1、实验一实验一 微藻的培养基配制微藻的培养基配制 一、实验目：一、实验目：掌握微藻的培养基配制方法。掌握微藻的培养基配制方法。以海水单胞藻培养液通用配方以海水单胞藻培养液通用配方“f/2”为例为例二、实验原理二、实验原理 藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，制定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试制
2、定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需求也有很多共同点，因而一些培养液配方（求也有很多共同点，因而一些培养液配方（如如F/2）可应用于多）可应用于多种藻类的培养。种藻类的培养。 进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适的配方，在的配方，在消毒水消毒水中按配方加入中按配方加入各种营养物质各种营养物质配成。所
3、加肥料配成。所加肥料应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥料污染。料污染。 绿藻培养液配方：绿藻培养液配方：海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，1960）：）： NaNO3 0.1g 2Na3C6H5O7 11H2O 0.02gK2HPO4 0.01gFe(SO4)3(1%溶液溶液) 10滴滴 海水海水 1000ml亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：NaNO3 0.05g 维生素维生素B12 200mgKH2PO4(1%溶液溶液) 0.005g 人尿人尿 2mlF
4、eC6H5O7 0.2ml 维生素维生素B1 200g 海水海水 1000ml培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能加入海泥抽出液加入海泥抽出液20ml，效果更好。，效果更好。硅藻培养液配方：硅藻培养液配方：艾伦艾伦-内尔森（内尔森（Allen-Nelson）培养液）培养液Allen，E.J.et al （1910）：A. KNO3 20.2g 纯水纯水 100mlB. Na2HPO4.12H2O 4.0g CaCl.6H2O 4.0gHCl（浓）（浓） 2.0ml 纯水纯水 80mlFeCl3（溶液）（溶液）
5、2.0mlB液的配制法：先把氧化钙液的配制法：先把氧化钙4g溶解于溶解于40ml纯水中。另外把磷酸氢二钙纯水中。另外把磷酸氢二钙4g溶溶解于解于40ml纯水中，再把三氯化铁溶融液纯水中，再把三氯化铁溶融液2ml，缓慢滴入，摇动，产生白色，缓慢滴入，摇动，产生白色沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两溶液混合。溶液混合。使用时，取使用时，取A液液2ml和和B液液1ml，加入，加入1000ml海水中，充分混合后加热消毒，海水中，充分混合后加热消毒，消毒后静置消毒后静置24h，然后将上层清夜倒出使用。，然后将
6、上层清夜倒出使用。 培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻烦，固体的营养元素一般都配成母液烦，固体的营养元素一般都配成母液（如浓缩（如浓缩1000倍的母倍的母液）液），在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主，在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，每组每组2种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般机物质也多
7、种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般生物因不能忍受而死亡。生物因不能忍受而死亡。 三、实验材料及用具三、实验材料及用具1、器材、器材电炉；灭菌锅；电炉；灭菌锅；pH计计 500ml 试剂瓶（每组试剂瓶（每组5个）；个）； 玻棒、玻棒、500ml烧杯、烧杯、50ml容量瓶（每组一个）容量瓶（每组一个）/牛皮纸、细绵绳牛皮纸、细绵绳 2、试剂：、试剂：蒸馏水、海水蒸馏水、海水各种试剂各种试剂NaNO3; NaH2PO4；FeCl3 EDTA；Na2SiO3.9H2O；盐酸硫铵素；盐酸硫铵素(VB1) ；Biotin VH三、实验步骤三、实验步骤（一）（一） F/2 (+ Si)培养基母液的配
8、制（用去离子水配制）培养基母液的配制（用去离子水配制）1.A液液 500 ml 1000倍倍NaNO3 37.5 g; NaH2PO4 2.5 g2.B液液 500 ml 1000倍倍Fe-EDTA 2.5 g (FeCl3 1.6 g + EDTA 0.9 g)3.C液液 500 ml 1000倍倍 Na2SiO3.9H2O 10 g4.D液液 500 ml 1000倍倍 盐酸硫铵素盐酸硫铵素(VB1) 5 mg (试剂试剂 50 mg/ml取取100 l) Biotin VH 0.025 mg (试剂试剂 0.1 mg/ml取取250 l) VB12 0.025 mg (试剂试剂 0.25
9、 mg/ml取取100 l)先用维生素分别用纯水溶解混合，稀先用维生素分别用纯水溶解混合，稀HCl将将pH调到调到4.55.0，最后用纯水，最后用纯水稀释至稀释至1升。膜过滤后冰冻保存。升。膜过滤后冰冻保存。5.E液液 500 ml 1000倍倍 CuSO4.5H2O 0.0098 mg； ZnSO4.7H2O 0.022 mg CaCl2.6H2O 0.01 mg； MgCl2.4H2O 0.180 mg Na2MoO4.2H2O 0.0063 mgA、B、D、E高压灭菌备用高压灭菌备用（三）（三）F/2培养基配制培养基配制1000 ml (1升升) F/2 (+ Si)培养基培养基 = 1
10、000 ml (1升升)过滤灭菌海水过滤灭菌海水 + 1ml A液液 + 1ml B液液+ 1ml D液液+ 1ml E液液 (+ 1ml C液液)注意：煮沸的海水放置凉后（注意：煮沸的海水放置凉后（50度以下）再加母液，否则会出现沉淀。度以下）再加母液，否则会出现沉淀。（二）海水处理（二）海水处理沉淀沉淀 砂池过滤砂池过滤 （抽滤）（抽滤）灭菌（海水放于三角瓶灭菌（海水放于三角瓶中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）实验二实验二 单细胞藻类的培养单细胞藻类的培养 一、实验目的一、实验目的掌握单细胞微藻的实验室培养掌握单细胞微藻的实验室培养(藻种培养藻种培养)
11、方法，细胞生长曲线观察。方法，细胞生长曲线观察。二、实验材料及用具二、实验材料及用具1、实验材料：小球藻（、实验材料：小球藻（500ml）、等鞭金藻、扁藻）、等鞭金藻、扁藻2、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（1部部/组）、血球计数板（一个组）、血球计数板（一个/组）、电炉、灭菌锅、组）、电炉、灭菌锅、pH计、计、 500ml烧杯（烧杯（1个个/组）、胶头滴管（组）、胶头滴管（3支支/组）、组）、 250ml锥形瓶（每组锥形瓶（每组3个）、牛皮纸、细绵绳个）、牛皮纸、细绵绳3、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾三、实验步骤三、实验步骤1、
12、培养基配制：见实验一、培养基配制：见实验一2、接种：一般培养的接种量为、接种：一般培养的接种量为1/31/5.3、计数：分光光度计测定、计数：分光光度计测定500nm（OD500）和）和750nm（OD750）吸光值；细胞计数板计数。）吸光值；细胞计数板计数。4、每天测定一次，分别绘制以、每天测定一次，分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与OD500和和OD750的相关性。的相关性。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点、观察并描述微藻不同生长时期的特点小球藻小球藻扁藻扁藻球等鞭金藻球等鞭金藻
13、1、血球计数板计数方法：、血球计数板计数方法：（1） 搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅拌，搅拌后立即取样。拌，搅拌后立即取样。（2）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数困难，需把水样稀释到适宜的程度。（困难，需把水样稀释到适宜的程度。（附：鲁哥氏液（附：鲁哥氏液（Lugols Solution）又称）又称碘液，常用的配方是：将碘液，常用的配方是：将6克的碘化钾溶于克的碘化钾溶于20毫升水中，待完全溶解后加入毫升水中
14、，待完全溶解后加入4克碘，摇克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入荡，待碘完全溶解后，加入80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）（3） 计数板与盖玻片洗净擦干计数板与盖玻片洗净擦干盖好盖玻片盖好盖玻片摇荡藻液摇荡藻液吸取藻液吸取藻液（干的微吸管）（干的微吸管）迅速加样迅速加样1分钟后低倍镜下计数计数任何对角两大分钟后低倍镜下计数计数任何对角两大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为0.1立方毫米的空间），然后取其立方毫米的空间），然后取其平均值。每个样品须重复计数两次。平均值。每个样品须重复计数两次。1毫升水体藻细胞计算平均值毫
15、升水体藻细胞计算平均值10,000藻稀释倍数藻稀释倍数 2、分光光度计定量法、分光光度计定量法 比色皿用比色皿用75酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入2/3体积，在两个波长体积，在两个波长下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。 作业作业:1、分别绘制以、分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线长曲线(三张图三张图)，分析细胞数目与，分析细胞数目与OD500和和OD750的相关性（两次的相关性（两次相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数
16、目。相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数目。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点。、观察并描述微藻不同生长时期的特点。实验三实验三 藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察一、实验目的一、实验目的 掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素的吸收光谱。素的吸收光谱。 叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级含量，可用来初步估量浮游植物的光合
17、作用能力，并进行估量水域初级生产力。也适用于评价实验室单种生长状况。生产力。也适用于评价实验室单种生长状况。 二、实验材料及用具二、实验材料及用具1 1、实验材料：海带、实验材料：海带、 裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等, ,选选4 4种藻种藻2 2、实验仪器：紫外分光光度计、实验仪器：紫外分光光度计(208(208实验室实验室) )3 3、实验器材：研钵（每组一套）、实验器材：研钵（每组一套）、15ml15ml离心管（每组离心管（每组4 4支支- -依藻种类定）、依藻种类定）、15ml15ml刻度试管（每组刻度试管（每组4 4支）、支）、0.450.45
18、m m的滤膜（每组的滤膜（每组3 3个），抽滤装置，个），抽滤装置，离心机（或用离心机（或用20ml20ml针管和滤膜器）针管和滤膜器）4 4、试剂：丙酮（分析纯）、试剂：丙酮（分析纯）、MgCO3MgCO3三、实验步骤三、实验步骤1、抽滤：、抽滤：减压过滤减压过滤5ml的藻类培养液到玻璃纤维滤片上，约加的藻类培养液到玻璃纤维滤片上，约加0.1g MgCO3细粉，使均匀覆盖于薄膜上，倒入水样抽滤，注意避免高温、强光及压力细粉，使均匀覆盖于薄膜上，倒入水样抽滤，注意避免高温、强光及压力过高，水滤完后，应继续抽气数分钟，以尽量吸尽滤膜上水分。过高，水滤完后，应继续抽气数分钟，以尽量吸尽滤膜上水分。
19、 2、储存：将折膜放入样品储存装置中，置黑暗、干燥、低温处保存。、储存：将折膜放入样品储存装置中，置黑暗、干燥、低温处保存。3、研磨和提取：、研磨和提取：把滤膜放到一个组织研磨管内的底部，加入把滤膜放到一个组织研磨管内的底部，加入23ml的的90丙酮，把杵插入管内，研磨，在弱光下将滤得的试样研磨丙酮，把杵插入管内，研磨，在弱光下将滤得的试样研磨1到到2min，再用再用5ml的的90丙酮把杵上和研磨管内的东西洗入丙酮把杵上和研磨管内的东西洗入15ml的有螺旋盖的离的有螺旋盖的离心管内，静置于暗处心管内，静置于暗处10min，使色素充分被提取。（观察叶绿素荧光），使色素充分被提取。（观察叶绿素荧光
20、）4、离心：（、离心：（2000g）5min，离心，离心，5、测定：、测定：将上清液用将上清液用90丙酮定容丙酮定容25ml，在分光光度计上，用，在分光光度计上，用1cm的比色皿分的比色皿分别读取别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以波长的吸光度，并以90的丙酮作校正吸光度测定。的丙酮作校正吸光度测定。6、计算：分别从、计算：分别从663、645、630nm时的光密度值，减去时的光密度值，减去750nm时的时的光密度值，再除以液槽光程（厘米），即为光密度值，再除以液槽光程（厘米），即为D663、D645、D630的的值。下式计算叶绿素在值。下式计算叶绿素在90丙
21、酮中的含量。丙酮中的含量。联合国教科文组织国际工作组推荐公式联合国教科文组织国际工作组推荐公式Chla（mg/ml）=11.64*D663-2.16*D645+0.1D630Chlb（mg/ml）=3.94*D663+20.97*D645-3.66D630Chla（mg/ml）=5.53*D663-14.81*D645+54.22D6307 7、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于、叶绿素吸收光谱的测定：将提取的叶绿素放于( (石英石英) )比色皿中，比色皿中，用紫外分光光度计测定用紫外分光光度计测定400nm-750nm400nm-750nm波段的吸收光谱。波段的吸收光谱。三、作业：三、
22、作业：1 1、计算几种藻类的叶绿素含量、计算几种藻类的叶绿素含量2 2、比较并说明不同藻类的叶绿素吸收光谱有何异同，并分析原因、比较并说明不同藻类的叶绿素吸收光谱有何异同，并分析原因 实验四实验四 微藻的分离方法微藻的分离方法-微吸管分离法微吸管分离法一、实验目的一、实验目的 1、单胞藻类的培养，首先需要有藻种。原始的藻种是从天然水域混杂、单胞藻类的培养，首先需要有藻种。原始的藻种是从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体，分离出来，而获得单的生物群中，运用一定的方法，把所需要的个体，分离出来，而获得单种培养。种培养。2、若藻种受敌害生物及其他杂藻的污染也要通过分离进行纯化。、
23、若藻种受敌害生物及其他杂藻的污染也要通过分离进行纯化。 本实验的目的是使学生了解单胞藻的分离方法，掌握单细胞藻类的微吸本实验的目的是使学生了解单胞藻的分离方法，掌握单细胞藻类的微吸管法分离技术。管法分离技术。二、实验材料及用具二、实验材料及用具1 1、实验材料：扁藻，球等鞭金藻或小球藻、实验材料：扁藻，球等鞭金藻或小球藻2 2、实验仪器：显微镜、实验仪器：显微镜3 3、实验器材：细玻璃管或毛细管；载玻片；小试管；脱脂棉；纱布；酒、实验器材：细玻璃管或毛细管；载玻片；小试管；脱脂棉；纱布；酒精灯精灯4 4、试剂：灭菌海水；、试剂：灭菌海水；F/2F/2培海水养基培海水养基三、实验步骤三、实验步骤
24、1、采样、采样 ：水样可取自天然水域、养殖池、湖泊、溪流及特殊水域环境等。：水样可取自天然水域、养殖池、湖泊、溪流及特殊水域环境等。此外，培养水生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游此外，培养水生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游或附着藻类，也是采样的理想场所。或附着藻类，也是采样的理想场所。 2、拉制微吸管：选直径、拉制微吸管：选直径5毫米的细玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管毫米的细玻璃管，或者其它任何适合拉成毛细管的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在酒精喷灯的外焰上，直到玻的巴氏滴管，用镊子夹住滴管的前端，放在酒精喷灯的外焰上，直到玻璃变软，迅速移离火焰，同时
25、快速拉成毛细管。璃变软，迅速移离火焰，同时快速拉成毛细管。 4、将装有藻细胞的试管置于适宜的条件下培养。、将装有藻细胞的试管置于适宜的条件下培养。三、实验步骤三、实验步骤3、分离：镜检待分离的藻液，调藻液浓度为、分离：镜检待分离的藻液，调藻液浓度为5-6个藻细胞为宜，在已灭菌个藻细胞为宜，在已灭菌的载玻片上滴加的载玻片上滴加6滴消毒培养液，另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻滴消毒培养液，另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻液，在显微镜下用微吸管吸取所需的藻细胞，放在第一滴消毒水中，清液，在显微镜下用微吸管吸取所需的藻细胞，放在第一滴消毒水中，清洗，再用微吸管吸取所需的藻细胞放在备有培养液的试管中。洗
26、，再用微吸管吸取所需的藻细胞放在备有培养液的试管中。实验五实验五 微藻的分离方法微藻的分离方法-平板分离法平板分离法一、目的：一、目的：学生掌握平板分离单藻种的方法。学生掌握平板分离单藻种的方法。适用于能在固体培养基上生长的种类。适用于能在固体培养基上生长的种类。 二、二、 实验材料：实验材料：F/2海水培养基；琼脂糖；海水培养基；琼脂糖； 玻璃棒；培养皿（每个同玻璃棒；培养皿（每个同学一副）；干燥箱、高压灭菌锅、电炉；封口膜学一副）；干燥箱、高压灭菌锅、电炉；封口膜三、三、 实验步骤：实验步骤：1、平板培养基的制备：该培养基的制备包括调配、融化、分装、灭菌四、平板培养基的制备：该培养基的制备
27、包括调配、融化、分装、灭菌四个步骤。个步骤。 调配：按分离种类的需要选用合适的营养盐配方配成培养液，加调配：按分离种类的需要选用合适的营养盐配方配成培养液，加1%琼胶琼胶（又称冻粉），琼胶剪成细片，加入培养液中浸泡（又称冻粉），琼胶剪成细片，加入培养液中浸泡12小时。小时。 融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶完全融化。在加热过程中，水融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶完全融化。在加热过程中，水分要蒸发不少，在加热完毕应以淡水补充蒸发掉的水分。分要蒸发不少，在加热完毕应以淡水补充蒸发掉的水分。 分装：稍冷后即分装于培养皿中，装的厚度依培养皿大小而定，在分装：稍冷后即分装于培养皿中，装的厚度依
28、培养皿大小而定，在0.3-0.5厘米之间。厘米之间。 三、三、 实验步骤：实验步骤：2、平板分离方法：经灭菌的固体培养基冷却后，培养基凝固成固体状态，、平板分离方法：经灭菌的固体培养基冷却后，培养基凝固成固体状态，即可进行分离。（即可进行分离。（显微观察待分离的藻液并调节藻液浓度为显微观察待分离的藻液并调节藻液浓度为1000-5000个个/毫升毫升）划线法：把一个金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取需要分离的藻液划线法：把一个金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取需要分离的藻液轻轻地在平板上划折线。轻轻地在平板上划折线。 喷雾法：将需要分离的藻液稀释，装入经消毒过的小型喷雾器中，打开培喷雾法：将
29、需要分离的藻液稀释，装入经消毒过的小型喷雾器中，打开培养皿盖，把藻液喷射在培养皿表面形成分布均匀的一薄层水珠。养皿盖，把藻液喷射在培养皿表面形成分布均匀的一薄层水珠。 涂布法：滴涂布法：滴1-2滴自然采集物于琼脂的边缘。用一弯玻璃棒（将棒浸入滴自然采集物于琼脂的边缘。用一弯玻璃棒（将棒浸入70%酒精溶液，放在火焰上点燃并移离火焰；重复几次。）在无菌条件下酒精溶液，放在火焰上点燃并移离火焰；重复几次。）在无菌条件下将滴在琼脂上的自然采集物滴平涂在琼脂表面上。将滴在琼脂上的自然采集物滴平涂在琼脂表面上。 3、将待分离的藻液喷在固体培养基上，然后盖好，放在光亮处培养。、将待分离的藻液喷在固体培养基上，然后盖好，放在光亮处培养。实验六实验六 褐藻胶的提取褐藻胶的提取
