1、提纲：提纲：一、分子流行病概述一、分子流行病概述 (一一)定义定义 (二二)分子流行病学研究内容和范围分子流行病学研究内容和范围 (三三)分子流行病学常用的主要研究方法分子流行病学常用的主要研究方法二、我国分子流行病学研究现状二、我国分子流行病学研究现状 (一一)病原体分型和检测研究病原体分型和检测研究 (二二)人群中疾病流行规律、传播机理研究人群中疾病流行规律、传播机理研究 (三三)在慢性病研究中的应用在慢性病研究中的应用 (四四)在遣传性疾病研究中的应用在遣传性疾病研究中的应用 (五五)在疾病防治方面的应用在疾病防治方面的应用三、存在问题和前景三、存在问题和前景 (一一)存在问题存在问题
2、(二二)前景前景 流行病学是研究人群中疾病和健康的分流行病学是研究人群中疾病和健康的分布，探索影响分布的因素，并在此基础上制布，探索影响分布的因素，并在此基础上制定预防策略的措施的一门学科。一直以来，定预防策略的措施的一门学科。一直以来，流行病学在疾病的预防和治疗，疾病危险因流行病学在疾病的预防和治疗，疾病危险因素的研究和控制方面都起着十分重要的作用。素的研究和控制方面都起着十分重要的作用。近二三十年来，生物学技术尤其是分子生物近二三十年来，生物学技术尤其是分子生物学技术取得了突破性进展，并逐渐渗透到各学技术取得了突破性进展，并逐渐渗透到各个医学领域。分子生物学的理论和技术不断个医学领域。分子
3、生物学的理论和技术不断应用于传统的流行病学，并在此基础上形成应用于传统的流行病学，并在此基础上形成了一门新的分支学科了一门新的分支学科分子流行病学分子流行病学。一、分子流行病学概述一、分子流行病学概述（一）定义（一）定义 分子流行病学是应用先进的实验技术测量生分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防治措施的科学。这一定义包含了出与评价相应防治措施的科学。这一定义包含了几个要点：几个要点：（1）分子流行病学是流行病学的
4、一）分子流行病学是流行病学的一个分支，是传统流行病学与新兴的生物学技术，个分支，是传统流行病学与新兴的生物学技术，特别是分子生物学技术之间的一门边缘学科、交特别是分子生物学技术之间的一门边缘学科、交叉学科；（叉学科；（2）分子流行病学的主要研究对象是）分子流行病学的主要研究对象是各种生物学标志；（各种生物学标志；（3）与传统流行病学不同，）与传统流行病学不同，分子流行病学还研究暴露因子引起疾病的相关过分子流行病学还研究暴露因子引起疾病的相关过程，以测定各种易感性标志，并提出针对性预防程，以测定各种易感性标志，并提出针对性预防措施，尤其是阻断暴露因子进入体内后致病进程措施，尤其是阻断暴露因子进入
5、体内后致病进程的初级预防措施。的初级预防措施。 图图1 传统流行病学与分子流行病学的关系（传统流行病学与分子流行病学的关系（Schulte，1993） 表表1 传统和分子流行病学的比较传统和分子流行病学的比较 传统流行病学传统流行病学 分子流行病学分子流行病学推动力推动力 公共卫生公共卫生 现代科学现代科学研究水平研究水平 人群人群 个体个体/器官组织器官组织/细胞细胞/分子分子研究样式研究样式 人口统计学人口统计学/社会科学社会科学 临床临床/实验实验认识论策略认识论策略 自上而下自上而下 自下而上自下而上预测水平预测水平 人群人群 个体个体 综合上述国内外学者的分子流行病学综合上述国内外学
6、者的分子流行病学研究实践及其对分子流行病学的理解，提研究实践及其对分子流行病学的理解，提出如下定义：分子流行病学是应用先进的出如下定义：分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相因及其相关的致病过程，并提出与评价相应防制措施的科学。应防制措施的科学。 1疾病病因的探讨疾病病因的探讨 疾病的发生，大多是环境因素与遗传因素疾病的发生，大多是环境因素与遗传因素同时起作用。只是有些疾病以环境因素为主，同时起作用。只是有些疾病以环境因素为主，有
7、些则正好相反。遗传因素起重要作用的疾病有些则正好相反。遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关，这不言而喻；而很多与环境往往与基因有关，这不言而喻；而很多与环境因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。因此，分子流行病学研究在这表达引起疾病。因此，分子流行病学研究在这方面起着非常重要的作用。方面起着非常重要的作用。 意大利学者意大利学者Dragani在在1996年名古屋会议上年名古屋会议上报告，以前一般认为肺癌的家庭聚集性很少见，报告，以前一般认为肺癌的家庭聚集
8、性很少见，故基因因素的作用很小。但他从小鼠模型发现故基因因素的作用很小。但他从小鼠模型发现染色体上存在易感或抑制肺癌的基因位点。此染色体上存在易感或抑制肺癌的基因位点。此后作者在人群中选择病理确诊的肺腺癌后作者在人群中选择病理确诊的肺腺癌125例例作为病例组，另在健康供血员人群中随机选择作为病例组，另在健康供血员人群中随机选择179名作普通人群对照检测显示，名作普通人群对照检测显示，在在KRAS2基基因第因第2外显子下游有个基因位点与拮抗肺癌产外显子下游有个基因位点与拮抗肺癌产生并延长肺癌患者的生存期有关。生并延长肺癌患者的生存期有关。 表表2 肺腺癌病人和普通人群对照中肺腺癌病人和普通人群对
9、照中KRAS2 Rsal等位等位基因的基因型频率基因的基因型频率基因型基因型a普通人群普通人群肺腺癌肺腺癌观察数观察数期望数期望数bA1/A1A1/A2A2/A29668158959 481.557.812.7计计179152152注：注：a：等位基因：等位基因A1为无酶切位点；为无酶切位点；A2为有酶切位点；为有酶切位点； b：按普通人群的频率推算所得；：按普通人群的频率推算所得； c：卡方检验：卡方检验=0.025。 2危险因子致病机制的研究危险因子致病机制的研究 分子流行病学不仅研究环境与宿主体分子流行病学不仅研究环境与宿主体内的致病因子，而且着重研究这些致病内的致病因子，而且着重研究这
10、些致病的危险因素，特别是化学物质与生物活的危险因素，特别是化学物质与生物活性物质从暴露开始至疾病发生全过程的性物质从暴露开始至疾病发生全过程的各个环节。各个环节。 癌症发病的分子流行病学研究是个典型的例子。癌症发病的分子流行病学研究是个典型的例子。20多年来，对与多年来，对与癌相关的各种生物学标志，致癌物的种种生物效应标志，如癌相关的各种生物学标志，致癌物的种种生物效应标志，如DNA加成加成物（物（adduct）等等进行了十分广泛的研究，有关报道相当丰富，积累了）等等进行了十分广泛的研究，有关报道相当丰富，积累了很多资料，提出了一些很有意义的假设。目前认为，致癌化学因子进入很多资料，提出了一些
11、很有意义的假设。目前认为，致癌化学因子进入体内，最终引起临床癌症过程的基本框架大致如下。致癌作用是多阶段体内，最终引起临床癌症过程的基本框架大致如下。致癌作用是多阶段的，正常细胞转变为癌细胞经历了致癌作用累积而又连续的几个阶段：的，正常细胞转变为癌细胞经历了致癌作用累积而又连续的几个阶段：启动（启动（initiation）、促进（）、促进（promotion），转化（），转化（conversion）和发展）和发展（progression）。）。在启动阶段，机体暴露于环境致癌化学物质，致癌物在启动阶段，机体暴露于环境致癌化学物质，致癌物进入体内需经代谢活化（进入体内需经代谢活化（metaboli
12、c activation），变成反应性亲电物质），变成反应性亲电物质（reactive electrophilic form），再与），再与DNA反应形成反应形成DNA加成物。在致加成物。在致癌物进入体内后，这种反应通常仅需几小时就可完成。当癌物进入体内后，这种反应通常仅需几小时就可完成。当DNA复制时，复制时，这种对这种对DNA的化学损伤可引起基因的变化，这些基因的变化如果逃避的化学损伤可引起基因的变化，这些基因的变化如果逃避了了DNA修复作用，就会被固定下来。某些基因损伤可造成癌基因的活修复作用，就会被固定下来。某些基因损伤可造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，从而使正常细胞变成启动细胞。这
13、个过程往往仅化或抑癌基因的失活，从而使正常细胞变成启动细胞。这个过程往往仅需几天时间。但促进过程却是人类致癌过程中最长的阶段，启动细胞呈需几天时间。但促进过程却是人类致癌过程中最长的阶段，启动细胞呈克隆样扩展需克隆样扩展需10年甚至更长。促进阶段的细胞还需经过进一步的基因改年甚至更长。促进阶段的细胞还需经过进一步的基因改变，并获得侵袭性与转移的恶性表型，才能进入转化与发展阶段，而这变，并获得侵袭性与转移的恶性表型，才能进入转化与发展阶段，而这后后2个阶段大概需个阶段大概需12年的时间。年的时间。图图2 分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略 3疾病
14、易感性的测定疾病易感性的测定 个体对疾病都存在一定的感受性，称之为易个体对疾病都存在一定的感受性，称之为易感性。以往一般认为，只有传染病才有确定的感性。以往一般认为，只有传染病才有确定的易感性，可以用测定机体内是否存在某种特异易感性，可以用测定机体内是否存在某种特异性保护（中和）抗体的方法了解其对某种传染性保护（中和）抗体的方法了解其对某种传染病是否具有易感性或免疫力。然而，近来分子病是否具有易感性或免疫力。然而，近来分子生物学与免疫学研究发现，机体对很多疾病也生物学与免疫学研究发现，机体对很多疾病也同样存在着易感性，且往往与个体的某些基因同样存在着易感性，且往往与个体的某些基因型别或序列或其
15、表达产物有关，如果与遗传有型别或序列或其表达产物有关，如果与遗传有联系，往往称之为遗传易感性（尤其慢性病）。联系，往往称之为遗传易感性（尤其慢性病）。同时还发现很多传染性疾病的易感性，除了与同时还发现很多传染性疾病的易感性，除了与能刺激机体产生特异性抗体的致病微生物有关能刺激机体产生特异性抗体的致病微生物有关外，也和机体的某些基因类型有联系，因为后外，也和机体的某些基因类型有联系，因为后者决定了机体对致病微生物的免疫反应的方式者决定了机体对致病微生物的免疫反应的方式与强度。与强度。 对于常见的慢性疾病的遗传易感性的分析，对于常见的慢性疾病的遗传易感性的分析，可以应用同时检测特异基因标志的病例对
16、照研可以应用同时检测特异基因标志的病例对照研究进行。例如，如果某个特异性的等位基因在究进行。例如，如果某个特异性的等位基因在某病病人中明显高于对照，这就提示该等位基某病病人中明显高于对照，这就提示该等位基因的存在可能使机体对某病具有一定的易感性。因的存在可能使机体对某病具有一定的易感性。目前，与遗传易感性相关研究较多的一个基因目前，与遗传易感性相关研究较多的一个基因区域是人类第区域是人类第6号染色体短臂上的人类白细胞抗号染色体短臂上的人类白细胞抗原（原（HLA），其原因可能有二，），其原因可能有二，首先首先HLA基因基因区有高度的多态性，其次为区有高度的多态性，其次为HLA的功能是介导的功能是
17、介导对特异性抗原的免疫反应。对特异性抗原的免疫反应。Erlich的研究发现，的研究发现，HLA类单倍体（类单倍体（DRB11501-DQ B10602）的比例在受到人乳头瘤状病毒（的比例在受到人乳头瘤状病毒（HPV）16型感型感染的宫颈癌与重度异常增生的病人中明显升高。染的宫颈癌与重度异常增生的病人中明显升高。 4流行规律的研究流行规律的研究 这方面研究最多的是传染病。在传播范围这方面研究最多的是传染病。在传播范围的确定，传播途径的判断与传染源的追索方面，的确定，传播途径的判断与传染源的追索方面，分子流行病学可以发挥无与伦比的作用。因为分子流行病学可以发挥无与伦比的作用。因为以往常常是根据宏观
18、流行病学调查分析，再辅以往常常是根据宏观流行病学调查分析，再辅以病原体分离与血清学分型来分析流行规律。以病原体分离与血清学分型来分析流行规律。然而近年的很多分子流行病学的研究表明，上然而近年的很多分子流行病学的研究表明，上述的方法有时不够精确。例如，尽管传染源与述的方法有时不够精确。例如，尽管传染源与接触者之间的病原体的血清学型别一致，但如接触者之间的病原体的血清学型别一致，但如果基因型不一致，就不能确切判定两者的传播果基因型不一致，就不能确切判定两者的传播关系。关系。 （1）传播范围的确定）传播范围的确定 按照传染病流行病按照传染病流行病学基本理论，在一次爆发或流行中，其受染范学基本理论，在
19、一次爆发或流行中，其受染范围的确定应根据如下原则：在爆发或流行期间，围的确定应根据如下原则：在爆发或流行期间，有共同或有效暴露史，经过一个平均潜伏期发有共同或有效暴露史，经过一个平均潜伏期发病或出现急性感染的生物学标志可判定为受染病或出现急性感染的生物学标志可判定为受染者，然后总计受染人员，结合这些人员活动的者，然后总计受染人员，结合这些人员活动的区域，以确定受染或流行涉及范围。可是，过区域，以确定受染或流行涉及范围。可是，过去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫学、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可学、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可能出现错误
20、的判断。分子流行病学研究缩小了能出现错误的判断。分子流行病学研究缩小了常规流行病学调查所推测受染范围，从基因水常规流行病学调查所推测受染范围，从基因水平上证实爆发的受染人数与传染来源。平上证实爆发的受染人数与传染来源。 （2）传播途径的判定）传播途径的判定 以往，传染病流行中传播途径或传以往，传染病流行中传播途径或传播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离到引起流行的病原体或检测到病原学标志。近来分子流行病到引起流行的病原体或检测到病原学标志。近来分子流行病学研究引入一些新的技术，如分子进化诊断（学研究引入一些新的技术，如分子进化
21、诊断（molecular evolutionary diagnosis）。例如，不少分析性流行病学研究与）。例如，不少分析性流行病学研究与血清流行病学研究均认为丙肝病毒（血清流行病学研究均认为丙肝病毒（HCV）可经性传播途径）可经性传播途径感染配偶。然而，出人意料的是，在感染配偶。然而，出人意料的是，在1993年东京国际病毒性年东京国际病毒性肝炎会议有肝炎会议有2篇报道，用分子进化法进行的研究提出了相反的篇报道，用分子进化法进行的研究提出了相反的意见。如意见。如Ohno筛检筛检50对至少有一方抗对至少有一方抗-HCV阳性的夫妇，发阳性的夫妇，发现仅现仅4对夫妇双方抗对夫妇双方抗-HCV均阳性。
22、用均阳性。用PCR扩增、测序分型，扩增、测序分型，结果其中结果其中2对配偶男女之间的对配偶男女之间的HCV RNA彼此的基因型别不同，彼此的基因型别不同，由此可排除性传播所至；另由此可排除性传播所至；另2对夫妇之间型别相同，用分子进对夫妇之间型别相同，用分子进化诊断判定男女病毒株的分株时间（化诊断判定男女病毒株的分株时间（divergence time），发），发现第现第1对配偶的分株时间发生在对配偶的分株时间发生在4552年前，而结婚却才年前，而结婚却才32年；年；第第2对配偶分株时间已有对配偶分株时间已有3034年，结婚时间则在年，结婚时间则在25年前。基年前。基于这些研究结果，作者认为于
23、这些研究结果，作者认为HCV经性传播的可能性很小。经性传播的可能性很小。 （3）传染源的追索）传染源的追索 判定传染来源或两人判定传染来源或两人之间的传播关系应符合如下之间的传播关系应符合如下4条原则：条原则：A（传（传染源）与染源）与B（受染者）的接触是有效接触（暴（受染者）的接触是有效接触（暴露）；露）；接触发生在接触发生在A的传染期内；的传染期内；B的发的发病时间是在暴露后该病最短与最长潜伏期之间；病时间是在暴露后该病最短与最长潜伏期之间；A与与B受染致病的血清学型别一致。如今看受染致病的血清学型别一致。如今看来，第来，第条应该用基因型别来代替，而基因序条应该用基因型别来代替，而基因序列
24、的测定与型别差异的鉴定虽然比较复杂与精列的测定与型别差异的鉴定虽然比较复杂与精细，但可靠得多。细，但可靠得多。 美国美国19901991年报道佛罗里达一个口腔年报道佛罗里达一个口腔诊所有诊所有1名患有艾滋病的牙医，被他看过病的名患有艾滋病的牙医，被他看过病的患者中有患者中有7名后来感染了名后来感染了HIV，然而经过分子，然而经过分子流行病学研究发现，其中流行病学研究发现，其中5名患者的名患者的HIV与牙与牙医的医的HIV有共同的氨基酸特异模式（有共同的氨基酸特异模式（signature pattern），而且序列的差异率），而且序列的差异率 5.0%，为同一，为同一病毒株；而另病毒株；而另2名
25、患者的名患者的HIV则与牙医的不同。则与牙医的不同。因此，通过序列分析，从分子水平确定了前因此，通过序列分析，从分子水平确定了前5名病人的名病人的HIV感染是由牙医引起，而后感染是由牙医引起，而后2名病名病人的传染来源则不是牙医。人的传染来源则不是牙医。 5防制措施的研究防制措施的研究 （1）传染病预防）传染病预防 因为在传染病流行的研究中应用了因为在传染病流行的研究中应用了分子生物学等现代技术，对传播与流行范围的确定，传分子生物学等现代技术，对传播与流行范围的确定，传播途径、传播媒介与因子以及传染来源的推断更为精确，播途径、传播媒介与因子以及传染来源的推断更为精确，所以提出的控制措施更有针对
26、性，更有成效。所以提出的控制措施更有针对性，更有成效。 传染病预防中最可靠的手段是疫苗接种。已有很多传传染病预防中最可靠的手段是疫苗接种。已有很多传染病由于实施了安全、有效、广泛的免疫接种，发病率染病由于实施了安全、有效、广泛的免疫接种，发病率已大幅度地下降。已大幅度地下降。 但少数疫苗由于某些原因可以使极个别疫苗接种者发但少数疫苗由于某些原因可以使极个别疫苗接种者发生被免疫的疾病。过去，仅能根据接种史与分离病原体生被免疫的疾病。过去，仅能根据接种史与分离病原体作血清学或生化反应来进行判断，但可靠性不强。而现作血清学或生化反应来进行判断，但可靠性不强。而现在用分子生物学技术作基因序列分析可以确
27、实地判定是在用分子生物学技术作基因序列分析可以确实地判定是否为疫苗株引起的发病。否为疫苗株引起的发病。 （2）非传染病的预防）非传染病的预防 由于分子流行病学不仅研究由于分子流行病学不仅研究疾病的危险因素，而且研究其引起疾病整个过程中的疾病的危险因素，而且研究其引起疾病整个过程中的所有环节，也即研究这些致病因子的致病机制，因此，所有环节，也即研究这些致病因子的致病机制，因此，这就为疾病的三级预防特别是第这就为疾病的三级预防特别是第I、II级预防采取针对级预防采取针对性措施奠定了科学的基础。在这个意义上也可以说，性措施奠定了科学的基础。在这个意义上也可以说，分子流行病学的建立，为疾病的三级预防开
28、辟了十分分子流行病学的建立，为疾病的三级预防开辟了十分广阔的前景。广阔的前景。 图图-2以癌症为例，描绘了应用分子流行病学方法以癌症为例，描绘了应用分子流行病学方法研究致癌因子研究致癌因子导致正常细胞基因改变导致正常细胞基因改变=选择性克隆选择性克隆扩增扩增=基因改变基因改变=细胞异质化细胞异质化=临床癌症过临床癌症过程的主要阶段，程的主要阶段，以及针对这些改变所能采取的不同阶以及针对这些改变所能采取的不同阶段的具体预防与干预措施：防止暴露、预防最终致癌段的具体预防与干预措施：防止暴露、预防最终致癌因子的形成、阻断其与宿主基因间的相互作用、抑制因子的形成、阻断其与宿主基因间的相互作用、抑制癌前
29、起始或启动细胞的产生、抑制选择性克隆的扩散、癌前起始或启动细胞的产生、抑制选择性克隆的扩散、早期诊断、手术与早期诊断、手术与放射治疗、化学治疗；预防复发与继发肿瘤。图图2 分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略l 分子流行病学在某种意义上讲，分子流行病学在某种意义上讲，是一是一种流行病学宏观与实验室微观结合的方种流行病学宏观与实验室微观结合的方法学，法学，需要现场流行病学调查研究与实需要现场流行病学调查研究与实验室先进的检测技术相结合。因此，分验室先进的检测技术相结合。因此，分子流行病学的研究方法大致可以分为二子流行病学的研究方法大致可以分为二大类
30、：实验室技术与流行病学现场研究大类：实验室技术与流行病学现场研究方法。方法。 1实验技术实验技术 （1）基因序列分析）基因序列分析 通过需测定的基因通过需测定的基因（靶基因）序列提取，克隆入测序载体或用（靶基因）序列提取，克隆入测序载体或用PCR直接电泳测序。这是测定基因核酸序列及直接电泳测序。这是测定基因核酸序列及其类型、突变部位与方式的最可靠的方法，在其类型、突变部位与方式的最可靠的方法，在传染病与非传染病分子流行病学研究中都十分传染病与非传染病分子流行病学研究中都十分常用。但技术操作比较复杂，分析也需细致并常用。但技术操作比较复杂，分析也需细致并具备一定经验，在国内，目前还只在一些大学、
31、具备一定经验，在国内，目前还只在一些大学、研究所、大医院等开展，表研究所、大医院等开展，表3常用检测基因变常用检测基因变异方法。异方法。 表表3 基因变异的检测和筛查方法比较基因变异的检测和筛查方法比较方法方法PCR应用应用变异部位和变异部位和内容确定内容确定检出率（检出率（%）主要特点主要特点1 Southern印迹杂交印迹杂交 2 核酸序列分析（测序核酸序列分析（测序） 3 ASO探针杂交探针杂交 4 RNaseA裂解裂解 5 化学裂解化学裂解 6 变性梯度胶电泳变性梯度胶电泳 （DGGE）7 单链构象多态分析单链构象多态分析 （SSCP）8 多重多重PCR 9 PCR-RFLP 1 0
32、等 位 基 因 特 异 性等 位 基 因 特 异 性PCR- + + + + + + + + +C A A B B C C A A A 50 100 90 6070 100 50100 8095 98 - 95适 于 重 排 和 大 于适 于 重 排 和 大 于50100bp的缺失或插入的缺失或插入准确、可靠，技术条件要准确、可靠，技术条件要求高求高检测已知变异，范围小检测已知变异，范围小 适于已知和未知变异，有适于已知和未知变异，有假阴性、假阳性结果假阴性、假阳性结果适于已知和未知变异，检适于已知和未知变异，检出率高，使用毒性试剂出率高，使用毒性试剂高效检出基因变异，使用高效检出基因变异，使
33、用特殊仪器特殊仪器简便、快速，适于大样本简便、快速，适于大样本筛查，可有假阴性结果筛查，可有假阴性结果适于多发、大范围基因缺适于多发、大范围基因缺失失检测改变限制酶切点的基检测改变限制酶切点的基因变异因变异检测已知基因变异，有假检测已知基因变异，有假阴性、假阳性结果阴性、假阳性结果 注：注：+ 可用，可用，不宜用；不宜用；A完全确定；完全确定；B不完全确定；不完全确定；C不能确定。不能确定。 （2）分子进化分析（）分子进化分析（molecular evolutionary analysis） 用核酸序列测定技术结合计算机分析，确定用核酸序列测定技术结合计算机分析，确定流行中感染的病原株之间的亲
34、缘关系和序列突变时其时流行中感染的病原株之间的亲缘关系和序列突变时其时间，以研究传播关系和病原体的进化。所以目前主要用间，以研究传播关系和病原体的进化。所以目前主要用于传染病的研究。于传染病的研究。 （3）单链构象多态性（）单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）分析）分析 其简要操作步骤与原理为：其简要操作步骤与原理为：将被检的靶基因将被检的靶基因PCR扩增后变性为单链核酸，然后进行扩增后变性为单链核酸，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察区带的迁移率。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察区带的迁移率。由于由于迁移率与核酸的构象密
35、切相关，甚至迁移率与核酸的构象密切相关，甚至1个碱基的突变都个碱基的突变都可以改变构象，产生电泳迁移率的差异。因此，藉此可可以改变构象，产生电泳迁移率的差异。因此，藉此可以检出基因的突变，而不需要测序。以检出基因的突变，而不需要测序。SSCP简便，价格简便，价格便宜，已被很多学者应用传染病与非传染病的研究。国便宜，已被很多学者应用传染病与非传染病的研究。国内也有些单位在使用，然而由于影响因素多，需要操作内也有些单位在使用，然而由于影响因素多，需要操作技术熟练，重复性差，尚未被普遍使用。另外，技术熟练，重复性差，尚未被普遍使用。另外，SSCP不能判断不能判断DNA变异的确切部位与方式，如要作深入
36、研究，变异的确切部位与方式，如要作深入研究，还需进行序列测定。还需进行序列测定。 （4）基因芯片技术（）基因芯片技术（DNA chip） 基因芯基因芯片是指固定有许多有序列的寡核甘酸探针的片是指固定有许多有序列的寡核甘酸探针的载体，通过杂交检测，对各种基因进行分析。载体，通过杂交检测，对各种基因进行分析。由于它所具有的高通量性、快速、敏感、便由于它所具有的高通量性、快速、敏感、便宜等优点，在多个领域起到越来越重要的作宜等优点，在多个领域起到越来越重要的作用。基因芯片基本原理是通过原位杂交方法，用。基因芯片基本原理是通过原位杂交方法，用已知的用已知的DNA序列检测未知序列。目前主要序列检测未知序
37、列。目前主要用于用于DNA突变分析，基因谱差异分析，基因突变分析，基因谱差异分析，基因诊断分析和大规模基因类型分析。其研制技诊断分析和大规模基因类型分析。其研制技术主要包括以下几大步骤：术主要包括以下几大步骤：寡核苷酸探针合寡核苷酸探针合成、固定、杂交和检测。成、固定、杂交和检测。2现场分子流行病学研究方法现场分子流行病学研究方法 传统的现场流行病学研究方法，即描传统的现场流行病学研究方法，即描述性研究，分析性研究与干预性研究均述性研究，分析性研究与干预性研究均可应用于分子流行病学。也可以说，在可应用于分子流行病学。也可以说，在传统的流行病学研究中，结合检测一些传统的流行病学研究中，结合检测一
38、些生物学标志，以从分子水平更深层次揭生物学标志，以从分子水平更深层次揭示病因联系或致病因子的致病机制。目示病因联系或致病因子的致病机制。目前较常用有前较常用有2种。种。 （1）巢式（套式、嵌入式）病例对照研究（）巢式（套式、嵌入式）病例对照研究（nested case control study） 运作开始是按队列研究的方式进运作开始是按队列研究的方式进行：选择一队列，收集基线资料，采集所需研究的生行：选择一队列，收集基线资料，采集所需研究的生物学标志的组织或体液标本储存备用，然后随访到出物学标志的组织或体液标本储存备用，然后随访到出现能满足病例对照研究样本量的病例数为止。把这些现能满足病例对
39、照研究样本量的病例数为止。把这些病例作为病例组，按配比条件，从同一队列中选择病例作为病例组，按配比条件，从同一队列中选择1或或数个非病例作对照，抽出病例与对照的基线资料并检数个非病例作对照，抽出病例与对照的基线资料并检测收集的标本，资料按配比病例对照研究处理，其他测收集的标本，资料按配比病例对照研究处理，其他的非病例及其资料，标本均可不用。由于此种研究是的非病例及其资料，标本均可不用。由于此种研究是按队列研究设计进行，资料收集和生物标本采集均在按队列研究设计进行，资料收集和生物标本采集均在发病前，观察的又是生物学标志，故因果关系清楚，发病前，观察的又是生物学标志，故因果关系清楚，资料可靠，论证
40、强度高；而标本检测与资料处理又按资料可靠，论证强度高；而标本检测与资料处理又按病例对照研究方法，故省钱省时省力，可以说兼有队病例对照研究方法，故省钱省时省力，可以说兼有队列研究与病例对照研究两者之优点。列研究与病例对照研究两者之优点。 （2）病例）病例-病例研究（病例研究（case-case study） 在病例对照研在病例对照研究的病例组中，临床类型可以不同，如脑卒中有出血型、究的病例组中，临床类型可以不同，如脑卒中有出血型、缺血型，冠心病有心梗型、无心梗型；某些生物学标志往缺血型，冠心病有心梗型、无心梗型；某些生物学标志往往也是不均一的，即部分病例有某种生物学标志，而其余往也是不均一的，即
41、部分病例有某种生物学标志，而其余的则没有。那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些的则没有。那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些病例与无标志的病例，按病例对照研究的方式处理资料，病例与无标志的病例，按病例对照研究的方式处理资料，以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标志与该疾病的其他危险因素之间的关系和相互作用。这就志与该疾病的其他危险因素之间的关系和相互作用。这就能比普通病例对照研究提供更多的信息与线索。在病例对能比普通病例对照研究提供更多的信息与线索。在病例对照研究的基础上再作如此处理，可达到事半功倍之效。或照研究的基础上再作
42、如此处理，可达到事半功倍之效。或者使用单纯病例者使用单纯病例-病例研究可免除选择对照，特别是免除从病例研究可免除选择对照，特别是免除从无病对照中采取生物标本的麻烦与困难。如食管癌的病例无病对照中采取生物标本的麻烦与困难。如食管癌的病例对照研究中发现，对照研究中发现，130例食管癌患者中，用免疫组化检测到例食管癌患者中，用免疫组化检测到p53基因表达异常的有基因表达异常的有68例，按病例例，按病例-病例研究处理，无论是病例研究处理，无论是单因素或单因素或Logistic回归分析，均显示吸烟、食管癌家庭史与回归分析，均显示吸烟、食管癌家庭史与p53基因表达异常有关，基因表达异常有关，OR值分别为值
43、分别为2.33.2和和2.83.8；吸；吸烟还有剂量效应，表明吸烟与食管癌家族史很可能是食管烟还有剂量效应，表明吸烟与食管癌家族史很可能是食管癌癌p53基因异常表达的危险因素。基因异常表达的危险因素。 二、我国分子流行病学研究现状二、我国分子流行病学研究现状 国内自国内自1985年始，将分子生物学技术和年始，将分子生物学技术和方法：方法：DNA杂交、基因酶切图谱分析、序列分杂交、基因酶切图谱分析、序列分析（析（DNA、AAA）和）和PCR等技术应用于流行等技术应用于流行病学中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。病学中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。使疾病早期快速、可靠的基因诊断提供了手段，使疾
44、病早期快速、可靠的基因诊断提供了手段，而且使基因分离、克隆表达与序列分析等技术而且使基因分离、克隆表达与序列分析等技术更加简便、高效。另一方面由于流行病学研究更加简便、高效。另一方面由于流行病学研究的深入，一些传统的表型（的深入，一些传统的表型（Phenotype）检测）检测方法。如染色、形态、培养特征、生化反应、方法。如染色、形态、培养特征、生化反应、血清学试验等已不能完全满足疾病的病因与传血清学试验等已不能完全满足疾病的病因与传播途径精确判别的需要，也不能完全适应一些播途径精确判别的需要，也不能完全适应一些非传染性疾病病因及制病制理的探讨。因此，非传染性疾病病因及制病制理的探讨。因此，在短
45、短的十几年中，国内分子流行病学经历了在短短的十几年中，国内分子流行病学经历了由产生到起步发展的过程，并取得重大发展。由产生到起步发展的过程，并取得重大发展。 （一）病原体分型和检测研究（一）病原体分型和检测研究 分子流行病学研究最早开始分子流行病学研究最早开始用于传染病的病原体基因分型，并调查病原体的分布规律。用于传染病的病原体基因分型，并调查病原体的分布规律。在传染流行中，对病原体进行准确的分型，对疾病的防治十在传染流行中，对病原体进行准确的分型，对疾病的防治十分重要。由于病原体表型特征的不稳定性和易变性，以表型分重要。由于病原体表型特征的不稳定性和易变性，以表型特征研究的分型方法，如血清学
46、、生化学等，就存在缺陷。特征研究的分型方法，如血清学、生化学等，就存在缺陷。而基因型是遗传特征，相当稳定可靠，可以作为病原体鉴定而基因型是遗传特征，相当稳定可靠，可以作为病原体鉴定和诊断的重要依据。细菌的产毒、耐药特性都与细菌质粒有和诊断的重要依据。细菌的产毒、耐药特性都与细菌质粒有关，徐兆炜等（关，徐兆炜等（1986年）对在同一地区分离的年）对在同一地区分离的134株痢疾杆株痢疾杆菌进行质粒图谱分析，发现虽然部分菌株耐药谱不同，但仍菌进行质粒图谱分析，发现虽然部分菌株耐药谱不同，但仍可呈现为相同的质粒图谱，这对鉴定菌株，追踪耐药菌株来可呈现为相同的质粒图谱，这对鉴定菌株，追踪耐药菌株来源极有
47、帮助。源极有帮助。rRNA基因是细菌染色体上编码基因是细菌染色体上编码rRNA的的DNA序序列，属保守基因序列。徐文斌等（列，属保守基因序列。徐文斌等（1996年）对不同地区、不年）对不同地区、不同时间分离到的同时间分离到的119株伤寒沙门氏菌进行株伤寒沙门氏菌进行rRNA(RTs)的基因多的基因多态性分析，态性分析，119株细菌可分为株细菌可分为38个个RTs，其中，其中RT9和和RT11是造是造成我国伤寒流行的主要成我国伤寒流行的主要RTs。对于病毒的分型，可以采取先。对于病毒的分型，可以采取先进行病毒的细胞培养，病毒增殖到一定程度后，提取病毒进行病毒的细胞培养，病毒增殖到一定程度后，提取
48、病毒DNA，再进行限制性内切图谱分析。，再进行限制性内切图谱分析。 PCR技术的出现，使对病原体分析过程更技术的出现，使对病原体分析过程更加简化、快捷。首先设计引物，加简化、快捷。首先设计引物，PCR扩增病原扩增病原体体DNA中一段保守的基因片段，然后进行酶切中一段保守的基因片段，然后进行酶切分析。例如，苏虹等（分析。例如，苏虹等（1997年）利用逆转录年）利用逆转录-多多聚酶链反应（聚酶链反应（RT-PCR）和限制性片段长度多态）和限制性片段长度多态性（性（RFLP）分析安徽）分析安徽HCV基因型的分布，结基因型的分布，结果表明，安徽果表明，安徽HCV感染以感染以II型为主，其中北部型为主，
49、其中北部地区地区III型感染多于南部，而型感染多于南部，而II型北部少于南部。型北部少于南部。对病原体的基因型、多态性、变异型可以应用对病原体的基因型、多态性、变异型可以应用单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）、脉冲场电泳）、脉冲场电泳（PFGE）以及序列分析等多种方法进行分析。）以及序列分析等多种方法进行分析。 基因的多态性也表现为酶分子的多态性，对酶分子的多基因的多态性也表现为酶分子的多态性，对酶分子的多态性的研究，也可了解不同病原体间遗传关系、分类分型。态性的研究，也可了解不同病原体间遗传关系、分类分型。段广才等（段广才等（1996年）应用多位点酶电泳法（年）应用多位点酶电泳法（M
50、EE）对）对471株株霍乱弧菌进行分类，结果证实古典型和埃尔托型流行株遗传霍乱弧菌进行分类，结果证实古典型和埃尔托型流行株遗传关系紧密；非流行株相互间流行关系较远。关系紧密；非流行株相互间流行关系较远。O139群与群与O1群群流行株有相同的霍乱毒素（流行株有相同的霍乱毒素（CT）片段，应按流行株对待。）片段，应按流行株对待。 对病原体的检测，以往多使用病原体培养、生化分析、对病原体的检测，以往多使用病原体培养、生化分析、血清学和免疫学检测等，上述方法都存在各种缺陷，如检测血清学和免疫学检测等，上述方法都存在各种缺陷，如检测时间长、灵敏度、特异度不高等。利用放射性同位素标记探时间长、灵敏度、特异
