1、高效液相色谱分析技术方法开发 上海市食品药品检验所陈桂良方法开发 方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的pKa或pKb值、溶质分子的极性和大小、紫外可见光谱性质、氧化还原行为、浓度范围、溶解度以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或定量要求。 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 通常在确定被分析的样品
2、以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 分析物 理化性质 混合分析物的主要差异 分子结构和特性方法开发前要确定的基本问题方法开发前要确定的基本问题1、分析物的物理、化学性质样品基质-决定前处理方法溶解性-决定正、反相方法酸碱性-确定色谱柱类型、流动相组成pKa-确定流动相的pH值化学结构、特征官能团、Etc.方法开发前要确定的
3、基本问题方法开发前要确定的基本问题2、混合分析物的主要差异疏水性差异-用疏水性选择性强的色谱柱极性差异-用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异-用芳香选择性色谱柱混合差异-用多种选择型色谱柱分子量差异-GPC、GFC方法开发前要确定的基本问题方法开发前要确定的基本问题3、分子结构决定选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.如何得到最理想的分析结果如何得到最理想的分析结果理想的柱子理想的柱子色谱柱选择表 颗粒直径及形状(球型及不规则型) 柱长及柱内径 表面积及孔径 碳负荷及键合类型Ginseng RootColumn:Luna 5 m C18 / ODS
4、(2)Dimensions:150 x 4.6 mm IDElution Type:GradientEluent A: Acetonitrile/water (15:85)Eluent B: Acetonitrile/water (80:20) Flow Rate:1.5 mL/minTemperature:25 CDetection: UV-Vis Abs. Variable Wave. 205 nm App ID 1125Basic Drugs at Neutral pH疏水性的比较疏水性的比较0.0002.0004.0006.0008.00010.000k butylbenzeneSyn
5、ergiHydro-RPLunaC18(2)SynergiMax-RPLuna C8(2)Luna C5Luna Phe-HexJupiter C18SynergiPolar-RPProdigyPhenylJupiter C4LunaCyanoLunaAminoC18 phasesC8 phase300 C18 phaseColumns: Luna 5m C18(2)YMC-Pack 5m Pro C18Synergi 4m Polar-RP (Ether-linked Phenyl)150 x4.6mmMobile phase: 75:25 Methanol:waterFlow rate:1
6、 mL/minComponents: 1. Estrone2. EstradiolOHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstronemi n12345mA U02 55 07 51 0 01 2 51 5 01 7 5mi n12345mA U02 55 07 51 0 01 2 51 5 01 7 52 0 0mi n12345mA U02 04 06 08 01 0 0Luna C18(2)Synergi Polar-RPYMC-Pack Pro C181+21+212OHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstroneSynergi Max-RP -
7、 C12Max-RP - C12Synergi Hydro-RP - C18Hydro-RP - C18Synergi Fusion-RP C18Fusion-RP C18Synergi Polar-RP PhenylPolar-RP PhenylLinear Velocity (mm/sec)Plate Height (H)5 43 Flow Rate (mL/min)Pressure Drop (Bar)higher efficiencieslower backpressuresSynergiSynergi Hydro-RP VS. Luna C18(2)Synergi Hydro-RPM
8、obile Phase:A: 20mM KH2PO4, pH 4.6B: AcetonitrileGradient: A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 minFlow rate: 1.5 mL/minSample:1. Morphine2. Hydromorphone3. Codeine4. Nalorphine5. OxycodoneSynergi Hydro-RPmin02468101214mAU 0100200300400500 VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:HPCHEM1DATASW1003TEST0034.D)min02468
9、101214mAU 050100150200250300350 VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:HPCHEM1DATASW1003FUSI0046.D)Running ConditionsMobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: AcetonitrileFlow rate: 1.5 ml/minTemperature: AmbientDetection: 210nmInjection: 1. Maleic acid2. Chlorpheniramine 3. Triprolidine 4. Diphenh
10、ydramine Synergi Fusion-RP 4 80一般的 C18柱极性增大极性增大疏水性减少疏水性减少min02468101214mAU 020406080 VWD1 A, Wavelength=230 nm (F:PHEN1575HPCHEM2DATASW0503CARLO071.D)min02468101214mAU 020406080 VWD1 A, Wavelength=230 nm (F:PHEN1575HPCHEM2DATASW0503CARLO087.D)min02468101214mAU 020406080 VWD1 A, Wavelength=230 nm (F:
11、PHEN1575HPCHEM2DATASW0503CARLO088.D)Synergi Fusion-RPAvg symm: 0.91Synergi Max-RPAvg symm: 0.77Luna C18(2)Avg symm: 0.82 Running ConditionsMobile phase: A: 25mM Tris pH 9 B:ACNGradient:40%-70% B in 15 minutesFlow rate: 1.0 ml/minDetection: 230nmComponents: 1. Scopolamine, LogP = 2. Lidocaine, LogP =
12、 2.443. Noscapine, LogP = 1.97NOCH3OOOHOONOOHHOOOSiCH3CH3OSiOSiOOSiOOHOHLunaPhenyl-HexylGreen Tea(绿茶)Column: Luna 5u Phenyl-HexylDimensions: 250 x 4.6mmMobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Acetonitrile (91:9)B:Water/Acetonitrile (20:80)Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min to t=35min, hold
13、 100%B for 10 min.Flow Rate: 1ml/minTemperature: 350CApp ID 14436IBUPROFENCH3CH3CH3COOHINDOMETHACINNOCH3COOHColumns: Luna 5m C18(2) 150 x4.6mmLuna5m Phenyl-Hexyl 150 x4.6mmSynergi 4m Polar-RP150 x4.6mmMobile phase:50:50 Acetonitrile:20mM Potassium phosphate pH 2.5Flow rate:1.0 mL/minComponents:Acidi
14、c, aromatic compounds 1. Indoprofen2. Ethyl paraben3. Naproxen4. Diflunisal5. Indomethacin6. Ibuprofenm in1234567m A U05 01 0 01 5 02 0 02 5 0min1234567mAU020406080100120140min1234567mAU020406080100120140C18(2)Phenyl-HexylPolar-RP当选择流动相的当选择流动相的pH时时,我们必需考虑我们必需考虑到到pH对分析物和柱子两者的影响对分析物和柱子两者的影响pH对分析物的影响对分
15、析物的影响多数硅胶柱没法于高多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定条件下稳定,所以所以一般分析碱性化合物时一般分析碱性化合物时,会选择于会选择于pH1.5-3下进行分析下进行分析.在此在此pH条件下条件下,硅胶表面的游硅胶表面的游离离Si-O-H会保持中性会保持中性,减少离子间的二极反减少离子间的二极反应应,因而减少峰拖尾因而减少峰拖尾,峰型较好峰型较好但是在低但是在低pH条件下条件下,碱性化合物的极性增碱性化合物的极性增加加,疏水性减少疏水性减少,如果要增加峰保留时间如果要增加峰保留时间,流流动相的有机溶剂比率必需减少动相的有机溶剂比率必需减少在高在高pH条件下条件下,碱性化合物可以保持中性碱性化
16、合物可以保持中性,疏水性疏水性因而增加因而增加,但是如果峰保留时间太长但是如果峰保留时间太长,可以将流动可以将流动相的有机溶剂比率增加相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间以缩短保留时间.增加选增加选择分析条件的弹性择分析条件的弹性流动相的有机溶剂比率增加流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间外以缩短保留时间外,并可以增进峰型并可以增进峰型(尖尖)pH 1 12 StabilitypKapKa 硅胶纯度（金属含量）硅胶纯度（金属含量）Columns: A型硅胶 ( = 旧型号)B型硅胶 (Gemini 5m C18)Mobile phase:10mM 甲酸铵 pH 3.5 : 乙腈: 甲醇（
17、35:15:50 ）Flow rate:1.0 mL/minComponents:1.Rhodamine 123 2. Rhodamine 6G3. Rhodamine B Base玫瑰精玫瑰精, 若丹明若丹明(一种红色荧光染料一种红色荧光染料) ONH2+NH2OOMeRhodamine 123ClONOONH+Rhodamine 6GClOOONNRhodamine B Base色谱图 A型硅胶C18 化合物被吸收 B型硅胶 （Gemini C18) 峰形、峰高、分离正常 1 2 3min0123456789min0123456789金属的影响（1）SiOSiOAl3+OSiOSiOSiO
18、HOHOOHOHHSiOSiOAl3+OSiOSiOSiOHOHOOHON+CH3CH3Ionic interaction between O- and N+金属的影响（2）S iOS iO HA l3+OS iOS iOS iO HOOHOHC h e la tio nOOC O O HH O O C流动相的选择 有机相的选择 缓冲液的选择 离子对的选择 程序洗脱 其他流动相中有机相的选择* 甲醇：洗脱能力较弱，压力较大；使用苯基柱时推荐使用。* 乙腈：洗脱能力较强，压力较小；使用末端吸收时和梯度洗脱时推荐使用。*梯度时：缓冲液pH值的选择酸性分析物：pHpKa-2单一碱性分析物：pH3.5
19、 或pHpKa+2复杂碱性混合物：pHpKa+2 1.氯磺丙脲（pKa5.0) 2.对羟基苯甲酸丁酯 3.利多卡因（pKa 7.9) 4.苯丙烯啶（pKa6.5) 5.右甲吗南(pKa 9.2)应用实例：苦参色谱柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm流动相：0.01M醋酸铵-乙腈（梯度）min01020304050mAU050100150200250300 DAD1 B, Sig=225,8 Ref=off (KSDGYC801AK1.D) 3.508 5.178 6.797 20.834 25.292 27.412 38.073 39.420 48.246 49.159 50.
20、564 57.057流动相常用溶剂的极性和截止波长 由极性可以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快，可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例还会引起分离度的增加；两者之间综合来考虑。举例说明 。异丙醇转相时必须用；四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的。溶 剂水甲醇乙醇异丙醇乙腈四氢呋喃极性常数1.000.950.880.820.650.57 由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈。 样品稀释用溶剂的选择：测定有关物质时最好选用流动相，避免以溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。含量测定时，溶剂依情
21、况而定，有时选用流动相费用太高，或是不易于操作。 进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。各溶剂截止波长各溶剂截止波长溶 剂水甲醇乙醇异丙醇乙腈四氢呋喃正己烷截止波长(nm)170210210210190210210检测器和检测条件的选择 检测器的选择 检测条件的选择 灵敏度问题检测器类型 最通用的紫外检测器：注意测定波长较短时，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源，以延长使用寿命。 二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。用于多波长检测、峰纯度测定、对被测定物质进行紫外扫描后选择波长等用途。 荧光检测器：灵敏度更高，对那些g级的制剂品种，有时适用。但缺点是，基线稳定需平衡时间较长。 示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器（电导检测器）等。举例说明 HPLC法测定盐酸氟西汀的有关物质及其胶囊的含量 HPLC法同时测定福辛普利钠片中福辛普利钠及其降解产物福辛普利拉的含量 HPLC法用于苯唑西林钠及其制剂中含量和有关物质的测定
