1、细菌的耐药性监测与抗菌药物压力河南省卫生厅临床检验中心金雨琦l细菌的耐药性监测药敏试验l概念：概念：细菌对抗菌药物的敏感试验（简称药敏试验）是测定某一菌株对某种抗菌药物是敏感还是耐药的一种体外监测试验。l意义：意义：l大剂量、长疗程造成对机体的伤害；l小剂量、短疗程诱发耐药菌株的产生。l因此，在使用抗菌药物的过程中，必须加强细菌对抗菌药物敏感性的实验室监测，为临床上合理使用抗菌药物提供试验依据。而细菌对抗菌药物的敏感试验，就是对抗菌药物进行实验室监测的主要手段之一。l目的：目的：l1、为临床上治疗某个病人选择最佳抗菌药物，指导临床用药，避免由于用药不当，导致耐药菌株产生或造成人体伤害；l2、进
2、行流行病学调查，了解致病菌的耐药变迁情况，为医疗行政主管部门的决策提供依据；l3、用于某些细菌的鉴别和鉴定：如Optochin敏感试验、杆菌肽敏感试验和新生霉素敏感试验，分别用于鉴定不同的细菌；l4、评价新抗菌药物的抗菌谱及抗菌活性等药效学特性。l一般认为，某菌株能被某种抗菌药物抑制或杀灭，则该菌株对该抗菌药物敏感；反之，则为耐药。l上述概念虽然考虑到了细菌对抗菌药物的敏感性，但却忽略了药物的剂量、浓度和机体的耐受性。l从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓度（抗菌药物通过常用途径和常用剂量所能达到的血药浓度）与该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC）的关系而定：
3、 l若某抗菌药物对某菌株的最小抑菌浓度（MIC）小于该抗菌药物的治疗浓度，则为“敏感”（S, Sensitive）；若某抗菌药物对某菌株的最小抑菌浓度（MIC）大于该抗菌药物的治疗浓度，则为“耐药”（R, Resistant）；若MIC介于治疗浓度的上下限之间，则为“中介度”（I, Intermediate）。l所谓MIC，就是某抗菌药物对某菌株的最小抑菌浓度。其测定方法是：l（1）、取一列洁净无菌的小试管，各管分别加营养肉汤1ml；l（2）、第一管加入含1280 U/ml的抗菌药物原液1ml,后倍比稀释至次末管后吸出1ml 弃去；l（3）、各管分别加入试验菌液0.1ml;l（4）、置37孵箱
4、中培养1824h，观察结果。 抗菌药物原液（1280 U/ml） 1ml 1ml 1ml 弃去 640 320 160 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0 药物浓度 U/ml l结果观察：含最小药物量仍呈明显不混浊的一管所含的药物浓度即为该抗菌药物对试验菌株的最小抑菌浓度（MIC）。l在使用各类抗菌药物时，常常会遇到的一个重要问题，就是血药浓度。例如：口服抗菌药物总是经肠道逐渐吸收入血的。因此，血液中的药物浓度是从无到有随时间的延长逐渐增高的。即使静脉注射抗菌药物，因存在着首过效应（第一关卡效应）和肾脏的排泄作用，血药浓度也是随着注射的次数而逐渐增高的。 致死量 中毒浓度 最小中
5、毒量 极量 R 治疗安 全范围 治疗浓度 （常用剂量） I S 最小有效量 无效浓度 血药浓度 MIC l当当MIC小于血药浓度中治疗浓度的下限时，小于血药浓度中治疗浓度的下限时，则称为则称为“敏感敏感”，用，用“S”（Sensitive）表表示。示。l当当MIC大于治疗浓度的上限时，则为大于治疗浓度的上限时，则为“耐耐药药”，用，用“R”（Resistant）表示。表示。l当当MIC介于治疗浓度的上下限之间时，则介于治疗浓度的上下限之间时，则为为“中介度中介度”，用，用“I”（Intermediate）表示。表示。l 但是药物在局部组织和组织液中的浓度，往往只有血清浓度的1/21/10，故在
6、治疗局部组织感染时，仅仅以MIC小于血清治疗浓度定为敏感往往会产生一定的误差，应该以MIC小于血清治疗浓度的210倍，才是敏感。因此，在治疗局部组织或组织液感染选用抗菌药物时，一般治疗剂量，至少应该是抗菌药物对病原菌的MIC的35倍。l目前，临床上选择抗菌药物，常根据抑菌商数来选择。l所谓“抑菌商数抑菌商数”（Inhibitory Quotient，简称IQ），是指某抗菌药物在局部组织或体液中的浓度除以该药物对感染菌的最小抑菌浓度所得的商数。即： 局部组织或体液中的药物浓度 lIQ = MICl抑菌商数越大，抑菌效果越明显；反之，抑菌商数越小，抑菌效果越差。纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释以
7、及 MIC 测定结果解释 抑菌环直径（mm） MIC（g/ml） 抗菌药物 纸 片 含药量 耐 药 中介度 敏 感 耐 药 中介度 敏 感 内 酰 胺内 酰 胺类：青霉素类：青霉素族族 青霉素 不产青霉素酶葡萄球菌 10U 28 29 0.25 0.12 肠球菌属细菌 10U 14 16 8 链球菌属细菌 10U 19 28 4 0.252 0.12 淋病奈瑟菌 10U 26 2746 47 2 0.06 甲氧苯青霉素 1g 9 1013 14 16 8 苯唑青霉素 1g 10 1112 13 4 2 l选取一大群同种不同株的细菌做药敏试验（至少选取100株，包括敏感菌株和耐药菌株），求出该群
8、细菌中每一菌株对某抗菌药物的MIC及其相应的抑菌环直径。因抗菌药物对细菌的MIC与其相应的抑菌环直径呈负相关关系，据此可绘制回归直线图。方法如下：l（1）、用试管稀释法分别检测某抗菌药物对试验菌各菌株的MIC；l（2）、用含一定量该抗菌药物的药敏纸片，以扩散法分别测出（1）项中各菌株相应的抑菌环直径；l（3）、以MIC的对数（为计算方便，可采取以2为底的对数）为纵坐标；以抑菌环直径为横坐标，在坐标纸上绘制lgMIC与抑菌环直径的散点图；氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验0102030405005101520Diameter（mm）lgMIC系列1氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验01020304050
9、05101520Diameter（mm）lgMIC系列1氨苄青霉素对肠杆菌科的抑菌试验0102030405005101520Diameter（mm）lgMIC系列1 一、抗菌药物压力 是细菌产生耐药的主要源动力。 1985年，著名学者McGowan指出了与医院内细菌耐药性的出现相关的7个方面：（1）引起医院感染的微生物的耐药性比引起社会感染的微生物的耐药性更多见；（2）医院中耐药菌株感染者使用的抗菌药物比敏感株感染或定植者使用的抗菌药物多；l（3）抗菌药物使用情况的变化会引起细菌耐药情况的变化，如投入或停用某种抗菌药物常与其耐药性的消长有关；l（4）抗菌药物使用愈多的区域耐药菌分布愈多；l（5
10、）抗菌药物应用时间越长耐药菌定植的可能性越大；l（6）抗菌药物剂量越大耐药菌定植或感染的机会更多；l（7）抗菌药物对自身菌群有影响并有利于耐药菌生长。 二、抗菌药物作用的基本机理抗菌药的作用机理主要有以下5种 1、抑制细胞壁的合成这些药物主要选择性作用于某些有细胞壁的真菌、细菌，而对宿主本身没有毒性作用。这些药物包括青霉素（Penicillins）、头孢菌素（Cephalosporins）、万古霉素（Vancomycin）、杆菌肽（Bacitracin）、异烟肼（Isoniazid）、乙胺丁醇（Ethambutol）等。它们主要通过抑制细胞壁的主要成分肽聚糖的合成，从而引起细胞壁的通透性改变，
11、大量水分进入细胞浆中而引起细胞的裂解。 l2、抑制蛋白质的转录或合成 l由于真核生物和原核生物核糖体的差异，真核生物的核糖体主要是80 S，由60 S和40 S两个亚基组成，而原核生物的核糖体是70 S，主要由30 S和50 S两个亚基组成。l属于这一种作用机制的主要抗菌药包括氨基糖苷类（Aminoglycosides），如链霉素(Streptomycin)、阿米卡星（Amikacin）、托普霉素（Tobramycin）、庆大霉素（Gentamicin）等，它们主要作用于核糖体的30 S亚基，改变它的形状，导致mRNA不能被正常地翻译而引起蛋白质合成受阻，从而引起细菌死亡。l3、破坏胞浆膜的完
12、整性 l这类抗菌药主要是一些抗真菌的药物，如两性霉素B（Amphotericin B），它们主要能够与细菌细胞胞浆膜上的一些磷脂成分结合，破坏胞浆膜的完整性，从而导致细胞的裂解。l4、影响细菌的代谢途径l这类抗菌药的代表就是磺胺类（Sulfonamides）。 l5、抑制核酸的合成 l这类药物主要包括一些核苷酸的类似物，它们可以插入到DNA或RNA链中，导致DNA或RNA复制过程中的错配，而干扰其正常的功能。另外一些药物，如喹诺酮（Quinolones）、氟喹诺酮（Fluoroquinolones）可以特异性地抑制DNA旋转酶的活性，抑制细菌DNA复制时的解螺旋，导致DNA复制的受阻。 l三、
13、细菌耐药性产生的机理l细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因机理两个方面：l(一）、生化机理： l1、细菌产生破坏药物结构的酶l这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的药物，使之失去生物活性。这是引起细菌耐药性的最重要的机制，目前发现和分离的钝化酶主要有以下4种：l（1）-内酰胺酶(-Lactamase)。它是细菌对-内酰胺类抗菌药耐药的主要原因，由于-内酰胺酶的产生，使其-内酰胺环的酰胺键断裂而失去抗菌活性。该类酶可以为染色体介导，也可为质粒介导。Bush 根据底物及酶抑制剂的作用类型将-内酰胺酶分为4种，即A组-内酰胺酶(主要水解青霉素类)，B组金属酶
14、(其活性部分是结合锌离子的硫醇)，C组-内酰胺酶(主要水解头孢菌素类)，D-组-内酰胺酶(苯唑西林水解酶)。 l（2）氨基糖苷类钝化酶。细菌对氨基糖苷类 (Aminoglycosides)抗生素产生耐药性的最重要的原因就是产生了对这一类药物的共价修饰酶。这些酶通过磷酸化、乙酰化和腺苷酸化等途径对其进行修饰而使其灭活。目前，这一类的共价修饰酶主要有磷酸转移酶（O-phosphotransferases, APHs）, 腺苷酸转移酶（O-adenyltransferases，ANTs）和N-乙酰转移酶（N-acetyltransferases，AACs）3类。现在已经对这些酶的晶体结构有了清楚的研
15、究。l（3）氯霉素乙酰转移酶。此酶为一种胞内酶，早在1987年，Lyon等就确定此酶由质粒或染色体或转座子基因编码，主要作用是使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的代谢物。 l（4）红霉素酯化酶。此酶是一种体质酶，由质粒介导，主要作用是水解红霉素及大环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去抗菌活性。 l2 、靶位的改变l由于抗菌药作用的靶位(如核糖体和核蛋白)发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗菌药的作用靶位(如青霉素结合蛋白和DNA回旋酶)结构发生改变而使之与抗生素的亲和力下降，这种耐药机制在细菌耐药中普遍存在。 l目前的研究表明，-内酰胺类抗菌药物的作用靶位为青霉素结合
16、蛋白(PBP),氨基糖苷类和四环素抗菌药物的作用靶位为核糖体的50 S亚基，大环内酯类和氯霉素以及克林霉素的作用靶位为核糖体的30 S亚基，利福霉素类的作用靶位为依赖于DNA的RNA聚合酶，哇诺酮类的作用靶位为DNA促旋酶，磺胺类的作用靶位为二氢碟酸合成酶和二氢叶酸还原酶，万古霉素的作用靶位为细胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的游离羧基。这些作用靶位结构的细微变化都有可能产生很高的耐药性。 l3、 渗透屏障 l由于细菌细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变，形成一道有效屏障，抗菌药无法进入细胞内达到作用靶位而发挥抗菌效能，这也是细菌在进化与繁殖过程中形成的一种防卫机制。这类耐药机制是非特异性
17、的，主要见于革兰氏阴性菌。因为革兰氏阴性菌细胞壁黏肽层外面存在着类脂双层组成的外膜，外层为脂多糖，由紧密排列的碳氮分子组成，阻碍了疏水性抗菌药进入菌体内。 l而在革兰氏阳性菌中细胞膜被一层厚厚的肽聚糖细胞壁所包裹。尽管细胞壁具有很强的机械强度，但由于其结构比较粗糙，几乎不影响抗菌药物这样的小分子物质扩散至细胞内。 l4、 药物主动外排系统l药物的主动外排系统被认为是导致广泛的细菌对多种抗生素产生耐药性的重要原因。目前研究表明主要有两大类外排系统：特异性（单一性）外排系统和多种药物耐药性（multidrug resistance，MDR）外排系统。一般来说，两个外排系统的作用都各不相同,其中特异
18、性外排系统一般只作用于单一的底物（药物），常常是某一类的抗生素，如四环素、氯霉素、链霉素等。而多种药物耐药性外排系统可以作用于多种抗菌药或者一些结构和功能不相关的复合物。 l（二）、细菌耐药性产生的基因机理 l细菌耐药的基因机理细菌可通过不同机制产生遗传变异和对抗菌药物的耐药性。根据遗传特性，将细菌耐药性分为两类 。l1 、自身基因突变 该类耐药性来源于细菌固有的(自然发生)特征，即本身就有耐药基因存在于其染色体上，也叫染色体介导的耐药性。一般是由于遗传基因DNA自发变化的结果，具有典型的种属特异性，能够代代相传。细菌的这类耐药性，一般对一种或两种相类似的药物耐药，且比较稳定，耐药性的产生与消
19、失与药物接触无关，在自然界中这类耐药菌占次要地位。 l2 、获得外源基因l这类耐药性是由于细菌获得外源新基因而产生的。细菌外源耐药性基因既可以通过染色体垂直传播而获得，又可以通过质粒或转座子水平传播而获得。因此，细菌耐药性的传播方式主要有转化(transformation)、转导(transduction)、接合(conjugation)和转座(transposion)4种。 l（1）转化。主要指耐药菌溶解后释放出的DNA进入敏感菌体内，其耐药基因与敏感菌的同种基因重新组合，使敏感菌成为耐药菌。转化过程常限于革兰氏阴性菌。l（2）转导。主要是借助于噬菌体将耐药基因转移给敏感菌，由于噬菌体有特异
20、性，且通过噬菌体传播的DNA量很少，因此耐药性的转导现象仅能发生在同种细菌内，通常仅能传递对一种抗菌药的耐药性。临床上是金黄色葡萄球菌耐药性转移的惟一的方式。 l（3）接合。由接合传递的耐药性也叫感染性耐药，主要是通过耐药菌与敏感菌菌体的直接接触，由耐药菌将耐药因子转移给敏感菌。接合转移不仅可在同种菌之间进行，也可在属间不同种菌之间进行，通过接合方式，一次可完成对多种抗菌药耐药性的转移。这种方式主要出现在革兰氏阴性细菌中，特别是在肠道菌中。l（4）转座子。它是一种比质粒更小的DNA片段，它能够随意地插入或跃出其它DNA分子中，将耐药性的遗传信息进行传递，转座子不能进行自身复制，必须依赖于细菌的
21、染色体、噬菌体或质粒中而得以复制和繁殖。转座子的宿主范围广，它可在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间转移，从而使耐药基因的宿主范围也扩大，是耐药性传播的一个重要原因。 l四、减轻抗菌药物压力的对策l1. 制定抗微生物药物应用指南, 并强制实施；l2. 在药敏试验指导下选药； l3.原则上尽量选用窄谱抗菌药, 一般疗程 710d,如3d无效应更换药品；l4.联合用药应有明确指征, 一般以23种为宜, 最好不同时使用抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗原虫药和抗结核药, 否则既无助于感染的解决, 更增加毒副反应； l5.严格控制预防使用和非医疗的农、林、牧、副、渔以及饲料的使用；l6.采取限用策略：如轮作制，即将某些抗菌药停用一段时期后再用，以恢复细菌对药物的敏感性；l7.加强监控，掌握致病菌变化以及耐药情况, 及时反馈临床；l8. 坚决制止在经济利益驱动下滥用抗菌药物。 谢谢
