢物浓度的敏性。弹性系数是个别酶的特性。 物流分担比物流分担比(flux split ratio)是指途径是指途径A与途径与途径B之比，如之比，如葡萄糖葡萄糖-6-磷酸节上的物流分担比便是磷酸节上的物流分担比便是EMP途径物流途径物流/(pp途径途径物流物流)。 敏感性系数敏感性系数是个别酶的特性，表示酶催化反应速率对代是个别酶的特性，表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性。谢物浓度的敏感性。代谢工程可用于以下几个方面：代谢工程可用于以下几个方面： 改进由改进由M合成产物的得率和产率；合成产物的得率和产率； 扩大可利用基质范围；扩大可
49、利用基质范围； 合成对细胞而言是新的产物或全新产物；合成对细胞而言是新的产物或全新产物； 改进细胞的普通性能，如耐受缺氧或抑制性物改进细胞的普通性能，如耐受缺氧或抑制性物质的能力；质的能力；3.3.2 代谢工程的应用代谢工程的应用 减少抑制性副产物形成；减少抑制性副产物形成； 环境工程方面；环境工程方面； 药物合成方面，作为中间体的手性化合物的制药物合成方面，作为中间体的手性化合物的制备；备； 在医疗方面用于整体器官和组织的代谢分析，在医疗方面用于整体器官和组织的代谢分析，用于鉴别藉基因治疗或营养控制疾病的目标；用于鉴别藉基因治疗或营养控制疾病的目标； 信息传导途径方面，即信息流的分析，为了治
50、信息传导途径方面，即信息流的分析，为了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，需了解信息疗疾病而进行基因表达的分析和调节，需了解信息流的相互作用和控制。流的相互作用和控制。 代谢物流的定量代谢物流的定量是代谢工程的重要分析是代谢工程的重要分析技术，尤其与代谢物的生产研究有关，其目技术，尤其与代谢物的生产研究有关，其目标是使尽可能多的碳从基质流向代谢产物。标是使尽可能多的碳从基质流向代谢产物。 代谢物流分析代谢物流分析是一种定量计算通过各种是一种定量计算通过各种途径的物流的强有力的技术。途径的物流的强有力的技术。3.3.3 代谢代谢(物物)流分析流分析 用于代谢物流分析的方法是一种适用于所有主用于代
