1、四 重组蛋白质的鉴定三 基因重组蛋白包涵体的分离和复性二 常用的分离方法一 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则第八章 外源基因表达产物的分离纯化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白
2、质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；3. 多种分离纯化技术的联合运用在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段4.
3、 合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉5. 分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。二、常用的分离方法离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本原理 离子交换层
4、析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技术。离子交换介质的基本性质 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用离子交换剂的基本性能 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离子交换剂的分类 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型阳离子交换剂阳离子交换剂分为强酸型
5、、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有RSO3H，中，中强酸型含有强酸型含有PO3H2、PO2H2或或OPO2H2，弱酸型含有，弱酸型含有COOH或或OH。 阳离子交换进行的反应如下：阳离子交换进行的反应如下：阴离子交换剂阴离子交换剂分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 N+(CH3)3 为强碱型，三级以下铵盐为强碱型，三级以下铵盐 N(CH3)2、 NHCH3、 NH2 都属都属弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。阴离子交换树脂进行的反应
6、如下：阴离子交换树脂进行的反应如下：强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱常用的离子交换剂离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化离子交换纤维素： 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松
7、散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大 阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等维素） 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤离子交换葡聚糖： 离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构并带有离子交换功能基团。Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱
8、分离介质 常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 离子交换琼脂糖： 离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点此具有稳定的外形体积离子交换介质的选择原则一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值
9、及离子化碱性物质用阳离子交换剂分离曲线来选择12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pH pI（-）对pI=5的某酸性蛋白质在pH5.5-9.0的范围内，当蛋白质为阴离子时，应首选DEAE纤维素；在pH3.5-4.5的范围内，当蛋白质为阳离子时，应首选CM纤维素离子交换层析的基本操作(1) 层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致 为准，其中pH值最重要目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定； 使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合； 使待分离样品和杂质与离子
10、交换剂的结合有较大的差别。 (2) 样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数离子交换层析的基本操作(3) 样品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090分子浓度离子强度pH值1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度：蛋白质是由氨基酸聚合形成
11、的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。当pI pH时，蛋白质带净正电荷。已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层
12、析技术，又称为分子筛。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻； 鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温葡聚糖凝胶（ Sephadex ）葡聚糖凝胶G10 700 葡聚糖凝胶G15 1500 葡聚糖凝胶G2
13、5 1000-5000 葡聚糖凝胶G50 1000-30,000 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B）。琼脂糖凝胶 当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种聚丙烯酰胺凝胶凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物
14、质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-组别分离15、Bio-Gel P-2或P-4 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡层
15、析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作亲和层析的基本概念 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子亲和层析的基本特点纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围
16、受到一定的限制抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结亲和层析的基本原理合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质
17、b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex蛋白质混合物配体与配体结合的蛋白质加入的可溶性配基专一性结合蛋白质没有结合的蛋白质非专一性结合蛋白质蛋白质浓度洗脱体积与配体专一性结合蛋白质加入配基基质亲和层析载体的性质与选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速亲和层析载体的选择具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联在偶联、吸
18、附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性纤维素葡聚糖凝胶 常用的亲和层析载体琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的亲和层析配基的选择条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力酸酐法N-取代羟基琥珀酰亚胺法配基的偶联叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成亲和层析的基本操作通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等，降低其亲和力。非专一性洗脱化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定使用特异的配基作为洗脱剂 溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗专一性洗脱使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物 脱目标产物 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载特殊性洗脱体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。
