1、1 电子显微镜发展简史电子显微镜发展简史2 电子显微镜技术的发展与应用电子显微镜技术的发展与应用3 其他显微技术的发展其他显微技术的发展制造者制造者荷兰眼镜制造商荷兰眼镜制造商Janssen英国科学家和发明家罗伯特英国科学家和发明家罗伯特.胡克胡克荷兰业余科学家列文荷兰业余科学家列文.虎克虎克德国物理学家德国物理学家Knoll和和RuskaArdenne德国德国Siemens公司公司英国剑桥科学仪器有限公司英国剑桥科学仪器有限公司中国科学院长春光学精密机械与物理中国科学院长春光学精密机械与物理研究所研究所中国科学院北京科学仪器厂中国科学院北京科学仪器厂瑞士科学家瑞士科学家Binnig、Rohr
2、er、Gerber和和Weible中国科学院白春礼中国科学院白春礼年代年代15901665166519321938193919651959197519811990显微镜显微镜发明了放大发明了放大20-30倍的复式光学显微镜倍的复式光学显微镜自制复式显微镜。观察软木薄片，第一自制复式显微镜。观察软木薄片，第一次描述植物细胞结构次描述植物细胞结构利用小型高倍透镜制成简单显微镜，放大倍数利用小型高倍透镜制成简单显微镜，放大倍数达达300倍，观察动植物活细胞与原生动物，第倍，观察动植物活细胞与原生动物，第一次看到许多单细胞生物。一次看到许多单细胞生物。研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台透射电子
3、显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜生产了第一台商品用的透射电子显微镜生产了第一台商品用的透射电子显微镜扫描电子显微镜作为商品问世扫描电子显微镜作为商品问世研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台透射电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜研制成功第一台扫描电子显微镜发明扫描隧道显微镜发明扫描隧道显微镜主持研制成功首台原子力显微镜主持研制成功首台原子力显微镜表表1-1 显微镜发展简史显微镜发展简史 年代年代19341946194719491950195219561953 1955195619561958195919611957196319391939196219711
4、97419771978研究者研究者MarotnWilliams和和WyckoffClaude Latta和和HartmannPalade Palade和和SiekevitzPorter和和BlumMoranHall和和HuxleyLuftGlauertWatsonMoranLuffSteereSabatini及同事及同事Kauschehe和和RuskaHorisbergerFeldherr和和MarshalFaulk和和TaylorRomano及同事及同事Horisberger及同事及同事Rpth及及Bendayan电子显微镜技术电子显微镜技术发表了第一张生物组织茅膏菜属植物叶切片的电子显微图
5、发表了第一张生物组织茅膏菜属植物叶切片的电子显微图将金属投影用于增加电镜图象反差将金属投影用于增加电镜图象反差开始使用铀固定剂开始使用铀固定剂甲基丙烯酸酯被用作包埋介质甲基丙烯酸酯被用作包埋介质用玻璃刀进行组织切片用玻璃刀进行组织切片将缓冲液与锇酸混合，作为组织固定液将缓冲液与锇酸混合，作为组织固定液用电子显微镜分析细胞碎片用电子显微镜分析细胞碎片介绍切片机和切片技术介绍切片机和切片技术使用钻石刀进行超薄切片，并创立冷冻超薄切片术使用钻石刀进行超薄切片，并创立冷冻超薄切片术以磷钨酸为负染色剂观察了灌木病毒及烟草花叶病毒的超微结构以磷钨酸为负染色剂观察了灌木病毒及烟草花叶病毒的超微结构高锰酸钾作
6、为固定剂高锰酸钾作为固定剂环氧树脂作为包埋介质环氧树脂作为包埋介质介绍用重金属铅和铀对组织切片进行染色介绍用重金属铅和铀对组织切片进行染色采用冷冻置换技术制备生物样品采用冷冻置换技术制备生物样品介绍介绍Epon包埋介质包埋介质开始研究冷冻断裂技术开始研究冷冻断裂技术用戊二醛作预固定液保存细胞超微结构及活性，进行细胞化学方面研究用戊二醛作预固定液保存细胞超微结构及活性，进行细胞化学方面研究对蛋白质吸附于胶体金进行探讨对蛋白质吸附于胶体金进行探讨将蛋白质吸附于胶体金方法用于扫描电子显微镜将蛋白质吸附于胶体金方法用于扫描电子显微镜胶体金颗粒作为一种示踪物用于电子显微技术研究胶体金颗粒作为一种示踪物用
7、于电子显微技术研究胶体金作为抗血清特异标记物用于透射电子显微镜胶体金作为抗血清特异标记物用于透射电子显微镜首次制备蛋白质首次制备蛋白质A-金复合物金复合物建立了制备免疫球蛋白建立了制备免疫球蛋白-金颗粒基本方法金颗粒基本方法提出包埋后免疫金标记技术提出包埋后免疫金标记技术利用量子力学中隧道效应产生隧道电流信号，获得反映样品表面原子形态结构和原子排列图象。具有原子尺度的高分辨率。可以观察单原子层的实时结构图象，并能在大气、真空甚至液体环境中观察自然状态下的样品表面结构，因而在半导体、金属、无机材料及生物学研究等方面有广阔的应用前景。通过微悬臂上的针尖在样品表面扫描，使针尖与凹凸不平的样品表面的顶
8、端原子相互摩擦产生原子力。在扫描过程中，微悬臂的上下起伏与等位面的样品形貌相互对应，所以可通过针尖与微悬臂之间的隧道电流变化，得到样品表面形貌信息。其分辨率可与透射电镜相比拟。AFM不但能通过探测原子间作用力观察绝缘体，还可在生物环境中直接观察生物样品表面结构。扫描隧道显微技术扫描隧道显微技术(STM)原子力显微技术原子力显微技术(AFM)激光扫描共焦显微技术激光扫描共焦显微技术利用共焦光路及激光扫描，在观察较厚样品的内部结构或直接观察细胞时，可使所选定的不同层面每一焦点面影象清晰，从而得到细胞不同切面上的一系列图象，经计算机系统快速分析处理，即可重组出样品三维立体图象，展现细胞瞬间变化的形态
9、结构。 电子显微镜之父电子显微镜之父 E.Ruska 世界上第一台电子显微镜世界上第一台电子显微镜1. Airy圆盘 若有两个点光源,其一光斑的中央极大值点恰与另一光斑的第一极小值点重合，则这两个点光源正好是可以分辨的，故可以定义分辨率d为Airy圆盘的半径。 d0.61/nsin0.61/NA 可见光波长为400700nm，人眼对绿光（500nm左右）比较敏感，故光学显微镜的分辨率约为250nm即2500 左右。2. 显微镜的有效放大倍数:人眼的分辨率与显微镜的分辨率之比值，即M有d人d仪。3. 空放大:超过仪器有效放大倍数以外的放大)(/25.122/oAVmeVh即与所处电场电压的平方根
10、成反比.当 V= 50kV时,可计算出0.055 =0.0055nm V=100kV时,可计算出0.039 =0.0039nm分辨率分辨率0.1nm0.1nm超高压透射电镜超高压透射电镜JEM-ARM1250JEM-ARM1250 1926年德国科学家布施指出带电粒子在旋转轴对称的电场或磁场中有聚焦作用。 电子显微镜的理论基础。v电子束在磁场或电场中的性质v电子束的穿透力 高真空 100nm(100kv以下的EM)v电子束的激发荧光 荧光屏v电子束的放射性 铅防护包壳透镜 电子透镜静电子透镜 磁电子透镜 恒磁透镜 电磁透镜 螺线管线圈 极靴透镜 具有轴对称弯曲磁场装置构成的电子透镜像差像差球差
11、球差畸变畸变像散像散色差色差衍射差衍射差像差像差球差球差畸变畸变像散像散色差色差衍射差衍射差是由于透镜边缘与中央部分汇聚能力有差异造成, 当磁场会聚由同一物点发出的电子束时，大孔径角的电子会聚的快一些（焦距短），而对小孔径角的电子会聚的慢一些（焦距长），于是在原来理想的像点附近形成了一个弥散的小球，所以这种像差称为球差。在电镜中采用光阑限制球差，使其成为一个圆斑，在焦点处为一最小弥散圆斑。球差只能减小不能消除. 要减少球差，只有缩小孔径角，即用最小孔径光阑。像差像差球差球差畸变畸变像散像散色差色差衍射差衍射差是由于透镜边缘部分比中心部分聚焦能力强，致使物上各点像的放大倍数，边缘与中心部分的放大
12、倍数不一样,图象清晰,图形扭曲.畸变现象主要发生在较低倍的情况下像差像差球差球差畸变畸变像散像散色差色差衍射差衍射差是由于材料性质欠佳或加工精度不良致使场分布呈非轴对称而造成的。对图像的影响表现为使互相垂直的两个电子束聚焦能力不同，放大倍率也不同，所以物点的像变成一椭圆形，可用消像散器予以补偿矫正。另外光阑和极靴孔的污染也会引起像散，这可以采用清洗方法予以消除。像差像差球差球差畸变畸变像散像散色差色差衍射差衍射差色差也叫波长差，是由于透镜使不同速度电子聚焦和像转角的能力不同而造成的。当电镜加速电压的电压或电流有波动时，将引起电子束波长的变化，这时将产生色差。可以采用多级稳压电源来去除色差.像差
13、像差球差球差畸变畸变像散像散色差色差衍射差衍射差是由小孔电子衍射效应造成的像差，是限制分辨率的重要因素。 a一次电子扩散的范围和信息产生层次 b各种信息的应用1.入射电子束 2.样品 3.锇歇电子 4.二次电子 5.背散射电子 6.X射线 7.阴极发光 8.吸收电子 9.透射电子 10.大角度弹性散射电子 11.非弹性散射电子12.小角度弹性散射电子三、俄歇电子（AE） 俄歇电子的产生可用下例说明，设K层电子被入射电子激发逸出样品，L2层的某一电子跃迁补充被激发的K层电子的空位，则其能量差为EEL1EK。若此能量E传递给L2层的另外一个电子，并使其由于获得能量E而逸出样品，则此电子就称为俄歇电
14、子。每种元素的各能级间的俄歇电子的能量都是常数，如碳的KL2L2俄歇电子能量为273eV，因此可利用检测俄歇电子进行元素分析。仪器名称：透射电子显微镜仪器名称：透射电子显微镜生产厂家：荷兰生产厂家：荷兰PhilipsPhilips公司公司仪器型号：仪器型号：Tecnai 12Tecnai 12主要附件：主要附件： Gatan 792 CCDGatan 792 CCD性能指标：性能指标：最 大 放 大 倍 数 ：最 大 放 大 倍 数 ： 6 56 5 万 倍万 倍点分辨率：点分辨率： 0.24nm0.24nm线分辨率：线分辨率： 0.14nm0.14nm最高加速电压：最高加速电压： 120KV
15、120KVTEM的结构的结构阴极即灯丝，通常用直径为0.10.12mm的钨丝制成，呈点状或发叉形（也称V形）。灯丝通电加热到2227（2500K）以上时，灯丝尖端开始发射热电子，在阳极电压的作用下加速到极高的速度。除这种常用的热发射钨灯丝以外，现在还有六硼化镧（LaB6）阴极和场发射钨单晶阴极，它们的亮度和寿命要比普通灯丝提高很多。阴极栅极阳极也称负偏压栅极，是由一个中央有孔的圆金属筒构成，或称为韦氏圆筒（Wehnelt），它处于相对于阴极100500V的电位，用以控制电子发射强度和电子束的形状。阴极栅极阳极-+t阴极栅极阳极阳极上加有几十千伏或更高的正电位，其作用是使电子加速。1旋转式机械泵
16、（RP）：旋转式机械泵也称油旋转泵，能获得102103Torr的低真空度，它可以在大气压下使用。机械泵排气速度较低（中型的150Lmin），真空度只能达到10 3Torr（1.3310lpa）左右，所以只能用它获得粗真空和为油扩散泵提供背压。2油扩散泵（ODP）：油扩散泵最高真空度可达106Torr以上。排气速度可达280L秒。较好的电镜通常用两个油旋转泵，一个固定抽贮气筒和油扩散泵的低真空，使扩散泵一直保持良好的真空状态；另一只泵动阀门转换，以抽各部分低真空。3.离子泵（IGP）真空度可达10-12Torr4.分子泵（TMP）真空度可达10-10Torrn 透射电镜的像反差是由入射电子通过样
17、品时，发生的散射吸收差、衍射差和相位差来决定的。n生物样品的反差主要由物质的质量厚度决定。 振幅反差： 质量厚度=样品密度样品厚度， 质量厚度大，透过电子少，荧光屏形成暗区； 质量厚度小，透过电子多，荧光屏形成亮区。 这就形成了明暗不同的振幅反差。这种反差是通过电子激发荧光粉形成可见光（光强不同）反映到人眼的。 阴极灯丝加热至2500K 发射热的电子束 经聚光镜聚束 投射到样品 物镜进行第一级放大 中间镜第二级放大 投影镜第三级放大 最终成像于荧光板上 照相 透射电子显微镜镜筒部分的工作过程透射电子显微镜镜筒部分的工作过程(a)利用质厚衬度(又称吸收衬度)像,对样品进行一般形貌观察; (b)利
18、用电子衍射、微区电子衍射、会聚束电子衍射物等技术对样品进行物相分析,从而确定材料的物相、晶系,甚至空间群;(c)利用高分辨电子显微术可以直接“看”到晶体中原子或原子团在特定方向上的结构投影这一特点,确定晶体结构;(d)利用衍衬像和高分辨电子显微像技术,观察晶体中存在的结构缺陷,确定缺陷的种类、估算缺陷密度;(e)利用TEM所附加的能量色散X射线谱仪或电子能量损失谱仪对样品的微区元素成分进行分析;(f)利用带有扫描附件和能量色散X射线谱仪的TEM,或者利用带有图像过滤器的TEM,对样品中的元素分布进行分析,确定样品中是否有成分偏析.X射线能量色散谱仪（能谱射线能量色散谱仪（能谱EDS） 分析速度
19、快，检测分析速度快，检测1000ppm, Z5（无铍窗）（无铍窗） X射线波长色散谱仪（波谱射线波长色散谱仪（波谱LDS） 分辨率高，检测分辨率高，检测100ppm, Z1，分析速度慢，分析速度慢 AuCdSFe2O3PbSAn image of an edge and twin boundary and nothing else!F30 U-TWIN金刚石中碳原子排列象金刚石中碳原子排列象SrTi2nmSample courtesy: Mexican Petroleum Institute (IMP) / Molecular Engineering Department 20 nm200 n
20、m材料样品制样技术材料样品制样技术一般的微米级以下的颗粒样品一般是先制备成悬浊液，用超声波进行分散让样品在液体中处于非常均匀的状态，然后用移液器滴一小滴在已做好膜的铜网上，自然干燥后，供电镜观察。如果悬浊液的颗粒浓度较高，也可以先滴一滴溶液在玻片上，然后将铜网反扣在样品滴上12分钟。然后放在台灯下烤干，即可上电镜观察。悬浊液样品悬浊液样品样品切割样品粗磨减薄3mm直径样品制备精确减薄(80-120um)挖坑减薄(10-20um)离子减薄或电解双喷精确离子减薄透射电镜观察环氧树脂包埋 切片样品精确切割设备样品精确切割设备，例如，冷冻超薄切片仪超声波切片仪离子减薄仪/电解双喷仪精确离子减薄仪固体样品的减薄制备固体样品的减薄制备500 mDisk Cutting70-100 mDisk Grinding5 mDimple GrindingIon MillingIon beamIon beam1.2.3.4.general steps70-100 mmechanical grindingNot to scale5 mDimple grinding
