1、第第6章章分子生物学研究方法分子生物学研究方法(下下)转录转录组：指一个细胞内基因组组：指一个细胞内基因组DNA转录得到的所有转录产物以转录得到的所有转录产物以及转录物在细胞特定发育时期或特定生理条件下的表达水平及转录物在细胞特定发育时期或特定生理条件下的表达水平All transcripts All mRNAs6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.1.1 转录转录组测序组测序EST（Expressed Sequence tags，表达序列标签，表达序列标签 ）：）：EST是从一个随机选择的是从一个随机选择的cDNA 克隆进行克隆进行5端和端和3端单一次测端单一次测序获得的短的序获得的短
2、的cDNA 部分序列，代表一个完整基因的一小部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从部分，在数据库中其长度一般从20 到到600bp 不等，平均不等，平均长度为长度为360 120bp。EST 来源于一定环境下一个组织总来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的所构建的cDNA 文库，因此文库，因此EST也能说明该组织中也能说明该组织中各基因的表达水平。各基因的表达水平。基因表达系列分析基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)：是以是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术
3、。式的技术。 SAGE的原理的原理 ：1，一个，一个910碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个能够唯一确认一种转录物。例如，一个9碱基顺序能够分碱基顺序能够分辨辨262,144个不同的转录物，而人类基因组估计仅能编码个不同的转录物，而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个种转录物，所以理论上每一个9碱基标签能够代表一碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。种转录物的特征序列。2，如果能将，如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以
4、连续的数据形式输入计算机将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。转录物进行分析。 方法方法:n以以911bp作为标签（作为标签（tag）49262144组合组合n串联串联tag并通过两端接头并通过两端接头PCR扩增扩增n扩增产物进行测序扩增产物进行测序n每个每个tag通过通过Genebank或或EST数据库进行比对数据库进行比对n确认确认tag代表的基因表达情况代表的基因表达情况Next Generation SequencingnSample fragmentationnLibrary preparat
5、ionnSequencing reactionnData analysisRoche 454 焦磷酸测序焦磷酸测序Pyrophosphate SequencingIllumina Solexa 合成测序合成测序Sequence by SynthesizeABI SOLiD 连接法测序连接法测序Sequence by Ligation高通量测序高通量测序(High-throughput sequencing)技术简介技术简介Illumina Solexa 合成测序Sequence by Synthesize基本原理Clonal Single Molecule Arrays单分子克隆单分子克隆10
6、00 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experimentPrepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form clusters20 micronsSequenceReversible Terminator Chemistry可逆终止反应可逆终止反应O PPPHNNOOcleavagesitefluor3blockNext cycleIncorpora
7、tionDetectionDeblock; fluor removalODNAHNNOO3O5free 3 endXOHAll 4 labelled nucleotides in 1 reactionSequencing-by-Synthesis (SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTAFirst base incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n: Add sequencing reagents and re
8、peat1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应进行下一轮测序反应123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T The identity of each base of a cluster is read off from sequential im
9、ages根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列序列Base calling from the raw dataIllumina Solexa 测序测序 WorkflowIllumina Sequencing Technology有参考基因组序列生物信息分析有参考基因组序列生物信息分析 基因结构优化基因结构优化 鉴定基因可变剪接鉴定基因可变剪接 预测新转录本预测新转录本 SNP 分析分析 基因融合鉴定基因融合鉴定5.4.1 RACE 法克隆基因全长法克隆基因全长(Rapid Amplification of cDNA End
10、s)n根据已知片段设计引物，根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因技术得到基因的全长的全长cDNA序列。序列。ncDNA 5端的快速扩增法端的快速扩增法5RACEncDNA 3端的快速扩增法端的快速扩增法3RACETdT 法原理法原理末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶5 RACE原理原理Adaptor-Adding Method 原理原理Self-Ligation 法法3RACE是在反转录酶的作用下，以连是在反转录酶的作用下，以连有 可 以 和有 可 以 和 p o l y A 配 对 的配 对 的oligo(dT)的锚定引物启始的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。第一条链的合成
11、。用用RNaseH 降解模板降解模板mRNA。用通用锚定引物和基因片段内用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行部特异引物进行PCR扩增得扩增得到目的到目的3片段，并可用片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和的方法继续进行检测和扩增。扩增。nRNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个一个mRNA前前体产生不同的体产生不同的mRNA剪接异构剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪体的过程。可分为：平衡剪切、切、5选择性剪切、选择性剪切、3选择性剪切、外显子遗漏型剪切及选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究
12、某个基法研究某个基 因是否存在因是否存在选择性剪切。选择性剪切。 果蝇果蝇Dscam基基因可因可 以通过可变以通过可变剪接产生剪接产生38000多多种可能的种可能的mRNA异构体异构体6.1.2 RNA选择性剪接技术选择性剪接技术选择性剪切的不同类型选择性剪切的不同类型 RT-PCR检测检测5个拟南芥转录个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切调控因子基因的选择性剪切Hybridization of Nucleic AcidsRNADNA1DNA2DNASouthernhybridizationNorthernhybridization探针探针分子杂交技术分子杂交技术 （一）（一）DNA变性与复性
13、变性与复性 DNA变性变性 1、定义：某些理化因素导致两条、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的链间的氢链断裂变为单链的过程，称氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。变性。2、变性的方法：、变性的方法：（1）热变性：温度升高到）热变性：温度升高到90100时，双链核酸时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：）酸碱变性：pH值低于值低于3或高于或高于10时，双链核时，双链核 酸分子链酸分子链 间的氢键断裂。间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。双链核酸分子链间的氢
14、键断裂。3、变性后的理化性质变化：、变性后的理化性质变化： 粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加 复性复性(退火退火)： 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡和寡核苷酸核苷酸/RNA。2、复性过程、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链）单链分子间碰撞形
15、成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子）形成完整的双链分子核酸的分子杂交核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷将带有互补的特定核苷酸序列的单链酸序列的单链DNA或或RNA混合在一起，其相混合在一起，其相应的同源区段就会退火应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核链分子就被称为杂种核酸分子。酸分子。一、一、
16、 分子杂交的基本方法分子杂交的基本方法nSouthern 印迹法印迹法nNorthern 印迹法印迹法n原位杂交原位杂交n斑点印迹杂交斑点印迹杂交nWestern 印迹法印迹法nEastern印迹法印迹法n液相杂交液相杂交固相杂交固相杂交核酸分子杂交核酸分子杂交(固相杂交固相杂交)操作程序操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针二、二、Southern blo
17、ttingDNA印迹与杂交印迹与杂交n1975年，英国年，英国Edwen Southern创建创建n定义：检测定义：检测DNA杂交方法，即将杂交方法，即将DNA电泳分离、转印电泳分离、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。到固相支持物上，用探针进行检测的方法。n应用：基因组应用：基因组DNA的定性和定量分析的定性和定量分析 基因诊断、分子克隆、法医学等基因诊断、分子克隆、法医学等 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不
18、转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地动地“吸印吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交印迹杂交”。材料：材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（膜（DEAE）步骤：步骤：第一第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移膜上核酸印迹转移第二第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的记的DNA或或RNA探针进行杂交探针进行杂交 杂杂 交交 模模 式式 图图放射自显影放射自显影DNA印迹转
19、移印迹转移探针杂交探针杂交Southern bloting的主要步骤的主要步骤1.待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切2.待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性4.Southern转膜转膜(印迹印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法5.Southern杂交杂交(预杂交、杂交、洗膜预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测杂交结果的检测（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源
20、杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern 凝胶凝胶转移杂交技术转移杂交技术1. 待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切nDNA的提取原理：裂解细胞，使的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，交替使用酚、释放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质。氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质。步骤解析步骤解析2. 待测待测DNA 样品的电泳分离：样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3. 凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性 凝胶置于凝胶置于NaOH溶液中使溶液中使DNA变性断裂为较短的单链变性断裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。，
21、中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4. Southern转膜转膜(印迹印迹) 待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上，即印迹。相支持物（如纤维素膜）上，即印迹。 4.1 固相支持物的选择固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能具有良好的机械性能 非特异吸附少非特异吸附少4.2 常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸
22、纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是底低。缺点是DNA分子结合不牢固分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同与膜共价结合；对不同 大小的大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低力较上述两种膜低4.3 Southern印迹的常用方法印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐
23、转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移转移到固相支持物上。到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的时带动凝胶中的DNA片段垂直片段垂直向上运动，凝胶中的向上运动，凝胶中的DNA片段片段移出凝胶而滞留在膜上。移出凝胶而滞留在膜上。（2）电转法）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的利用电场的
24、电泳作用将凝胶中的DNA转移到转移到固相支持物上。固相支持物上。（3）真空转移法）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜上。 各种转移方法的比较：各种转移方法的比较： i) 毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转移仪器，
25、毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低但转移效率低,（扩散法为（扩散法为70%，毛细管法，毛细管法80%）耗）耗时多。时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。仪。转移的最佳条件：转移的最佳条件： i) 固定基质的选择固定基质的选择 ii) 转移前预处理：转移前预处理：DNA和和RNA分子变性，蛋白质则需除去分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移大分
26、子的转移对于分子量较大的对于分子量较大的DNA片段，必须进行片段，必须进行原位断裂原位断裂后再进行后再进行转移，断裂转移，断裂DNA分子最佳长度为分子最佳长度为1-2kb。其步骤是：其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次处理凝胶两次（每次15分钟）分钟）水洗水洗0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次两次，每次15分钟分钟转移。转移。 5、Southern杂交杂交 1、预杂交：封闭膜上能与、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点结合的位点 预杂交液为不含预杂交液为不含DNA探针的杂交液探针的杂交液 2、杂交：液相中的、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测探针与膜上的待测DNA杂交杂
27、交 双链双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA 6. 杂交结果的检测杂交结果的检测化学显色或放射自显影化学显色或放射自显影标记的标记的探针探针Southern Blotting overview探针探针是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把标记的分子叫检测的一种技能，我们把标记的分子叫探针探针(Probe)。 从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有从化学和生物学意义上理解，探针是
28、一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。如抗供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。如抗体体-抗体、外源凝集素抗体、外源凝集素-碳水合合物、亲合素碳水合合物、亲合素-生物素、受生物素、受体体-配基（配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针）以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶靶分子反应。分子反应。 （一）探针的种类（一）探针的种类 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针（二）标记物（二）标记物理想标记物应具备的特性：理想标记物应具备的特性： 高度灵敏性高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不
29、影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性 探针标记物探针标记物 放射性标记物放射性标记物 32P 高放射性高放射性 半衰期半衰期14.3 d 35S 放射性较弱放射性较弱 半衰期半衰期87.1 d 3H 放射性弱放射性弱 半衰期半衰期12.35 a 非放射性标记物非放射性标记物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光
30、探针：标记物与某种底物反应发光，化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光可使发光底物发光 BiotinAvidin（三）标记方法（三）标记方法 体内标记法：体内标记法：将核素标记的化合物作为合成将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新核素掺入到新合成的核酸分子中，如合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到胸苷可掺入到DNA中，中， 3H-尿苷可掺入到尿苷可掺入到RNA中。中。 体外标记法：体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与化学标记法：标记物分子上的活性基
31、因与 探针分子上的某些基因反应，探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上掺入到探针上 酶促标记法酶促标记法切口平移法（切口平移法（nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外切酶活核酸外切酶活性在切口处将旧链从性在切口处将旧链从5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的
32、的53 聚合酶催化下，以互补的聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将单链为模板依次将dNTP连接到切口的连接到切口的3 末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入链，同时将标记的核苷酸掺入到新的到新的DNA链中链中随机引物法随机引物法 其原理是随机引物能其原理是随机引物能与各种单链与各种单链DNA模板结模板结合，作为合成新链的引合，作为合成新链的引物，在物，在DNA聚合酶的催聚合酶的催化下，按化下，按53 方向合成方向合成一新的一新的DNA链，其核苷链，其核苷酸序列与模板酸序列与模板DNA完全完全互补。另一单链互补。另一单链DNA模模板同样合成一条新的完板同样
33、合成一条新的完全互补的全互补的DNA链。合成链。合成时，带放射性核素标记时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的核苷酸掺入到新合成的的DNA分子中。分子中。随机引物法所具有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单链、单链DNA或或RNA探针的探针的标记；标记；2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌处理浓度掌握不当所带来的一系列问题；握不当所带来的一系列问题；3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/g DNA以上；以上；4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。（四）探针的
34、纯化（四）探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除片段，可去除dNTP和蛋白质；和蛋白质；2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物等物质分离，常用凝胶基质是质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50；3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而
35、此法则是利用离心的方式来纯化探针。的方式来纯化探针。 四、影响杂交的因素四、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度过高影响杂，浓度过高影响杂 交效率交效率2、温度：、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025； （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺杂交，加甲酰胺降低降低Tm值；值； （3）用寡核苷
36、酸探针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5。 3、离子强度：、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加；杂交率增加； （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度。浓度。 4、甲酰胺：、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂值，能降低杂交液的温度，低温时探针与
37、待测核酸杂交更稳定，交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶甲酰胺溶液在液在3542 杂交；杂交； （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在溶液在68杂交。杂交。 5、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度；顺序的总长度； （2）两个）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于相对杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性 。6、非
38、特异性杂交反应：、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和和高分子化合物。如鲑精高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉。溶液或脱脂奶粉。 Northern印迹杂交印迹杂交 1、 Northern blot印迹杂交是指待测印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液液相杂交。
39、相杂交。 2、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同基本相同 3、鉴别、鉴别RNA 4、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 5、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNA Isolate mRNA (Different Lengths) Probe with labeled DNANorthern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性 2、转膜：、转膜：R
40、NA转膜前不需变性和中和处理，转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA斑点印迹杂交斑点印迹杂交(dot blotting)n将将RNA或或DNA变性后直接点样于纤维素膜或尼龙膜变性后直接点样于纤维素膜或尼龙膜上上n优点：简单、快速、可同时检测多个样品优点：简单、快速、可同时检测多个样品n缺点：特异性不高、不能鉴别核酸分子量缺点：特异性不高、不能鉴别核酸分子量n应用：确定应用：确定DNA样品之间的同源性样品之间的同源性核酸原位杂交核酸原位杂交(in situ hybridization
41、)1. 定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。检测的方法。2. 特点：特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤1. 细胞或组织的固定：载玻片细胞或组织的固定：载玻片2. 组织细胞杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3. 探针的选择和标记探针的选
42、择和标记4. 杂交杂交5. 杂交结果检测杂交结果检测1. 荧光染色体原位杂交荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在序列在染色体上的定位。染色体上的定位。 2. 多色荧光染色体原位杂交多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH )3. 比较基因组原位杂交比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridizatio
43、n；CGH )由原位杂交发展起的一些新技术由原位杂交发展起的一些新技术多色多色FISH（M-FISH技术）技术）荧光原位杂交荧光原位杂交液相杂交液相杂交n指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。分子的过程。Western BlottingWestern Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。检测。Western
44、Blotting 方法一: 直接法优点：优点：1.快速（一种抗体）快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非没有二抗交叉反应引起的非特异性条带特异性条带缺点：缺点：1.免疫反应性降低免疫反应性降低2.无信号二级放大无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵,使用不方使用不方便便Western Blotting 方法二方法二: 间接法间接法n优点：优点：1. 免疫特异性不受标记影响免疫特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）合位点）3. 多种标记的二抗可供选择多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的可选择不同的Markern缺点：缺点：1
45、. 交叉反应引起的非特异性条带交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化额外的二抗孵育以及条件优化间接间接Western Blotting操作流程操作流程: Western Blot 优点优点p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原特异敏感的抗原-抗体反应抗体反应p 1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白Western Blot应用应用q目的蛋白的表达特性分析目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析目的蛋白的表达量分析Western Blot 流程流程l蛋白样品的制
46、备蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜转膜封闭封闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂最常用的溶剂 。有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。?通过层析
47、或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取蛋白样品的定量蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法法(考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法)、Lowry法法(Folin-酚试剂法酚试剂法)、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。测定样品浓度。蛋白样品的变性蛋白样品的变性n2SDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：nDTT可临用前以可临用前以1：4比例混合加入，亦可全
48、部配好分装，比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。冻存。n按按1:1比例与蛋白质样品混合，比例与蛋白质样品混合，95100加热加热515min，冰上冷却后，冰上冷却后再上样，上样量一般为再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量，总蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰溴酚兰20%甘油甘油ddH2OStaking gelSeparating gel 1 2 3 M电泳之后凝胶染色扫胶电
49、泳之后凝胶染色扫胶转膜转膜n要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如（例如NC膜）上，通常有两种方法：膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法毛细管印迹法和电泳印迹法和电泳印迹法。n常用的电泳转移方法有常用的电泳转移方法有湿转和半干转湿转和半干转。两者的原理完。两者的原理完全相同，只是用于固定胶全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械膜叠层和施加电场的机械装置不同。装置不同。 转移膜的选择转移膜的选择n最常用于最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维的转移膜主要是硝酸纤维素素(Nitrocellulose，NC)膜和聚偏二氟
50、乙烯膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用膜，此外也有用尼龙膜、尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似膜的特点相似,主要用于核酸杂交。主要用于核酸杂交。湿转系统湿转系统注意事项：注意事项：1.胶在负极，膜靠近正极胶在负极，膜靠近正极2.保证每层之间没有气泡保证每层之间没有气泡3.转膜过程产生大量热量，需冰浴转膜过程产生大量热量，需冰浴夹板夹板海绵海绵滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜滤纸滤纸海绵海绵正极正极负极负极 Hoefer 全能全能型转印系统型转印系统半干转印系统半干转印系统 Hoefer 半干半干
