1、第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产第一节 悬浮培养愈伤组织的诱导和悬浮细胞系的建立Cell suspension culture: 将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。愈伤组织诱导和培养条件优化1、愈伤诱导（紫草为例） 先获得无菌苗 外植体诱导愈伤 注意：2，4D的合理使用2、培养条件优化 在系列单因子比较试验基础上，获得最合适的培养条件组合。悬浮细胞系的建立成功的悬浮细胞系：1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。3、生长迅速几个重要的生长、生产衡量指标绝对生长速率：Ra=(w2-w1)/(tv),w2、w1分别为培养物的最
2、终和起始干重(g)，t为培养时间(d), v为培养基体积(L)。产物含量干重产物含量干重表示：产物占愈伤组织干重的百分比。产物产量产物产量：每升培养基生产的产物量（mg)。悬浮培养细胞的同步化悬浮培养细胞的同步化1、分选法、分选法 梯度离心；梯度离心；Ficoll；流式细胞仪；流式细胞仪2、饥饿法、饥饿法3、抑制剂法、抑制剂法 FdU，HU4、低温处理、低温处理低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的培养温度，也可达到部分同步化。培养温度，也可达到部分同步化。第二节 单细胞培养1、平板培养（plating culture)：将一定密度悬浮细胞接种到一
3、薄层固体培养基中进行培养的技术。2、看护培养（nurse culture)3、微室培养（micro-chamber culture)4、其它：饲养层培养技术、双层滤纸植板 培养技术第三节 植物细胞的规模培养20%左右的药物由植物衍生已有30多种化合物在培养物中积累接近或超过原植物含量日本三井石油化学公司 产业化生产紫草宁植物细胞规模化培养需满足的条件1、培养的细胞遗传上稳定，得到产量恒定 的产物；2、细胞生长及生物合成的速度快，短时间内得到较高产量的终产物；3、代谢产物要在细胞内积累而不被迅速分解，最好释放到培养基中。植物细胞规模化培养体系的建立1、种子细胞的选择 单细胞克隆结合诱变和压力筛选
4、2、种子细胞系的增殖与放大培养3、大规模培养体系的建立 成批培养（batch culture)、饲喂批量培养；连续培养（continuous culture）；半连续培养利用生物反应器进行细胞大量培养1、搅拌式：可直接借用微生物培养的经验。但剪切力高。2、气动式：反应器内传热、传质良好。但驱除了CO2 C2H4等有利气体，能量利用率低。3、固定化细胞反应器：优点：固定化细胞易回收 固定化细胞有一定程度分化，利于次生代谢 环境条件易控制，细胞稳定 适于进行生物转化缺陷：代谢产物必须是分泌到胞外的第四节 培养细胞的次生代谢及产物积累 初生代谢产物：淀粉、糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸、维生素等 次生代
5、谢产物：由初生代谢产物经过一些独特的代谢次生代谢产物：由初生代谢产物经过一些独特的代谢途径派生出来的小分子化合物途径派生出来的小分子化合物，种类繁多，结构各异，包括酚类、黄酮类、香豆素、木质素、生物碱、有机酸、糖苷、萜类等。不是植物有机体最主要的成分，但在保持植物抗逆性、抗病性和抗虫性及担当信号分保持植物抗逆性、抗病性和抗虫性及担当信号分子方面子方面起重要作用。 植物次生代谢产物一直是药物和工业原料的重要来源。植物细胞培养生产次生代谢物的意义Plant cell culture: 在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。 植物资源短缺：滥采滥挖 资源植物栽培的缺陷：占用耕
6、地、受地域气候限制 植物细胞培养的优势：可摆脱对植物资源的依赖，保护物种多样性和生态环境。植物细胞培养生产次生代谢物的研究历史20世纪50年代 德、美、英、加拿大 由烟草、蔬菜细胞培养开始，80年代后集中于药用植物的组培、药用成分的研究。日本：80年代末，Nitto Denko公司在20kl生物反应器中实现紫草和人参的大规模细胞培养，以获得紫草素和人参皂苷，首先作为天然食品添加剂进入市场。国内研究成果国内研究集中于药用植物20世纪60年代，罗士韦首先开展人参的组培。1980年起，植物所叶和春主持国家攻关植物细胞大量培养方面的专题：紫草、新疆紫草、人参、三七、红豆杉、青蒿。与化工冶金（现过程工程
7、）研究所合作进行小试和中试。建立了新疆紫草高产细胞系。药用植物细胞大量培养的三个步骤1、诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系2、筛选高产细胞系3、生物反应器中大量培养细胞或细胞团。高产细胞系的筛选1、根据细胞表型进行筛选2、根据单细胞克隆次生代谢产物产量筛选。两步培养法1、药用植物组培中为何经常采用两步法？ 许多植物组培研究表明，促进细胞生长的条件和促进次生代谢物生产的条件并不相同，一些促进细胞生长的因子往往抑制次生代谢物的合成和积累。因此宜用两步法。2、何为二步法？第一步，愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖。第二步，细胞生长通过指数生长期后，转移到生产培养基上进行第二步培养，以获得最高次生产物产量。紫草两步培养的经验促进愈伤快速生长的因素促进愈伤快速生长的因素：较高浓度生长素、分裂素较高浓度NH4+25 黑暗促进紫草宁快速合成的因素促进紫草宁快速合成的因素：降低生长素、分裂素浓度或不加激素较低浓度NH4+ 较高浓度Cu2+25 黑暗前体及诱导子的作用 前体作用：细胞培养物中加入前体，可减弱限速酶作用，促进次生代谢物生产。 诱导子（elicitor):一类能引起植物细胞代谢强度改变或代谢途径改变的物质，主要指生物来源的化合物，如寡糖、多糖等。常用诱导子：真菌诱导子、茉莉酸及其甲酯、水杨酸等。培养物最佳转移时间和采收时间 愈伤在生长高峰时转到生产培养基上 产物含量最高时采收
