1、药学微生物基础教案药学微生物基础教案上课时间上课时间: 200 年年 月月 日日授课内容授课内容:菌种的选育及保藏技术菌种的选育及保藏技术授授 课课 人人: 任教班级任教班级: 2005级级 班班课课 时时:课课 型型:教学媒体教学媒体:教学目标教学目标：、熟悉遗传、变异、质粒和突变的概念。、熟悉遗传、变异、质粒和突变的概念。、熟知菌种保藏的原理及方法，熟知菌种退化的、熟知菌种保藏的原理及方法，熟知菌种退化的判断。判断。 、知道突变的主要特征，菌种选育的常用方法。、知道突变的主要特征，菌种选育的常用方法。菌种分离纯化的操作。菌种分离纯化的操作。教学重点：教学重点：、遗传、变异、质粒和突变的概念
2、、遗传、变异、质粒和突变的概念、菌种保藏的原理及方法，菌种退化的判断、菌种保藏的原理及方法，菌种退化的判断教学难点：教学难点：突变及退化，菌种分离纯化的操作。突变及退化，菌种分离纯化的操作。第四章第四章 菌种的选育及保藏技术菌种的选育及保藏技术 第一节第一节 理论基础理论基础一、微生物的遗传与变异一、微生物的遗传与变异 遗传性是能维持微生物物种间的相对稳遗传性是能维持微生物物种间的相对稳定。定。 变异性通过变异可以不断形成变种和新变异性通过变异可以不断形成变种和新种种,促进了微生物物种的进化。促进了微生物物种的进化。（一）微生物遗传与变异的物质基础（一）微生物遗传与变异的物质基础1染色体染色体
3、 2质粒质粒核质染色体核质染色体质粒质粒（二）微生物变异的类型（二）微生物变异的类型1表型变异表型变异 指微生物在生活环境发生改变时指微生物在生活环境发生改变时,发生暂时发生暂时的形态、生理等特性的改变的形态、生理等特性的改变,当环境条件复原当环境条件复原时时,又能恢复原有的特性。是可逆的不可遗传又能恢复原有的特性。是可逆的不可遗传的。的。2遗传型变异遗传型变异 指微生物体内的遗传物质指微生物体内的遗传物质DNA发生了结构发生了结构改变改变,从而引起微生物某些性状发生改变的特从而引起微生物某些性状发生改变的特性。这种变异是不可逆的性。这种变异是不可逆的,但可以稳定地遗传。但可以稳定地遗传。二、
4、基因及基因工程二、基因及基因工程（一）基因及突变（一）基因及突变 基因是微生物体内有自我复制能力的遗传功能单基因是微生物体内有自我复制能力的遗传功能单位位,是具有特定核苷酸排列顺序的是具有特定核苷酸排列顺序的DNA片段。片段。构成构成DNA的四种核苷酸具有特定的排列顺序的四种核苷酸具有特定的排列顺序,每个基每个基因在因在DNA中各占有一个特定的位置中各占有一个特定的位置,对遗传起着决定性对遗传起着决定性作用。作用。 当当DNA中四种核苷酸的结构、排列顺序、数目发生中四种核苷酸的结构、排列顺序、数目发生改变时改变时,就会导致生物体的表型发生稳定的、可遗传的改就会导致生物体的表型发生稳定的、可遗传
5、的改变变,称为突变。称为突变。突变包括：突变包括：1基因突变基因突变 是由于是由于DNA链上的一对或少数几对链上的一对或少数几对碱基发生置换、插入或丢失而引起的碱基发生置换、插入或丢失而引起的,是是DNA分子小的损伤分子小的损伤,又称点突变又称点突变。2染色体畸变染色体畸变 是染色体结构上的改变是染色体结构上的改变,涉及大段的涉及大段的DNA的缺失、重复、倒位、异位和染色体的缺失、重复、倒位、异位和染色体数目的改变数目的改变,是是DNA大的损伤大的损伤,通常是至死的。通常是至死的。突变的主要特征：突变的主要特征：（1）突变具有稳定的可遗传性。）突变具有稳定的可遗传性。（2）突变具有可逆性。）突
6、变具有可逆性。（3）突变具有稀少性。）突变具有稀少性。（4）突变具有独立性和不对应性。）突变具有独立性和不对应性。（5）突变具有自发性和诱发性。）突变具有自发性和诱发性。 突变分为正突变和负突变。正突变即发生突变分为正突变和负突变。正突变即发生了人们所需要的性状改变。负突变则相反了人们所需要的性状改变。负突变则相反,表现为菌种的退化和死亡。表现为菌种的退化和死亡。（二）基因重组二）基因重组 将一个个体内的基因转移到另一个个体将一个个体内的基因转移到另一个个体的细胞内的细胞内,使两个不同细胞的基因重新组合使两个不同细胞的基因重新组合产生出新的产生出新的DNA分子的过程称为基因重组。分子的过程称为
7、基因重组。（三）基因工程（三）基因工程 基因工程是指用人工的方法把某一供体基因工程是指用人工的方法把某一供体中的基因提取出来中的基因提取出来,然后将其转接在载体然后将其转接在载体（质粒、噬菌体、病毒）上（质粒、噬菌体、病毒）上,再将载体导入再将载体导入受体细胞受体细胞,使该外源基因在受体细胞中复制、使该外源基因在受体细胞中复制、表达和遗传。表达和遗传。（四）菌种的选育（四）菌种的选育1自然选育自然选育 利用自发突变的原理利用自发突变的原理,通过对菌种通过对菌种的分离培养来筛选菌株的过程。的分离培养来筛选菌株的过程。2诱变育种诱变育种 采用不同的理化或生物诱变剂处理采用不同的理化或生物诱变剂处理
8、菌种菌种,以诱发各种遗传突变以诱发各种遗传突变,然后经过筛然后经过筛选选,获得具有优良性状的实变株的过程称获得具有优良性状的实变株的过程称为诱变育种。为诱变育种。诱变育种的全过程包括：出发菌株的选诱变育种的全过程包括：出发菌株的选择、菌悬液的制备、诱变剂及其剂量的择、菌悬液的制备、诱变剂及其剂量的选择、适当的诱变处理方式方法、突变选择、适当的诱变处理方式方法、突变株的分离筛选。株的分离筛选。3杂交育种杂交育种 杂交育种是指两个不同基因型的亲株杂交育种是指两个不同基因型的亲株通过接合或吻合通过接合或吻合,让其不同菌株的基因重让其不同菌株的基因重新组合于同一个重组体中新组合于同一个重组体中,形成新
9、的遗传形成新的遗传型个体的过程。型个体的过程。三、菌种保藏三、菌种保藏目的是尽量保持菌种的存活率目的是尽量保持菌种的存活率,保持其优良保持其优良的遗传性状的遗传性状,防止退化及污染杂菌。防止退化及污染杂菌。原理是根据不同菌种的生理、生化特点原理是根据不同菌种的生理、生化特点,创造创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。（一）菌种保藏的方法（一）菌种保藏的方法保藏保藏 方法方法主要主要 原理原理设备设备条件条件适宜适宜菌种菌种保藏保藏期期特点特点斜面低温斜面低温保藏法保藏法低温低温4冰箱冰箱 各大类各大类 36月月简便、短时简便、短时,易污染退化易污染退化液体石蜡
10、液体石蜡保藏法保藏法低温低温缺氧缺氧4冰箱冰箱无菌石蜡无菌石蜡油油各大类各大类12年年简便、短时简便、短时须直立放置须直立放置砂土保藏砂土保藏法法低温低温干燥干燥缺营养缺营养4冰箱冰箱或室温或室温产饱子产饱子类类110年年简便有效简便有效较长时间较长时间易退化变易退化变异异冷冻干燥冷冻干燥保藏法保藏法低温、低温、干燥、干燥、缺氧缺氧保护剂、保护剂、整套冷冻整套冷冻设备设备各大类各大类 515年年长时高效长时高效,但繁杂但繁杂,技技术要求高术要求高（二）菌种的退化和复壮二）菌种的退化和复壮当变异导致生产菌种典型性状改变如生长缓慢、当变异导致生产菌种典型性状改变如生长缓慢、生产能力下降或对不良环境
11、条件抵抗力下降生产能力下降或对不良环境条件抵抗力下降,对营对营养需求改变等养需求改变等,称为菌种的退化。称为菌种的退化。1菌菌种种退退化化的的原原因因（1）基因突变）基因突变 基因突变的结果是造成菌种体内基因突变的结果是造成菌种体内DNA的损伤的损伤,从而造成其遗传性状的改变。如果是负从而造成其遗传性状的改变。如果是负变则直接导致菌种的退化；如果是正变则可能得到高变则直接导致菌种的退化；如果是正变则可能得到高产量的突变株产量的突变株,一旦发生回复突变或新的负变而失去高一旦发生回复突变或新的负变而失去高产能力产能力,也就是导致菌种的退化。也就是导致菌种的退化。 （2）传代次数的影响）传代次数的影
12、响 菌种传代的次数越多菌种传代的次数越多,变变异的频率越高。异的频率越高。 （3）环境条件的影响）环境条件的影响 环境条件通常指培养基成分、环境条件通常指培养基成分、温度、湿度、温度、湿度、PH和通气条件等和通气条件等,它们对菌种的生长、代它们对菌种的生长、代谢能力影响很大。谢能力影响很大。 2菌种的复壮及措施菌种的复壮及措施防止菌种退化的主要措施有：防止菌种退化的主要措施有：用相应的方法和手段使已退化的菌种恢用相应的方法和手段使已退化的菌种恢复原有性状及生产能力复原有性状及生产能力,称为菌种的复壮。称为菌种的复壮。（1）分离纯化）分离纯化（2）控制传代次数）控制传代次数（3）创造良好的培养环
13、境）创造良好的培养环境（4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法,尽量避免菌尽量避免菌种的退化。种的退化。（三）菌种保藏管理程序（三）菌种保藏管理程序1菌种的收集菌种的收集2菌种的核对菌种的核对3菌种保藏信息管理菌种保藏信息管理4保藏菌种的质量检查保藏菌种的质量检查5菌种保藏工作人员要求菌种保藏工作人员要求四、菌种保藏机构四、菌种保藏机构第二节第二节 菌种的复壮操作菌种的复壮操作一、菌种退化的判断操作一、菌种退化的判断操作（一）操作原理（一）操作原理 通过对菌种斜面菌落生长形态特征的观察、通过对菌种斜面菌落生长形态特征的观察、培养特性及代谢产物的比较，进行菌种退化与否的判断。培养特性
14、及代谢产物的比较，进行菌种退化与否的判断。（二）操作方法（二）操作方法1斜面菌落形态退化的判断斜面菌落形态退化的判断 首先应检查培养基及环境条件等外因是否改变，首先应检查培养基及环境条件等外因是否改变，排除表型变异。其次，检查是否有杂菌污染。排除表型变异。其次，检查是否有杂菌污染。2菌种培养特性退化的判断菌种培养特性退化的判断（1）菌体形态显微观察）菌体形态显微观察（2）取培养液用）取培养液用PH计测量其酸碱度计测量其酸碱度（3）取培养液用刻度离心管离心，测量菌体体积（菌）取培养液用刻度离心管离心，测量菌体体积（菌浓）浓） 3比较次级代谢产物比较次级代谢产物 注意事项：注意事项：在培养基及其它
15、环境条件不变的情况下，出现上述不正在培养基及其它环境条件不变的情况下，出现上述不正常现象，也有可能是杂菌污染造成的，因此接种或转种时要常现象，也有可能是杂菌污染造成的，因此接种或转种时要严格无菌操作，同时应经常清洁消毒环境。排除因污染杂菌严格无菌操作，同时应经常清洁消毒环境。排除因污染杂菌而导致培养物生长不良。而导致培养物生长不良。在培养基及其它环境条件不变的情况下，出现上述不正在培养基及其它环境条件不变的情况下，出现上述不正常现象，也有可能是噬菌体污染造成的，应进行环境中噬菌常现象，也有可能是噬菌体污染造成的，应进行环境中噬菌体检查。体检查。环境中噬菌体检查操作：环境中噬菌体检查操作： 将正
16、常菌种液体培养物与该菌的斜面培养基以将正常菌种液体培养物与该菌的斜面培养基以1：10体积体积比混合，摇匀后倒制成混合菌平板，打开放置在操作环境中比混合，摇匀后倒制成混合菌平板，打开放置在操作环境中合适位置（一般在四角及中间各放置一个，数量视空间体积合适位置（一般在四角及中间各放置一个，数量视空间体积大小而定）大小而定）30分钟，将平板置于合适的温度和时间下培养，分钟，将平板置于合适的温度和时间下培养，观察是否有菌落生长，或有无噬菌斑产生。观察是否有菌落生长，或有无噬菌斑产生。（三）结论（三）结论 通过对菌种斜面菌落生长形态特征的观通过对菌种斜面菌落生长形态特征的观察、培养特性及代谢产物的比较，
17、先检查察、培养特性及代谢产物的比较，先检查环境条件是否改变，是否污染杂菌和噬菌环境条件是否改变，是否污染杂菌和噬菌体，再检查菌种的传代次数，保藏时间和体，再检查菌种的传代次数，保藏时间和保藏方法，即可作出菌种退化与否的判断。保藏方法，即可作出菌种退化与否的判断。菌种分离纯化操作流程图菌种分离纯化操作流程图待待分分离离菌菌种种菌悬菌悬液的液的制备制备平板分离平板分离纯培养纯培养发酵发酵瓶瓶发发酵瓶酵瓶摇瓶摇瓶复试复试高高产产菌菌株株生产罐生产罐上试验上试验菌种保藏菌种保藏二、菌种分离纯化操作二、菌种分离纯化操作（一）操作原理（一）操作原理 利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，采用平板利用微
18、生物在一定条件下产生自发突变的原理，采用平板分离的方法，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持或提高生产分离的方法，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持或提高生产水平的菌株，达到纯化、复壮菌种，稳定生产的目的。水平的菌株，达到纯化、复壮菌种，稳定生产的目的。（二）操作过程（二）操作过程1菌悬液的制备菌悬液的制备 用无菌生理盐水或缓冲液，将斜面菌体或孢子洗下来，制成用无菌生理盐水或缓冲液，将斜面菌体或孢子洗下来，制成菌悬液，经一定浓度稀释后，在平板上进行菌落活计数。菌悬液，经一定浓度稀释后，在平板上进行菌落活计数。2平板分离平板分离 根据计数结果，定量稀释后制成菌浓度为根据计数结果，定量稀释后制成菌浓度为
19、50200个个/ml单细单细胞的菌悬液，取胞的菌悬液，取0.1ml注入平皿，再倒入适量培养基，摇匀，制注入平皿，再倒入适量培养基，摇匀，制成混成混(合合)菌平板，培养后长出分离的单菌落。菌平板，培养后长出分离的单菌落。3纯培养纯培养取分离培养后长出的各型单菌落，接种斜取分离培养后长出的各型单菌落，接种斜面，培养。面，培养。4初筛初筛将成熟的斜面菌种对应接入发酵瓶，摇床发将成熟的斜面菌种对应接入发酵瓶，摇床发酵一段时间，测定各菌落生产性能（如抗生素发酵酵一段时间，测定各菌落生产性能（如抗生素发酵位）。位）。5复筛复筛 挑选初筛中高单位菌株的挑选初筛中高单位菌株的5%20%，进行摇，进行摇瓶复试，
20、最好使用母瓶，发酵瓶两级发酵，重复瓶复试，最好使用母瓶，发酵瓶两级发酵，重复35次，次，分析确定产量水平。初、复筛都要同时以正常生产菌种分析确定产量水平。初、复筛都要同时以正常生产菌种作对照，复筛出的菌株产量应比对照菌株提高作对照，复筛出的菌株产量应比对照菌株提高5%以上，以上，并经过糖，氮代谢的考察，合格后在生产罐上试验。并经过糖，氮代谢的考察，合格后在生产罐上试验。6菌种保藏菌种保藏 将复筛后得到的高单位菌株制成沙土管，将复筛后得到的高单位菌株制成沙土管，冷冻管或用其它方法保藏。冷冻管或用其它方法保藏。第三节 菌种保藏操作 一、沙土保藏法的操作一、沙土保藏法的操作 二、真空干燥冷冻保藏法的
21、操作二、真空干燥冷冻保藏法的操作 三、斜面低温保藏操作三、斜面低温保藏操作四、液体石蜡保藏操作四、液体石蜡保藏操作 试管熔封保藏法试管熔封保藏法补补充充甘油冷冻管保藏法甘油冷冻管保藏法甘油冷冻管保藏法甘油冷冻管保藏法其其保藏原理是低温或缺乏营养保藏原理是低温或缺乏营养。方法是将待保藏。方法是将待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时菌接种至平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后（细菌需要间后（细菌需要2448 2448 h h的培养物，酵母菌需要的培养物，酵母菌需要72 72 h h的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌则
22、应培养线菌和丝状真菌则应培养710 d710 d），用无菌接种环），用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸摩擦而使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中馏水中，调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第，调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第1010号管，号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为为20%20%的无菌甘油，得到的无菌甘油，得到10%10%甘油菌悬液甘油菌悬液。 注意甘油浓度不宜过高，否则会影响细菌细胞渗注意甘油浓度不宜过高，否则会影响细菌细
23、胞渗透压，引起细菌死亡。透压，引起细菌死亡。轻轻振摇小管，使内容物轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，制好的甘油冷冻充分混合，分装于无菌小试管，制好的甘油冷冻管最好在管最好在-30-30条件下贮存，从冷冻之日起一般条件下贮存，从冷冻之日起一般可保存可保存2 2年年。该。该保藏管制法简单，保存不占太多保藏管制法简单，保存不占太多位置。但是在制作过程中，位置。但是在制作过程中，应注意使用纯菌悬液应注意使用纯菌悬液而不是含有培养基的增菌液而不是含有培养基的增菌液，这样可保证不带入，这样可保证不带入培养基营养成分；同时培养基营养成分；同时菌液浓度要达到菌液浓度要达到10%10%，以，以防止在长时间保存中不至于因自然死亡后造成菌防止在长时间保存中不至于因自然死亡后造成菌数下降过量。数下降过量。保存厌氧菌和霉菌不宜采用该法保存厌氧菌和霉菌不宜采用该法。小结小结:1、遗传、变异、突变和质粒的概念、遗传、变异、突变和质粒的概念2、菌种保藏的原理及常用方法、菌种保藏的原理及常用方法、遗传变异的类型和突变的主要特征、遗传变异的类型和突变的主要特征 4、菌种选育的常用方法、菌种选育的常用方法、菌种退化的判断。、菌种退化的判断。 2、菌种分离纯化的操作。、菌种分离纯化的操作。作业：作业：、：、p：83 1、2、3、4
