1、氨基酸的纸色谱分离一、目的要求1、了解纸色谱的基本原理;2、学习用纸色谱分离氨基酸的一般操作。二、基本原理在平面上进行分离的一种色谱方法纸色谱,主要包括纸色谱法和薄层色谱法。纸色谱是一种分配色谱,以滤纸作载体。滤纸是由纤维素组成,纤维素上有多个OH,能吸附水(一般纤维能吸附20%25%水份),作为固定相,与水不相混溶的有机溶剂作为流动相。当样品点在滤纸一端,放在一密闭器中,让流动相通过毛细管作用从滤纸一端,经过点样点流向另一端,样品中溶质在固定相水、流动相有机溶剂中进行分配,因样品中不同溶质在两相中分配系数不同,容易溶 于流动相中而难溶于水中的组份,随流动相往前移动速度快些,而易溶于固定相,难
2、溶于流动相的组份,随流动相向前移动速度慢些,从而达到将不同组份分离的目的。也可用测定Rf值方法对不同组分进行鉴定。纸色谱常用作多官能团或极性较大的化合物,如糖类、酯类、生手碱、氨基酸的分离。它因为设备简单、试剂用量少、便于保存,而为实验室常用方法。纸色谱的操作方分为滤纸和展开剂的选择、点样、展开、显色和结果处理(测量Rf值)五个部分。三、仪器、药品仪器:圆形滤纸(直径125mm)、培养皿一套、毛细管、电吹风、剪刀、直尺、铅笔、边长约2.5cm的普通滤纸。药品:标准液(1%亮氨酸/乙醇溶液、1%赖氨酸/乙醇溶液),样品混合液(含亮氨酸、赖氨酸的乙醇溶液),0.1%茚三酮乙醇溶液,展开剂(正丁醇冰
3、乙酸水=415,在分液漏斗中充分混合,静止分层,取上层作展开剂)。四、实验步骤1、点样取16cm6cm的中速色谱纸在距离底边2cm处用铅笔划起始线,在其电线上分别点上标准品(亮氨酸、赖氨酸)及混合样品溶样(样点间距1cm),点样直径控制2mm4mm,然后将其晾干。注意: 滤纸的选择与处理(1)滤纸要求质地均匀、平整、边沿整齐、无折痕、有一定机械强度;(2)滤纸纸质要求纯度高、无杂质,无明显萤光斑点,以免与色谱斑点相混淆;(3)滤纸纤维松紧要适宜,过紧则展开太慢,过松则斑点扩散。实验室用的滤纸可适用于一般的纸色谱分析。严格的研究工作中则需慎重选择层析用纸,并进行净化处理。例如分离酸性、碱性物质时
4、,为保持恒定的酸碱度,可将滤纸浸泡在一定pH值的缓冲液中,进行预处理后再用。2、展开向色谱缸中加25ml展开剂,盖上盖子约5min(使缸内展开剂蒸气饱和),将点样后的滤纸悬挂在缸内使纸底边浸入开展剂约0.3cm0.5cm,待溶剂前沿展开到合适部位(约8cm10cm),取出,划出前沿线。注意: 纸色谱必需在密闭的层层析缸中展开。在层析缸中加入适量的展开剂,将点好样的滤纸放入缸中。展开剂水平面应在点样纸以下,绝不允许浸泡样品线。3、显色当展开剂移动到离纸边沿约12cm时,取出滤纸,用铅笔小心划出溶剂前沿,然后冷风吹干。将展开完毕的滤纸,用烘箱烘干后,使展开剂挥发。用喷雾器将显色济0.1%茚三酮乙醇溶液均匀地喷洒到滤纸上,或用小滴管涂茚三酮到滤纸上。然后用热风吹干滤纸,直到斑点显色为止。也可置石棉网上方,小心用洒精灯烘烤,至斑点显色。画出斑点位置及颜色最深处,根据原点到斑点颜色最深处距离,原点到溶剂前沿距离,计算Rf值。原点溶剂前沿斑点图纸色谱图4、计算比移值Rf操作流程:五、注意事项1.吸样后的毛细管要垂直落在层析纸点样处,样点大小要基本一致;2.样点不要浸在展开剂中;3.点样毛细管不要张冠李戴,不要乱丢,用后随即放回原瓶;4.喷显色剂时,使层析纸湿润即可,切勿流淌,并迅速吹干;5.在层析纸制作、点样、显色、吹干及Rf值测定等操作过程中,手只能拿最上端,以防被手玷污。