1、第三章 生物质谱技术蛋白质组学研究思路和技术蛋白质组学研究思路和技术二维电泳质谱技术生物信息学前言前言n1）质谱技术的特点）质谱技术的特点质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器(Thompson)，但实际上质谱，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比仪提供的是分子的质量与电荷比(m/z or m/e)。质谱法是一强有力的分析技术，它可用于未知化合物的鉴定、定量分析、质谱法是一强有力的分析技术，它可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方面。分子结构及化学特性的确定等方面。所需化合物的量非常低：所需化合物的量非常低：10-12g, 或或
2、10-15 mole；应用范围广应用范围广：1） 有机质谱法：有机质谱法：生物、医药、聚合物、法医和环境等方生物、医药、聚合物、法医和环境等方面；面；2） 无机质谱法：无机质谱法： 地球化学，地质矿产和无机元素分析鉴定等方面地球化学，地质矿产和无机元素分析鉴定等方面。质谱图意义质谱图意义nA: 离子的相对强度离子的相对强度(Y axis)nB: 离子的质量与电荷比离子的质量与电荷比(m/z, X axis)nC: 质谱图中最强的峰称为基峰质谱图中最强的峰称为基峰(base peak)nD: 相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度nE: 所有质谱峰对应的是离子电
3、信号强度和离子应在的所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在的m/z位置而非真实的离子强度和离子位置而非真实的离子强度和离子.nF: 棒状谱棒状谱(centroidal peak)nG: 高斯峰高斯峰(gauss peak)FG质谱仪技术指标质谱仪技术指标:n灵敏度灵敏度(sensitivity, S/N at ng/L or pg/L)n分辨率分辨率(resolution, R=m/m, (1)半峰宽半峰宽, (2)峰谷峰谷10%)mm10%100%m+1Full-width at half-maximum50%n准确度准确度(accuracy)：ppm (part per million
4、)n稳定性稳定性(stability)：仪器在一定时间间隔内某离子的仪器在一定时间间隔内某离子的m/z测测量值的变化。量值的变化。n质量范围质量范围(mass range)：仪器可以检测离子仪器可以检测离子 m/z 的范围。的范围。n动态范围动态范围(dynamic range)：在动态范围内在动态范围内, 样品量与仪器样品量与仪器输出的信号应成正比例关系。输出的信号应成正比例关系。基本原理简介基本原理简介n质谱仪包含了五个主要的系统：质谱仪包含了五个主要的系统：n将不同型态样品导入质谱仪的将不同型态样品导入质谱仪的进样系统进样系统(sample introduction)n使样品游离成气态离
5、子形式的使样品游离成气态离子形式的离子源系统离子源系统(ionization source)n依质荷比依质荷比(m/z : mass to charge ratio)不同分离各个样品离不同分离各个样品离子的子的质量分析仪质量分析仪(mass analyzer)n探测各样品探测各样品离子探测器离子探测器(detector)n将离子探测信号进行转换的将离子探测信号进行转换的数据处理系统数据处理系统(data system)。 基本原理简介基本原理简介-概念概念n质谱质谱(MS)是利用是利用离子化离子化的带电物体在电场中的移动来探测出的带电物体在电场中的移动来探测出分子的重量。分子的重量。n所要测的
6、蛋白质样本先做所要测的蛋白质样本先做气相气相的处理且的处理且离子化离子化，再利用，再利用荷质荷质比比(m/z)、也就是分子量对其所带电荷的比值来做分离的动、也就是分子量对其所带电荷的比值来做分离的动作，而其所带的电荷有可能是正的也可能是负的。作，而其所带的电荷有可能是正的也可能是负的。n大部分的质谱可被用在两个方面大部分的质谱可被用在两个方面:n1. 待测物的组成待测物的组成n2. 待测物的结构待测物的结构质谱与蛋白质质谱与蛋白质n对于蛋白质的对于蛋白质的“鉴定鉴定”，较早期的方法是利用，较早期的方法是利用Edman sequencing，或是二维凝胶电泳技术。，或是二维凝胶电泳技术。n但利用
7、这些技术花费的时间较长；如但利用这些技术花费的时间较长；如Edman sequencing，一天大概只能鉴定出一个或二个，一天大概只能鉴定出一个或二个peptides。n对于研究蛋白质组学的研究员来说，要用这些传统的对于研究蛋白质组学的研究员来说，要用这些传统的方法来解出自然界中成千上万的蛋白质结构，实在是方法来解出自然界中成千上万的蛋白质结构，实在是天方夜谭。天方夜谭。n质谱质谱(Mass spectrometry)的发明，带给了研究蛋白质的人的发明，带给了研究蛋白质的人无限的希望。无限的希望。n但从前质谱仅运用于小分子，对于像蛋白质这样大的分子但从前质谱仅运用于小分子，对于像蛋白质这样大的
8、分子是一筹莫展；因为是一筹莫展；因为 在进行质谱分析时，必须将分子气化在进行质谱分析时，必须将分子气化及带上电荷。对于较小的分子而言，并不是相当困难，然及带上电荷。对于较小的分子而言，并不是相当困难，然而对于大的生物分子（如蛋白质分子），要将分子气化及而对于大的生物分子（如蛋白质分子），要将分子气化及帶电，同时不能伤害分子的完整性，非常不容易。帶电，同时不能伤害分子的完整性，非常不容易。n19601980，科学家发展出许多方式，尝试将生物巨分子，科学家发展出许多方式，尝试将生物巨分子从液相游离化成为气相分子，例如比较早期的化学游离法、从液相游离化成为气相分子，例如比较早期的化学游离法、或是电浆
9、游离法。但是这些方法只能应用到或是电浆游离法。但是这些方法只能应用到10kDa以內的以內的分子，对于动辄数百至数千分子，对于动辄数百至数千kDa的蛋白质巨分子来说，还的蛋白质巨分子来说，还有相当远的一段路要走。有相当远的一段路要走。n拜拜2002年的三位诺贝尔化学奖得主所赐，将质谱的技术年的三位诺贝尔化学奖得主所赐，将质谱的技术做了最有效率的使用，且突破了小分子及固液相的限制，做了最有效率的使用，且突破了小分子及固液相的限制，成功的运用这种技术于蛋白质的研究上。成功的运用这种技术于蛋白质的研究上。n他们是：他们是： n目前有两种做法能使得蛋白质转变为气态离子而不目前有两种做法能使得蛋白质转变为
10、气态离子而不会改变其结构与形态。会改变其结构与形态。n由由John B. Fenn所发展的方法是运用一个很强的所发展的方法是运用一个很强的电场将试样喷洒出去电场将试样喷洒出去(ESI)，而产生一个个带电荷，而产生一个个带电荷并能自由飞翔的离子。并能自由飞翔的离子。n运用一个强烈的激光脉冲，在适当的条件下运用一个强烈的激光脉冲，在适当的条件下(视视能量，与试样的结构和化学环境而定能量，与试样的结构和化学环境而定)运作，试运作，试样可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离样可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离子子 (MALDI)，由，由 Koichi Tanaka最先提出的技术。最先提出的技术
11、。基本原理简介基本原理简介-电离（电离（Ionization）n质谱进行分析时，首先要做的就是离子化质谱进行分析时，首先要做的就是离子化(ionization)，也就是将待测物处理过后产生气相的，也就是将待测物处理过后产生气相的离子，并带有电荷。离子，并带有电荷。n软电离：保持分子的完整性。软电离：保持分子的完整性。n两种最有效的测定蛋白质质谱的电离（软电离）方两种最有效的测定蛋白质质谱的电离（软电离）方法：法：nMALDInESISoft Ionization337 nm UV laserMALDIcyano-hydroxycinnamic acidGold tip needleFluid
12、(no salt)ESI+_电喷雾电离技术电喷雾电离技术ESI （Electrospray Ionisation）电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱技术技术n利用高电压（约利用高电压（约3000k伏）将伏）将溶于水中的蛋白质经由喷嘴溶于水中的蛋白质经由喷嘴喷出喷出n许多带正电的小液滴，许多带正电的小液滴，在喷在喷口高电压作用下形成带电荷口高电压作用下形成带电荷的微滴的微滴n随着微滴中的挥发性溶剂蒸随着微滴中的挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电场随半径发，微滴表面的电场随半径减少而增加减少而增加n到达某一临界点（电荷的库到达某一临界点（电荷的库仑排斥力和表面张力相等）仑排斥力和表面张力相等）时，产生库仑爆炸
13、，液滴炸时，产生库仑爆炸，液滴炸碎，产生更小液滴。碎，产生更小液滴。RayleighLimitReached+-+-+-+-Evaporation+Charged Droplets试样离子准分子离子Analyte Ions Solvent Ion ClustersSalts/Ion pairsNeutrals+-其他离子电喷雾电喷雾(ESI)ESIn电喷雾电离质谱术是一种分析生物分子的方法。由于电喷雾电离质谱术是一种分析生物分子的方法。由于可使用低的样品流速及与分离技术结合，其灵敏度大可使用低的样品流速及与分离技术结合，其灵敏度大大增加，已成为分析蛋白质的重要工具。大增加，已成为分析蛋白质的重
14、要工具。n因一种分子可以被喷出不同核质比的气体分子，因此因一种分子可以被喷出不同核质比的气体分子，因此经由适当的运算（经由适当的运算（Fenn在在1987年提出年提出multiple charge theory），精确的算出被分析分子的分子量。），精确的算出被分析分子的分子量。n相同的分子可能携带不同的电荷，因此会得到一系列相同的分子可能携带不同的电荷，因此会得到一系列的信号，虽然这个现象使得图谱变得复杂，但这也产的信号，虽然这个现象使得图谱变得复杂，但这也产生了更多的资讯，使得鉴定的工作变得较容易。生了更多的资讯，使得鉴定的工作变得较容易。ESIn样品溶解在极性的、挥发性缓冲液中样品溶解在极
15、性的、挥发性缓冲液中 （不含（不含盐）盐） ，通过不锈钢毛细管，通过不锈钢毛细管 （70 - 150 mm） 以以10-100 mL/min的速度进样。的速度进样。n将将3-4 kV的高压加在喷嘴上，使样品变成雾状的高压加在喷嘴上，使样品变成雾状液滴。液滴。n雾状液滴直接穿过高真空区域，液滴逐渐挥发，雾状液滴直接穿过高真空区域，液滴逐渐挥发，尺寸慢慢接近样品分子的尺寸尺寸慢慢接近样品分子的尺寸 （依然携带一定（依然携带一定的电荷）。的电荷）。Positive or Negative Ion Mode?n如果样品具有容易接收如果样品具有容易接收H+ 的功能团的功能团 （例如（例如 氨氨基化合物、
16、肽和蛋白质上所带的氨基）基化合物、肽和蛋白质上所带的氨基） ，那么，那么使用正离子检测法。使用正离子检测法。n如果样品具有容易失去如果样品具有容易失去H+ 的功能团的功能团 （例如（例如 羧羧酸、核酸和糖上所带的羟基）酸、核酸和糖上所带的羟基） ，那么使用负离，那么使用负离子检测法。子检测法。ESIn溶液溶液pH值的高低，控制了样品的官能基值的高低，控制了样品的官能基（functional group）离子化的离子化的状状況況。npH值高值高于于5，C-terminal的部份才会离子化，的部份才会离子化，pH值低值低于于7的時候，的時候，N-terminal及氨基酸及氨基酸histidine的
17、氮才会游离，的氮才会游离，lysine和和arginine的的N端通常要低端通常要低于于pH8.5才会离子化，这表示在酸才会离子化，这表示在酸性溶液中（如性溶液中（如pH3.5或更低）会使蛋白质或更低）会使蛋白质带带正正电电，在碱性环境中，在碱性环境中则则让蛋白质让蛋白质带负电带负电，ESI一一般都在酸性环境下分析般都在酸性环境下分析带带正正电电的的peptide ion。ESIn当样品的当样品的 MW 小于小于 1200 Da时，时，ESI法会产生法会产生 单电荷离子，质谱测定的单电荷离子，质谱测定的 MW 等于样品质量等于样品质量 + H（1.008 Daltons）n大分子样品大分子样品
18、（如（如peptides）会生成带多种电荷会生成带多种电荷 （from 2 to 20 ）的样品离子。的样品离子。n带多种电荷的样品离子会产生高斯分布的质谱带多种电荷的样品离子会产生高斯分布的质谱峰。峰。Multiply Charged IonsESI spectrum of HEW Lysozyme（溶菌酶）（溶菌酶）MW = 14,305.14Peptide Masses From ESIm/z = mass-to-charge ratio of each peak on spectrumMW = MW of parent moleculen = number of charges (in
19、teger)H+ = mass of hydrogen ion (1.008 Da)每一个质谱峰可表示为：每一个质谱峰可表示为：MW + nH+nm/z =根据根据ESI图谱计算肽段电荷、分子量图谱计算肽段电荷、分子量n选取任意两个相差一个电荷的两个峰n=（m/z21）/（m/z1m/z2）MW=（m/z11）nMW + nH+nm/z1 =MW + (n+1)H+n+1m/z2 =Peptide Masses From ESICharge (n) is unknown, Key is to determine MWChoose any two peaks separated by 1 cha
20、rge2 equations with 2 unknowns - solve for n firstn = 1300.4/130.2 = 10Substitute 10 into first equation - solve for MWMW = 14316 - (10 x1.008) = 14305.914,305.14MW + nH+n1431.6 =MW + (n+1)H+n+11301.4 =ESI Transformationn软件能够将上述的多重谱线转换成单一(zero charge)的谱图，通过这个谱图可直接得到样品的MW 。n这使得MS谱图的解释变得更简单，信噪比得到很大提高。
21、Maximum EntropyESI and Protein StructurenESI图谱可以灵敏地反映蛋白质的构造 。n大部分折叠、拼接或复合的蛋白质的质谱是非高斯分布 的，在图谱上只能观察到少量的峰，代表较高的m/z 值。n变性或open form 蛋白质/多肽较容易离子化，其谱图是多个高斯分布的峰。ESI and Protein ConformationNative Azurin + CuDenatured Azurin细菌氧化还原蛋白细菌氧化还原蛋白 AzurinESI检测蛋白的辅基化检测蛋白的辅基化2012042504-T02+PPTP2P3 #669-701 RT: 24.64-
22、25.73 AV: 33NL: 9.20E7T: + c ESI Full ms 400.00-2000.00700800900100011001200130014001500m/z-100-80-60-40-20020406080100120140160180200Relative Abundance760.48802.64722.53849.79902.85962.971031.621111.131203.68 1279.221475.31scn ACP0-2+P2P3Found: 14,43018+17+16+21+20+19+15+688.142012022412-T02 #874-8
23、87 RT: 32.10-32.54 AV: 14 NL: 6.25E7T: + c ESI Full ms 400.00-2000.00700800900100011001200130014001500m/z-100-80-60-40-20020406080100120140160180200Relative Abundance760.36722.41802.52849.69902.71962.831031.461111.26 1173.401312.521451.56 1512.86scn ACP0-2+hybridFound: 14,42818+17+16+21+20+19+15+688
24、.212012011802-T02 #858-890RT: 31.44-32.52AV: 33NL: 4.17E8T: + c ESI Full ms 400.00-2000.00700800900100011001200130014001500m/z-100-80-60-40-20020406080100120140160180200Relative Abundance760.46802.62722.46849.75902.79962.961031.681110.901203.73 1278.60 1366.041520.6019+18+17+21+scn ACP0-2Found: 14,4
25、3020+16+688.1615+2012030101-T02+PPT #664-673RT: 24.51-24.82AV: 10NL: 3.19E7T: + c ESI Full ms 400.00-2000.00700800900100011001200130014001500m/z-100-80-60-40-20020406080100120140160180200Relative Abundance739.40821.41704.23869.73924.00985.531055.821136.321229.461367.611469.4519+18+17+21+scn ACP0-2+S
26、chPPTFound: 14,76820+16+778.2615+672.3022+3n样品引入方式：样品引入方式： a) 流动注射；流动注射； b) LC/MS 接口；接口； c) 流速一般小于流速一般小于 1mL/min n优点：优点： a) 离子性，极性化合物；离子性，极性化合物； b) M +nHn+ 或或 M -nHn- c) m/z 小于小于4000； d) 低化学噪音；低化学噪音； e) 容易获得碎片离子信息；容易获得碎片离子信息； f) MS/MSn缺点缺点: a) 不能分析非极性化合物；不能分析非极性化合物； b) 金属离子干扰：金属离子干扰：Na，K； c) 离子源结构复杂
27、；离子源结构复杂；n质量范围质量范围: 分子量可达分子量可达1,000,000 Da影响影响ESI因素因素n样品的样品的pKa 和溶液的和溶液的pH。样品在电喷雾溶液中是否已预。样品在电喷雾溶液中是否已预先形成离子取决于样品的先形成离子取决于样品的pKa值。在低值。在低pH值条件下有利于值条件下有利于样品分子质子化，提高样品分子质子化，提高pH导致灵敏度和分子所带电荷的导致灵敏度和分子所带电荷的数目减少。在正离子检测中，溶液数目减少。在正离子检测中，溶液pH应较低，可用醋酸、应较低，可用醋酸、三氟乙酸三氟乙酸(TFA)调节。溶液调节。溶液pH通常至少低于样品的通常至少低于样品的pKa 2个单位
28、。在负离子检测中，溶液个单位。在负离子检测中，溶液pH应较高，可用氨水调应较高，可用氨水调节，使溶液节，使溶液pH比样品比样品pKa高高2个单位。个单位。n溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和表面张力。常用的表面张力。常用的ESI溶剂有醇类、乙腈、丙酮、水等。溶剂有醇类、乙腈、丙酮、水等。常用混合溶剂及添加剂，如甲酸、乙酸、氨及挥发性缓冲常用混合溶剂及添加剂，如甲酸、乙酸、氨及挥发性缓冲液。液。n去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高的温度及流速以利于去溶剂。但也应注意过高的温度及流速以利
29、于去溶剂。但也应注意过高的温度可能导致样品分解。的温度可能导致样品分解。n不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为ESI的溶的溶剂。剂。n由于由于electrospray的流速在的流速在10-100 m mL /min，这，这样的高流速对于蛋白质的鉴定会有问題发生。样的高流速对于蛋白质的鉴定会有问題发生。因为样本溶液要完全消耗蒸发要一段时间，如因为样本溶液要完全消耗蒸发要一段时间，如果流速过快会影响准确性。果流速过快会影响准确性。n最近已经有新的技术呈現，使流速不要过快。最近已经有新的技术呈現，使流速不要过快。Wilm和和Mann利用利用nanospray source，然后进，然后进行行electrospray时是不连续注入样本，这样可以时是不连续注入样本，这样可以降低流速至降低流速至25-40nl/min，对于灵敏度及解析度，对于灵敏度及解析度又大大提升了。又大大提升了。
