1、第二章第二章 基因工程的基因工程的载体和工具酶载体和工具酶第一节第一节 载载 体体载体必须是复制子。载体必须是复制子。基因克隆的目的基因克隆的目的是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现来实现作为基因克隆的载体必须具备以下特性作为基因克隆的载体必须具备以下特性具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具备多克隆
2、位点（具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。），便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。在宿主细胞内稳定性高。（一）质粒载体的生物学特性（一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备（二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造（四）几个常用质粒载体（四）几个常用质粒载体一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectorsplasimid vectors）（1）质粒质粒是是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状( (少数为线形和少数为线形和RNARNA） DNADN
3、A分子。分子。（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（2）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只有，最小的只有1kb,只能编码中等大只能编码中等大 小的小的2-3种蛋白质分子，最大的达到种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存质粒的生存在寄主细胞中在寄主细胞中“友好友好”地地“借居借居”，离开了，离开了寄主寄主 它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠 杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。（一）质粒的生物学特性（一）质
4、粒的生物学特性（4）质粒的复制类型质粒的复制类型（5）质粒的不亲和性质粒的不亲和性根据拷贝数将质粒分为两种复制型：根据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型严紧型”质粒质粒（stigent plasmid），），拷贝数为拷贝数为1-3；“松弛型松弛型”质粒质粒（relaxed plasmid），），拷贝数为拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。的生长环境也可能有很大的变化。两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载
5、体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数。接合型质粒接合型质粒分子量大分子量大严紧型复制严紧型复制 非接合型质粒非接合型质粒分子量小分子量小松弛型复制松弛型复制 是否含有接是否含有接合转移基因合转移基因 非转移性质粒，不含非转移性质粒，不含tra基因；可以为转基因；可以为转移性质粒所带动转移。移性质粒所带动转移。转移性质粒，含有转移性质粒，含有tra基因；能通过结合基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，
6、质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：有一定的相关性。现归纳如下：（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性 质粒的转移质粒的转移 （7）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种螺旋三种 双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（环（SC构型）构型）开环双螺旋开环双螺旋（OC构型）构型）线状双螺旋线状双螺旋（L构型）构型）（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（二）质粒（二）质粒DNADNA的制备的制备目前一般使用碱变性法制备质粒目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。
7、这个方法主要包括。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体与染色体DNA分开及除去蛋白质和分开及除去蛋白质和RNA。分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。柱过滤法等。碱变性法质粒提取的原理碱变性法质粒提取的原理 通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成值使之复性，线性染色体形成网状结构，而网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用
8、乙醇沉淀，的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒获得质粒DNA。 在在pH值值12.012.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNA会被变性而共会被变性而共价闭合环状质粒价闭合环状质粒DNA却不会被变性。却不会被变性。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒1 1 挑取挑取LBLB固体培养基上生长的单菌落，接种于固体培养基上生长的单菌落，接种于3.0ml LB3.0ml LB（含相（含相应抗生素）液体培养基中，应抗生素）液体培养基中，3737、250rpm250rpm振荡培养过夜（约振荡培养过夜（约16-17hr16-17hr）。）。2 2 取取1.5ml1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心培养物入微
9、量离心管中，室温离心12000rpm12000rpm，1min1min， 弃上清弃上清3 3 将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于100l100l预冷的溶液预冷的溶液中，重悬，使菌体分中，重悬，使菌体分 散混匀散混匀4 4 加加200l200l新鲜配制的溶液新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振，颠倒数次混匀（不要剧烈振 荡），并将离心管放置于冰上荡），并将离心管放置于冰上2-3min2-3min，使细胞膜裂解（溶液，使细胞膜裂解（溶液 为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）5 5 加入加入150l150l预冷的溶液预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色，将管温和
10、颠倒数次混匀，见白色 絮状沉淀，可在冰上放置絮状沉淀，可在冰上放置3-5min3-5min。6 6加入加入450l450l的苯酚的苯酚/ /氯仿氯仿/ /异戊醇，振荡混匀，异戊醇，振荡混匀，44离心离心 12000g 12000g 10min 10min7 7 小心移出上清于一新微量离心管中，加入小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.52.5倍体积预冷的倍体积预冷的 无水乙醇，混匀，室温放置无水乙醇，混匀，室温放置2-5min2-5min，44离心离心12000g12000g15min15min8 1ml8 1ml预冷的预冷的70%70%乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀1-21-2次，次，44离心离
11、心8000g8000g10min10min， 弃上清，将沉淀在室温下晾干弃上清，将沉淀在室温下晾干9 9 沉淀溶于沉淀溶于20l TE20l TE（含（含RNase A 20g/mlRNase A 20g/ml），），3737水浴水浴 30min 30min以降解以降解RNARNA分子，分子，-20-20保存备用。保存备用。溶液溶液 I50 mM50 mM葡萄糖葡萄糖 / 25 mM Tris-/ 25 mM Tris-H HCl / 10 mM EDTACl / 10 mM EDTA，pH 8.0pH 8.0Tris-HClTris-HCl控制溶液的控制溶液的pHpH葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌
12、不会快速沉积到管子的底部，因葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因此如果缺了葡萄糖几乎没有影响；此如果缺了葡萄糖几乎没有影响；EDTAEDTA螯合是螯合是CaCa2+2+和和MgMg2+2+等二价金属离子，高达等二价金属离子，高达10 mM 10 mM 的的EDTAEDTA就就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNaseDNase的活性，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，如果的活性，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，如果不加不加EDTAEDTA也不用怕也不用怕DNADNA会迅速被降解会迅速被降解溶液溶液II
13、0.2 N NaOH / 1% SDS用新鲜的用新鲜的0.4 N0.4 N的的NaOHNaOH和和2 2的的SDSSDS等体积混合后使用；新鲜的等体积混合后使用；新鲜的0.4 N0.4 N的的NaOHNaOH是保证是保证NaOHNaOH溶液没有吸收空气中的溶液没有吸收空气中的CO2CO2而减弱了碱而减弱了碱性，因为破裂细胞的主要是碱，而不是性，因为破裂细胞的主要是碱，而不是SDSSDS；这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组条件下基因组DNADNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然片断会慢慢断裂；第二，必须
14、温柔混合，不然基因组基因组DNADNA也会断裂，基因组也会断裂，基因组DNADNA的断裂会带来麻烦的断裂会带来麻烦在在pHpH值介于值介于12.0 -12.512.0 -12.5这个狭窄的范围内，线性这个狭窄的范围内，线性DNADNA双螺旋结构双螺旋结构解旋变性。共价闭合环状质粒解旋变性。共价闭合环状质粒DNADNA的氢键会断裂，但两条互补链的氢键会断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，紧密地结合在一起彼此相互盘绕，紧密地结合在一起溶液溶液III3 M 醋酸钾醋酸钾 / 2 M 醋酸（醋酸（pH4.8）加入后就会有大量的沉淀，是因为加入后就会有大量的沉淀，是因为SDSSDS遇到钾离子后变成了十二烷基
15、硫酸遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（钾（potassium dodecylsulfate, PDSpotassium dodecylsulfate, PDS），），PDSPDS是水不溶的，因此发生了沉是水不溶的，因此发生了沉淀；高浓度的盐淀；高浓度的盐(3 M(3 M醋酸钾醋酸钾) ) ，使得沉淀更完全；溶液，使得沉淀更完全；溶液IIIIII加入并混合均加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了匀后在冰上放置，目的是为了PDSPDS沉淀更充分一点沉淀更充分一点 2M2M的醋酸是为了中和的醋酸是为了中和NaOHNaOH，调，调pHpH值至中性时，共价闭合环状质粒值至中性时，共价闭合环状质粒DNAD
16、NA的两的两条互补链仍保持在一起，因而复性迅速而准确；而线性染色体条互补链仍保持在一起，因而复性迅速而准确；而线性染色体DNADNA的两条的两条互补链因彼此已完全分开，复性缓慢且错误率高，缠绕形成网状结构互补链因彼此已完全分开，复性缓慢且错误率高，缠绕形成网状结构平均两个氨基酸上结合一个平均两个氨基酸上结合一个SDSSDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了；绝大部分蛋白质沉淀了；尽管尽管SDSSDS并不与并不与DNADNA分子结合，由于染色体分子结合，由于染色体DNADNA太长且缠绕形成网状结构，太长且缠绕形成网状结构，大肠杆菌的基因组
17、大肠杆菌的基因组DNADNA也同时被共沉淀也同时被共沉淀另外长时间的碱性条件会打断另外长时间的碱性条件会打断DNADNA，基因组，基因组DNADNA一旦发生断裂成一旦发生断裂成5050100 kb100 kb大小的片断，就不会被大小的片断，就不会被PDSPDS共沉淀；所以碱处理的时间要短，而且不得激共沉淀；所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNADNA混入混入25/24/1的苯酚的苯酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇苯酚用来变性蛋白质苯酚用来变性蛋白质但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如但是水饱和
18、酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/ /氯仿始终在下氯仿始终在下层，方便水相的回收层，方便水相的回收酚与水有很大的互溶性，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酚与水有很大的互溶性，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应）；用酚酶切反应）；用酚/ /氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被
19、除干净异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收清晰，也方便了水相的回收2.52.5倍体积预冷的无水乙醇倍体积预冷的无水乙醇与含有质粒的水相混匀，室温放置与含有质粒的水相混匀，室温放置2-5min2-5min，44离心离心12000g12000g15min15min水相含有足够多的盐，只要水相含有足够多的盐，只要2 2倍体积的乙醇，在室温放置几分倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒钟后离心就可以将质粒DNADNA沉淀沉淀如果放到如果放到2020，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，时间一长反而会导
20、致大量盐的沉淀如果感觉发生了盐的沉淀，就用如果感觉发生了盐的沉淀，就用7070的乙醇多洗几次，每次的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，或者在室温放置一个小时以上，或者44离心离心8000g8000g7min7min，并用，并用tiptip将沉淀打碎将沉淀打碎TETE缓冲液含缓冲液含RNaseRNase（50 ug/ml50 ug/ml）3737水浴水浴30min30min以降解以降解RNARNA分子，分子，-20-20保存备用，不然大量保存备用，不然大量未降解的未降解的RNARNA会干扰电泳结果会干扰电泳结果碱法抽提得到质粒样品中不含线性碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNADNA三条带
21、以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）如果不小心在溶液如果不小心在溶液IIII加入后过度振荡，会有第四条带，这条带加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb20-100kb的大肠杆菌基因组的大肠杆菌基因组DNADNA的片断的片断有时候抽提到的质粒会有有时候抽提到的质粒会有7 71010条带，这是由于特殊的条带，这是由于特殊的DNADNA序列序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数
22、不同）所致导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致琼脂糖电泳鉴定质粒琼脂糖电泳鉴定质粒DNADNA颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快超螺旋超螺旋DNADNA分子迁移率比线性分子迁移率比线性DNADNA分子快分子快线性线性DNADNA分子比开环分子比开环DNADNA分子快分子快线性线性DNADNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比分子的迁移率与其分子量的对数值成反比改造或增加基因表达的调控序列。改造或增加基因表达的调控序列。（三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造去掉不必要的去掉不必要的DNA区段。区段。减少限
23、制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的 限制性酶切位点）。限制性酶切位点）。加入易于捡出的选择性标记基因。加入易于捡出的选择性标记基因。对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。（四）几个常用质粒载体（四）几个常用质粒载体1. 1. 质粒质粒pBR322pBR3224363（1）氨苄青霉素抗性基因）氨苄青霉素抗性基因（ampr或或Apr）含）含3种限制酶种限制酶 单一识别位点单一识别位点 。（2）四环素抗性基因（）四环素抗性基因（tetr或或Tcr）内部有内部有7种，启动区内有种，启动区内有2种限
24、制酶单一识别位点种限制酶单一识别位点 。（3）DNA复制起点（复制起点（ori）结构特点结构特点pBR3224363（4）对多种常见的限制性内切）对多种常见的限制性内切 核酸酶只含有一个能切割的核酸酶只含有一个能切割的 位点位点pBR322质粒的结构特点质粒的结构特点（1）具有较小的分子量。）具有较小的分子量。 4363bp，2.6106Da（2）具有两种抗菌素抗性基因可）具有两种抗菌素抗性基因可 供作转化子的选择记号供作转化子的选择记号 （3）具较高的拷贝数，而且经）具较高的拷贝数，而且经 过氯霉素扩增之后过氯霉素扩增之后,每个细每个细 胞中可累积胞中可累积10003000个个 拷贝拷贝外源
25、外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子(ampstetr) 空载体空载体(amprtetr) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (ampstets) 导入导入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子空载体转化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体转化子空载体转化子(amprtetr)对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是平板上不能生长
26、的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。2. pUC质粒载体质粒载体1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采用采用MCS技术在技术在pBR322基础上构建的基础上构建的结构特点结构特点（4）MCS区段区段:是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。是唯一的。（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（2）氨苄青霉素
27、的抗性基因（）氨苄青霉素的抗性基因（ampr)。 但核苷酸序列发生了变化但核苷酸序列发生了变化（3） LacZ基因基因 ：编码：编码半乳半乳 糖酶的糖酶的肽链即氨基末端。肽链即氨基末端。2. pUC质粒载体质粒载体与与pBR322相比，相比， pUC质粒载体优点：质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数）具有更小的分子量和更高的拷贝数如如pUC8为为2 750bp，pUCl8为为2 686bp，控制质粒复制控制质粒复制rop基因的缺失，基因的缺失，平均每个细胞即可达平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于组织化学法检测重组体通过通过 -互补互
28、补作用，利用菌落颜色筛选重组子作用，利用菌落颜色筛选重组子（3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接可以定向克隆防止载体自我连接 -互补互补 (alpha-complementation)大肠杆菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的质，当该酶的 -片段片段和和 -片段片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶该酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些基因插入到载体的多克隆
29、位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的 片段片段。这样一来，含有。这样一来，含有功能性完整的功能性完整的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的 -片片段段就能和寄主编码的就能和寄主编码的 片段片段发生互补并具有了对底物发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是显色反应），这种现象被成为是 alpha-complementation.X-Gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 释放出的蓝色
30、物质可以释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，将整个菌落染成蓝色，非 常 容 易 辨 别 ， 如 果非 常 容 易 辨 别 ， 如 果 LacZ插入外源基因被破插入外源基因被破坏，菌落则是无色的坏，菌落则是无色的 。X-Gal -半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝检测重组体检测重组体第二节第二节 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一一 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用二二 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用三三 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用四四 修饰性工具酶修饰性工具酶（一）限制性
31、核酸内切酶的发现（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（三）限制性核酸内切酶的命名（四）（四） II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应（五）限制性核酸内切酶的消化反应一一 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用由寄主控制的由寄主控制的限制限制和和修饰修饰现象现象-20世纪世纪60年代，年代，Linn和和Arber 发现发现 (B) (K)大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K11410 410 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of platin
32、g外源外源DNA自身自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现（一）核酸限制性核酸内切酶的发现111C10-4110-4B10-410-41Kccbbkk大肠杆菌大肠杆菌噬菌体噬菌体E.coliB含有含有EcoB核酸酶和核酸酶和EcoB甲基化酶甲基化酶当当(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.coliB时，由于其时，由于其DNA中有中有EcoB核酸酶特核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的的DNA中虽然也中虽然也存在这种特异序列，但可在存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基
33、转移给限制酶识别序列的特定）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。核酸酶不能识别已甲基化的序列。限制限制修饰的酶学系统修饰的酶学系统 (B) (B)酶切位点酶切位点不被修饰不被修饰噬菌体噬菌体DNA被切割被切割酶切位点酶切位点被修饰被修饰基因组基因组DNA不被切割不被切割最早分离出的限制内切酶最早分离出的限制内切酶1968年，年，Meselson和和Yuan，大肠杆菌大肠杆菌B和和K菌株，菌株，EcoB和和EcoK， 是是I型的，没有实用型的，没有实用价值。价值。首个首个II型限制内切酶型限制内切酶1970年，年，H.O.S
34、mith等从等从Heamophilus influenzae的的Rd菌株中菌株中Hind II 。使得。使得DNA分子的体外精确切分子的体外精确切割成为可能。割成为可能。从此，相关研究展开。如从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯公司的提取和克隆。目前已纯化出化出3000种限制性内切酶中，其中有种限制性内切酶中，其中有30%是在是在NEB发现的发现的 。限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能）：是一类能够识别双链够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的
35、核酸内切酶。切开的是双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5磷酸二酯键。磷酸二酯键。（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性 特性特性1. 限制修饰活性限制修饰活性2. 内切酶的蛋白内切酶的蛋白 质结构质结构3. 限制辅助因子限制辅助因子4. 切割位点切割位点5. 特异性切割特异性切割6. 基因克隆中基因克隆中 I 型型双功能的酶双功能的酶3种不同亚基种不同亚基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特异性位点距特异性位点5端至少端至少1000bp不是（随机）不是（随机）无用无用 II 型型限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开单一成分单一成分 Mg
36、2+位于识别位点上位于识别位点上 是是非常有用非常有用 III 型型双功能酶双功能酶2种亚基种亚基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸特异性位点特异性位点3端端24-26bp处处是是用处不大用处不大（三）限制性核酸内切酶的命名（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为表示为Eco , 流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为表示为 Hi
37、n；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。（四）（四）IIII型限制性核酸内切酶的基本特点型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别 位点，通常是由位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性、识别序列的对称性 靶序列通常
38、具有双重旋转对称靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。分子）。几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 与与II型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念注注 意：意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两由同
39、尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。两种酶的任一种所识别。 粘性末端粘性末端 cohesive ends是指是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平平 末末 端端 Blunt end在识别序列对称处同时切开在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐分子两条链，产生的平
40、齐末端结构。则不易于重新环化。末端结构。则不易于重新环化。 同裂酶同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和和Xho I 是一组同尾酶。是一组同尾酶。平齐末端带带5P端的黏性末端端的黏性末端带带3OH 和和5P端的平末端端的
41、平末端例如例如Hpa和和Msp是同裂酶，识别顺序都是是同裂酶，识别顺序都是 5C|CG G3 3G GC|C5 如果其中有如果其中有5-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，不能够切割，MspI能切割。能切割。 经同尾酶消化的经同尾酶消化的DNADNA末端连接示意图末端连接示意图5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3
42、 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II 一个限制酶单位一个限制酶单位（U）指：指：在理想的反应条件（适在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，）下，1h内内中完中完全降解全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：影响酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的纯度的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度酶切反应的温度（通常为酶
43、切反应的温度（通常为37 ）DNADNA的分子结构的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液 在在“非最适的非最适的”反应条件下反应条件下, ,有些核酸内切限制酶识别序列的特有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生异性便会发生“松动松动”，从其，从其“正确正确”识别序列以外的其它位点识别序列以外的其它位点切割切割DNADNA分子，这种现象分子，这种现象叫星号活性叫星号活性。用。用* *表示。表示。 （五）限制性核酸内切酶的消化反应（五）限制性核酸内切酶的消化反应酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.
44、0 LddH2O 约约16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT（一）（一）DNA连接酶的发现连接酶的发现（二）（二） DNA连接酶作用特点连接酶作用特点（三）（三） DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件（四）（四）DNA连接的策略连接的策略二二 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用（一）（一）DNA连接酶的发现连接酶的发现环形环形DNADNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 切口的酶存在。切口的酶存在。 首个首个DNADNA连接酶连接酶(l
45、igase)(ligase)19671967年，年，大肠杆菌大肠杆菌DNA连连接酶接酶，是大肠杆菌基因编码是大肠杆菌基因编码 。1970年，发现了年，发现了T4DNA连接酶连接酶 ， 由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体基因编码的。基因编码的。（二）（二）DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A.A. 连接的连接的两条链两条链必须分别具有自由必须分别具有自由3 3OHOH和和5 5P P，而且这两，而且这两 个基团彼此个基团彼此相邻相邻；B. B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coli DNA连接酶连接酶 连接具互补碱基黏
46、性末端连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），最初研究表明），现在研究可连接平末端；需现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，需连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助辅助因子，活性高，常用。因子，活性高，常用。 是两条链是两条链因此不能将两条单链连接起来或使单链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。环化起来。 OH P 是相邻的是相邻的因此不能封闭因此不能封闭gap，只能封闭，只能封闭nick.gap NONick OK（三）（三）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶连接反应的条件影响
47、连接效率的因素有：影响连接效率的因素有：A A 温度（通常在温度（通常在4 415 15 ）B ATPB ATP的浓度的浓度(10ML )C C 连接酶浓度（连接酶浓度（一般平末端大约需一般平末端大约需1 12U2U，黏性末端仅需，黏性末端仅需0.1U0.1U）D D 反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜）E E 插入片段和载体片段的摩尔比（插入片段和载体片段的摩尔比（ 1 1 1 15 5 1 1） （四）（四）T4 DNA连接酶对目的连接酶对目的DNA片段片段和载体连接的一般方案和载体连接的一般方案1 连接反应一般在灭菌的连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。离心管中进行。
48、2 10l体积反应体系中：取载体体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例，加入一定比例 的外源的外源DNA 分子（一般线性载体分子（一般线性载体DNA分子与外源分子与外源DNA 分子摩尔数为分子摩尔数为1 11 5），补足），补足ddH2O 至至8l。3 轻轻混匀，稍加离心，轻轻混匀，稍加离心，56水浴水浴5min后，迅速转入冰浴。后，迅速转入冰浴。4 加入含加入含ATP的的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位，连接酶合适单位， 用用ddH2O补至补至10l，稍加离心，在适当温度（一般，稍加离心，在适当温度（一般14 16）连接）连接8-14hr。粘性末端粘性末端DN
49、A片段的连接片段的连接DNA连接酶连接法连接酶连接法NickNick平末端平末端DNA片段的连接末端同聚物加尾法片段的连接末端同聚物加尾法33553355末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA连接酶连接酶平末端平末端DNA片段的连接衔接物连接法片段的连接衔接物连接法 衔接物衔接物(linker)(linker)，也叫接头，也叫接头，是有人工化学合成的一段是有人工化学合成的一段10-10-1212个核苷酸组成，具有有个核苷酸组成，具有有1 1个或几个限制性酶切位点的平末端的个或几个限制性酶切位点的平末
50、端的双链寡核苷酸短片段。双链寡核苷酸短片段。GGATCCCCTAGG+BamHI切割切割GATCCG连接酶经连接酶经BamHI切割的切割的pBR322GCCTAGBamHI衔接物衔接物dsDNAGGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG连接酶连接酶重组重组DNA分子分子GATCCGGCCTAG（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（二）（二）Klenow片段片段酶酶（三）（三）T4 DNA聚合酶聚合酶（四）逆转录酶（反转录酶）（四）逆转录酶（反转录酶）三三 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ 4dNTP
