1、3.1 植物组织培养 植物组织培养植物组织培养是指将植物组织（如花药组织、胚乳、皮层等）给予适当的培养条件下，诱导其长成新的完整植株的一种实验技术。 植物组织培养再生的植物“试管植物”。3.1.1 发展历史 1902年德国植物学家哈贝尔兰德(Haberlandt)提出了器官和组织可以不断分割直至单个细胞的观点。并首次分离植物并进行培养，但未获成功。被誉为“植物组织培养之父”。 1943年，美国怀特（White）正式提出植物细胞具有全能性，认为每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 1934年，荷兰植物学家温特温特发现了生长生长素素，即吲哚乙酸。 1948年，斯科克斯科克解
2、决了如何从离体组织和器官中诱导植物再生的问题，并确定了腺嘌呤腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件成的一个重要条件。 1958年，施图尔德施图尔德从胡罗卜根韧皮部愈伤组织获得单细胞，并诱导形成胚状体再生了植株。这是世界上首次通过实验证实首次通过实验证实了植物细胞具有全能性了植物细胞具有全能性。 20世纪60年代以来，植物组织培养植物组织培养开始走向大规模的应用阶段。组织培养技术被誉为农业发展史上的第四次绿色革命第四次绿色革命。 进行植物组织培养，只需要少量的材料就能获得大量的植株，不仅可以节约大量的种子、肥料，还节约了大量的耕地，因此可以在工厂中进行育苗。
3、3.1.2 植物组织培养再生植株的途径1、器官发生途径2、体细胞胚发生途径3.1.2.1 器官发生途径 植物的离体器官发生器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（ 愈伤组织） 分化形成不定根（adventitious roots） 、不定芽（adventitious shoots） 等器官的过程。 植物细胞脱分化是已有特定结构和功能的植物组织的细胞，在一定的条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。 愈伤组织：愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。的
4、细胞团。即即由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。 愈伤组织细胞是分化的，但还没形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。 愈伤组织可以用继代培养的方式长期保存，也可以通过悬浮培养而迅速增殖用作无性系；也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。 外植体：外植体：植物体上切取下来进行培养的部分组织或器官。即植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 继代培养：继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培
5、养或传代培养。离体培养条件下， 经过愈伤组织再分化器官一般要经过四个生长阶段。（一）启动期：诱导外植体细胞脱分化和分裂。（二）外植体经过诱导形成愈伤组织形成愈伤组织。（三）拟分生组织 的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后， 首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群， 通常称之为“生长中心”， 也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。（四）器官原基及器官形成器官原基及器官形成。通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式： 第一种方式是先芽后根先芽后根: 第二种方式为先根后芽先根后芽: 第三种方式是同时生根发芽同时生根发芽:在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联
6、系形成完整植株。 在有些情况下， 外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情况： 一是外植体中已存在器官原基， 进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株， 如茎尖、根尖分生组织培养； 另一种情况是外植体某些部位的细胞， 在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。 研究表明， 在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要的。在不经过愈伤组织的器官分化中，这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该细胞转变发育方式极性的确定。现在，有人把最先启动分裂的这
7、些细胞称之为感受态细胞。植物组织培养的基本步骤 （一）培养材料的采集 （二）培养材料的消毒 （三）制备外植体 （四）接种和培养 （五）根的诱导 （六）练苗（一）培养材料的采集1、受精卵2、发育中的分生组织：根尖、嫩茎、幼叶、花3、雌雄配子、单倍体细胞 其中茎尖最常用。（二）培养材料的消毒1、自来水冲洗 蒸馏水冲洗 无菌纱布或吸水纸吸干水分 消毒刀片切成小块。2、70%酒精浸泡消毒30-60s。3、漂白粉饱和液或0.01%升汞水中消毒10min。4、无菌水冲洗3-4次。（三）制备外植体 在无菌环境下，将已消毒的材料用无菌刀、剪、镊等，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳（叶片不需剥皮）。然后切成0
8、.2-0.5cm厚的小片。 操作中严禁用手接触材料。（四）接种和培养1、接种：无菌环境下，将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶接种4-10个。2、封口：接种后，瓶、管用无菌棉或盖封口，培养皿无菌胶带封口。3、温度：25左右。4、增殖：在新梢形成后需继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中。蝴蝶兰试管苗工厂化生产蝴蝶兰试管苗工厂化生产（五）根的诱导 继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转入生根培养基中进行生根培养。1月后可获健壮根系。（六）练苗 先将培养容器打开，于室内自然光照3天，后取出小苗，自来水冲洗掉根系上培养基，栽入消毒后的基质中。 移栽前注意遮荫，水分管理，保持较高空气湿度。
9、 3.1.2.2 体细胞胚发生途径 离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。 这一定义有以下几方面的界定： 其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用， 以区别于无融合生殖胚； 其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； 其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。（一）体细胞胚的形成途径1体细胞胚从外植体上直接发生 茎表皮、叶、子叶、下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体。如：在以叶片为外植体的培养中， 体细胞胚的直接形成可分为两个阶段： 1
10、）诱导期。在此阶段中，叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激， 进入分裂状态。2）是胚胎发育期。在这一阶段， 形成的瘤状物继续发育， 经过球形胚、心形胚等发育过程，最后形成体细胞胚。2悬浮培养细胞的体细胞胚胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中， 体细胞胚胎形成的细胞学观察表明， 其培养物中存在两种类型的细胞：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般不具备胚胎发生潜力； 二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力， 因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。 胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后， 其外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，
11、以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构， 以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。 通过悬浮细胞系再生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可以提高胚胎的生产效率。3经过愈伤组织的体细胞胚发生 经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段： 第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织； 第二阶段是诱导愈伤组织胚性化； 第三阶段是体细胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生， 进而发生体细胞胚。因此， 经过愈伤组织的体细胞胚胎发生，胚性愈伤组织的形成是培养的关键。进而发生原胚，经过不同时期完成体细胞胚胎发育 4、
12、单细胞发生途径主要指小孢子或大孢子细胞培养产生胚状体。5、原生质体发生途径原生质体是去掉细胞壁后裸露的球形细胞。培养植物原生质体，再生细胞壁后，经过分裂产生的细胞团也可以形成胚状体。3.1.3 植物组织培养的培养基1）无机盐：大量元素（氮、硫、磷、钾、钙、镁）、微量元素（铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼）。一般只含无机盐的培养基叫基本培养基，只有很少几种植物组织能够培养和维持下去。2）有机物：糖类、氨基酸、维生素、醇类。3）调节物：生长素、细胞分裂素、赤霉素 注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。 植物激素：自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的
13、微量有机物。 包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等。 生长素：促进细胞分裂、诱导根的分化。常用的有吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA) 细胞分裂素：促进细胞分裂、诱导芽的形成。常用的有6-苄氨基嘌呤（BA）、6-呋喃氨基嘌呤（又称激动素，KT）常用培养基（1）富盐平衡培养基：MS、LS、BL、BM、ER（2）高硝态氮培养基：B5、N6、SH（3）中盐培养基：Nitsch、Miller、H（4）低盐培养基：White、WS、HE、HB3.1.4 植物组织培养问题分析（一）起始材料对器官分化的影响1母体植株的遗传基础2外植体的类型：外植体
14、对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲，生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具体到不同的植物类型则有较大差异。 外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。1974 年Tran Thanh Van 等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养，结果不同部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。（二）激素对器官分化的调控 激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化，在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中， 生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素， 在离体
15、器官分化调控中占有主导地位。 离体培养中， 外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。（三）光照对器官分化的影响 光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。 由于培养条件下光合作用能力较低，因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。 光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。3.2 植物胚胎培养 植物胚胎培养：指对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。1、成熟胚培养：指子叶期至发育成熟的胚的培养。2、幼胚培养：指早期原胚、球性期胚、心形期胚、鱼雷期胚的培养。3、胚乳培养：指处于细胞期的胚乳组织
16、的离体培养。4、胚珠和子房培养：胚珠培养指未受精或受精后的胚珠的离体培养。子房培养指授粉和未授粉的子房的离体培养。3.3 毛状根培养 毛状根：又名发状根，是植株或组织、器官受到发根农杆菌感染后而形成的类似头发一样的根组织。 发根农杆菌中有个Ri质粒， Ri质粒具有两个功能区，其中T-DNA区上有生长素合成基因，生长素可以诱导根的形成。三种毛状根培养方法1、外植体接种法：取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与发根农杆菌共培养2-3天，将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养，经过多次继代培养可产生毛状根。2、茎杆接种法：将植物种子消毒后，在合适的培养基上萌发，长出无菌苗。取茎尖继续培
17、养，等无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛状根。3、原生质体-农杆菌共培养法：将原生质体培养3-5天后，加入发根农杆菌进行共培养，然后借助于转化后的细胞激素自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成功的细胞。分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛状根。3.3.2毛状根培养的生物反应器 毛状根外形像毛发，容易交织缠绕，所以反应器的内部需要特殊设计满足毛状根的空间分布的均匀性问题。 超声雾化生物反应器分两类：1、雾化设备与培养装置一体化设计2、雾化设备与培养装置分开设计3.3.3 毛状根培养生产次级代谢产物 青蒿毛状根：青蒿素（治疗疟疾） 长春花毛状根：长春花碱（治疗癌症） 紫草毛状根：紫草宁（治疗肝炎） 人参毛状根：人参皂甙（增强体质）
