1、有机混合物的分离有机混合物的分离有机分析有机分析1 1、物理分离法、物理分离法 物理分离法是利用有机物挥发性、溶解性等的差别进行分离。在分离过程中，不改变化合物的组成和结构，通常采用的方法有以下几种。(1)(1)蒸馏法蒸馏法 在分析实验中，蒸馏是分离液体混合物最常用的方法。根据各组份对热的稳定性、挥发性和蒸汽压大小来选用不同的蒸馏方法。有机分析有机分析一、混合物分离的一般步骤一、混合物分离的一般步骤(2)(2)萃取法萃取法n液液萃取n液固萃取(3)(3)重结晶和升华重结晶和升华有机分析有机分析索氏萃取器 纯化固体物质的方法重结晶：不同物质在溶剂的溶解度差别升华：组分间的蒸汽压差别2 2、化学分
2、离法、化学分离法 有些有机混合物中的各组份的物理性质十分接近，找不到定量分离的方法，就必须根据各组份的化学性质，加以化学处理，使组份转变为性质差异较大的化合物，然后进行分离。分离后再用适当的试剂处理，使之变为原来的化合物。 有机分析有机分析3、二元混合物的分离、二元混合物的分离（1）根据溶解性差别根据溶解性差别 根据相似相溶原理，采用极性或非极性溶剂进行分离n水溶性和非水溶性：丙醇、溴丙烷n极性差别：二乙胺、乙二胺（弱、强）n溶解度不同：苯甲酸、对苯二甲酸（乙醚）（2）根据挥发性差别蒸馏法蒸馏法n单官能团化合物易蒸发：乙醇、乙酸、苯甲酸n多官能团化合物不易蒸发：乙二醇、草酸、邻苯二甲酸n7个碳
3、以下的烷烃、芳烃、环烷烃；35个碳以下的醇、醛、醚以及低级卤代烃、胺等化合物沸点较低，可直接用气相色谱法分离。（3）利用化学性质的差别n利用混合物中各组分酸碱性的差别，能和不同的成盐试剂反应成盐的原理，将不同组分转变为溶解性、挥发性差异较大的化合物。羧酸、磺酸、酚类胺类钠盐盐酸盐酸性和中性物5%NaOH碱性和中性物NaOH5%HCl5%NaOH弱酸与强酸5%NaHCO3利用特殊反应n伯仲叔胺兴士堡试验（苯磺酰氯）n醛与烃类（或其他不溶于水的中性化合物）苯甲醛苯亚硫酸氢钠羟基磺酸钠不反应4、多元混合物的分离n了解试样的来源，以提供试样可能的化学成分。n观察试样的物态，如是固、液混合物，可用过滤方
4、法将其初步分离，若为互不相溶的液态混合物，可用分液漏斗进行萃取分离。n检查试样是否含水。n溶解性试验。甲醇、乙醇、四氯化碳、苯等。n挥发性与灼烧试验。n试样酸碱性试验。n元素及官能团定性鉴定。C5HClNaOHNaOH多元混合物的分离方案多元混合物的分离方案HCl()NaOHHClpH=3pH=10()pH=89pH=23()NaHCO3HCln思考题n用流程图的形式表明下列混合物的分离程序n1.硝基苯 苯胺 苯酚 苯甲酸 n2.丙酮 苯甲酸 乙二胺 二 层析分离 知识点：知识点：色层分离法的分类及其概念。纸层析技术，薄层层析技术，柱层析技术，离交层析技术。 重点：重点：上述各技术的原理、操作
5、方式、操作过程、所用装置和材料的选择、适用范围。目录1 层析法概述2 纸层析3 薄层层析4 柱层析5 离子交换吸附层析1 层析法概述（1）引言（2）层析的发展史（3）层析的分类（4）层析剂（1） 引言p层析原理p色谱（层析）法应用范围p色谱技术的提出（2） 层析的发展史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 1931 Kuhn, Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Taylor Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941
6、Martin, Synge 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956Van Deemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975 Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981 Jorgenson创立了毛细管电泳法。（3） 层析的分类根据溶质分子与固定相
7、相互作用的机理不同的分类凝胶过滤法分配层析法离子交换色层分离法吸附层析法疏水作用色层分离法金属螯合色层分离法共价作用色层分离法据溶据溶质分质分子与子与固定固定相相相相互作互作用的用的机理机理不同不同吸附色谱离子交换色谱疏水作用层析金属螯合色谱共价作用色谱分配色谱凝胶过滤亲和色谱吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同类型机理优点缺点吸附色谱化学、物理吸附操作简便易受
8、离子干扰凝胶过滤分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分配色谱溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高进口试制昂贵吸附色谱与其它色谱法的异同点吸附色谱与其它色谱法的异同点 根据实验技术的分类低压层析技术中压层析技术高压层析技术电泳法操作压力在0.5MPa-5MPa之间操作压力在5Mpa-40MPa之间操作压力小于0.5MPa靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离根据固定相的形
9、状不同的分类： 柱层析法纸层析法薄层层析法固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相在玻璃平板上铺成薄层 根据流动相的物态不同的分类 气相层析法液相层析法液相层析法流动相为气体流动相为液态流动相为液态操作方式不同的分类迎头法顶替法洗脱分析法将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不能达到分离。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱溶剂可以是原来溶解混
10、合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。（4）层析剂种类氧化铝硅胶活性炭琼脂糖 纤维素2 纸层析法（1 1）基本原理）基本原理（2 2）影响影响Rf值的主要因素值的主要因素（3 3）层析条件的选择）层析条件的选择（4） 操作方法操作方法(1) (1) 基本原理基本原理 滤纸一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，一般情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。 小实
11、验1234 1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： Rf= a/ b式中a：溶质斑点中心的移动距离溶质斑点中心的移动距离 b：溶剂前沿移动的距离溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。 (2) 影响影响Rf值的主要因素值的主要因素 物质的结构和极性物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf
12、值就较小，反之亦然。 滤纸滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。 此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值，必要时要进行预处理，以去除杂质的影响。例如：可用0.01-0.4mol/L的HCl处理滤纸，以除去滤纸上的金属离子，然后再用水洗至中性。 层析滤纸由高纯度的棉花制成。要求质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，并具有一定的纯度。国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采用。 层析所用的溶剂层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所以溶剂
13、的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等。举例如下： (1) 苯酚：重蒸馏，收集180的馏分。 (2) 乙酸：在冰醋酸中加入1%重铬酸钾，蒸馏，收集118的馏分。 (3) 正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氢氧化钠溶液洗涤，再用无水碳酸钾脱水， 用磨口蒸馏器蒸馏，收集117的馏分。 pHpH值值 溶剂和样品的pH值会影响物质的解离
14、，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。 为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值，通过调节溶剂或样品溶液的pH值，使pH值保持恒定。 温度温度 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积；同时在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。 某些对温度敏感的溶剂系统，最好不要配成饱和溶液。如水饱和的酚溶液，可改成酚 水 4：1或5：
15、1等。展开方式展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同。用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较小。 样品溶液中杂质样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。 (3)(3)层析条件的选择层析条件的选择层析纸的选择和处理层析纸的选择和处理n要求滤纸质地均匀。n滤纸要纯净；不含影响展开效果的杂质；也不应与所用显色剂起作用。n滤纸对溶剂的渗透速度适宜有机分析有机分析型号 标重(g/m2) 厚度(mm)
16、吸水性 灰分(%) 性能 1900.17150-1200.08快速 2900.16120-910.08中速 3900.1590-600.08慢速 41800.34151-1210.08快速 51800.32120-910.08中速 61800.3090-600.08慢速 滤纸的选用展开剂的选择展开剂的选择n溶剂系统与被分离物质之间不应起化学反应。n物质在溶剂系统中的分配系数最好不受或少受温度变化的影响，并在两相中的分配能迅速达到平衡。这样易于得到圆形斑点。n挥发性较好，使滤纸在展开后易于干燥。n被分离物质在该溶剂系统中Rf值应在0.10.85之间。两个被分离物质的Rf值之差应大于0.05。有机
17、分析有机分析一般不使用单一有机溶剂作展开剂，多采用水饱一般不使用单一有机溶剂作展开剂，多采用水饱和的一种或几种有机溶剂作展开剂。和的一种或几种有机溶剂作展开剂。n常用溶剂：常用溶剂： 石油醚、苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸极性逐渐增强极性逐渐增强纸层析条件的选择最终还必须通过实践来决定。n羧酸羧酸C1C9溶剂：溶剂：（1）95%乙醇100mL，浓氨水1mL（2）正丁醇，冰乙酸，水（12：3：5）显色剂显色剂：0.06%溴酚蓝的乙醇溶液50mL，加30%氢氧化钠0.25mL纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂
18、及显色剂n酚酚溶剂：溶剂：（1）正丁醇，冰乙酸，水（4：1：5）（2）正丁醇，水，苯（1：9：10）显色剂显色剂：硝酸银的氨溶液5%三氯化铁的50%甲醇溶液，加热n胺胺溶剂：溶剂：（1）正丁醇，冰乙酸，水（4：1：5）（2）2-丁酮，丙酸，水（15：5：6）显色剂：显色剂：0.2%茚三酮的丙酮溶液，碘蒸气（用于叔胺）纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂及显色剂n醛、酮的2，4-二硝基苯腙溶剂：乙醚-己烷丙酮-己烷显色剂：本身有色n合成燃料合成燃料溶剂：溶剂：（1）正丁醇，乙醇，水（4：1：5）（2）2-丁酮，丙酸，水（15：5：6）显色剂：显
19、色剂：本身有色n醇的醇的3，5-二硝基苯甲酸酯二硝基苯甲酸酯溶剂：溶剂：20%1，4-二氧六环溶液显色剂：显色剂：0.5%-萘胺溶液纸上层析常用溶剂及显色剂纸上层析常用溶剂及显色剂(4) 操作方法 样品处理样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。 点样点样 将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般
20、每一样品的量为5-30g。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。 平衡平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。 展开展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开
21、结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。下行和环行三种方式。 a a、 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长。 b b、下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。 c c、 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂
22、由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特制滤纸。如东洋51UH滤纸等。 d、双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。 上行法是否适合上行法是否适合Rf值较小的物质分离值较小的物质分离？显色显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。 (1) 显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置
23、。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 定性分析定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。 定量分析定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： a、 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。 b、 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 c、 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质
24、含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。 3 薄层层析法（1） 薄层层析原理薄层层析原理（2）吸附剂的选择与处理）吸附剂的选择与处理（3）展开剂的选择）展开剂的选择（4）薄层板的制作）薄层板的制作 （5）层析方法）层析方法 （1 1）薄层层析基本原理）薄层层析基本原理 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为等，则称之为薄层吸附层析薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅如果
25、支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析。称为薄层凝胶层析。 优点：优点：u快速、展开时间短。u分离能力强：斑点小而清晰。u灵敏度高：能检出几微克至几十微克的物质，比纸层析灵敏10100倍。u显色方便，能直接喷洒腐蚀性的显色剂，如浓硫酸等。可以高温灼烧。u应用面广：可用于微量成分的分析，也可作制备层析。缺点：缺点：R
26、f值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。（2 2）吸附剂的选择与处理）吸附剂的选择与处理 薄层层析的吸附剂种类很多。使用时应根据欲分离物质的种类进行选择。 支持剂颗粒大小要适当。颗粒大，展开速度快。但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象。一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm)，薄层厚度为1-2mm；无机类支持剂如氧化铝 、硅胶等的颗粒一般为150-300目，薄层厚度为0.25-1mm。 在薄层层析中，使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析。同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持
27、剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理。 （3）展开剂的选择）展开剂的选择 薄层层析所用展开剂主要是低沸点的有机溶剂，一般使用23种组分的多元溶剂系统。 在选择展开剂时，应根据展开剂的极性、被测物的极性及吸附剂的活性三个方面来考虑。三角图形法可作为一个初步估计的方法。通过试验选择展开剂，常用下面两种方法： 微量圆环法 载玻片法 （4 4）薄层板的制作）薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、 干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板
28、上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可以直立展开，而软板只能接近水平展开。 薄层板常用的制作方法有：薄层板常用的制作方法有： 1.1.浸涂法浸涂法：将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液在玻璃板上形成薄层。 2. 2.喷涂法：喷涂法：用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。 3. 3.倾斜涂布法：倾斜涂布法：将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成薄层。 4.4.推铺法推铺法：在一根玻璃棒的两端适当距离处分别绕几圈胶布条，胶布条的圈数视所需薄层厚度而定，然后把准备好的支持剂倒在玻璃板上，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均衡地向一个方面推动，
29、而制成薄层。 推铺法既适用于干板的涂布和湿板制作。其他方法只能用于湿板制作。 湿板制作中的一个重要环节是调浆，一般支持剂与蒸馏水或缓冲液之比一般为1 2至1 2.5 。调浆时要调和均匀，但不宜用力过猛，以免产生气泡而影响分离效果。 薄层板涂好后，让其自然干燥后方能使用。若为吸附薄层层析，制好板后还需加热活化，目的是使其减少水分而具有一定有吸附能力。 （5 5）层析方法）层析方法 1.1.点样点样 点样操作与纸上层析相似。点样前，先将制好的薄层修整一下，然后在距一端2cm左右处划 一原线，并每隔2cm左右划一原点。样品用合适的溶剂溶解，吸附薄层层析一般用氯仿、乙醇等有机溶剂溶解，不宜用水溶解。点
30、样可用微量注射器，或微量吸管、毛细管。点样量一般在50g 之内，点样体积不宜超过20L。样品液可直接点在薄层板的原点上。也可点在圆形滤纸片上(直径2-3mm)，再把滤纸片小心地放在薄层板原点上，并加少许可溶性淀粉糊，使滤纸片粘牢在薄层板上。 2.2.展开展开 展式方式与纸层析一样，有上行法、下行法等，但软板薄层只能近水平展开(与水平成10o-20o)。 吸附薄层层析所用展开剂主要是低沸点的有机溶剂，一般采用2-3种组分的多元溶剂系统。 展开剂的选择是根据被分离物极性、溶剂的极性以及支持剂的特性三方面来考虑。分配薄层层析展开剂的选择与分配薄层层析展开剂的选择与纸上层析相似。纸上层析相似。离子交换
31、薄层层析、凝胶过滤薄层离子交换薄层层析、凝胶过滤薄层层析展开剂的选择则与相应柱层析的洗脱剂的选择层析展开剂的选择则与相应柱层析的洗脱剂的选择相同。相同。 3.显色显色 薄层层析展开后，如果样品本身有颜色，就可直接看到斑点所在位置。若是无色物质 ，则需加以显色。显色方法与纸层析一样，可用显色剂显色，也可用紫外光显色。此外，如果薄层板是由无机物质制成的，还可以用强腐蚀性的显色剂，如硫酸、硝酸、铬酸或它们的混合物，这些强酸几乎可以使所有有机化合物变为碳，而成黑色斑点，但不能用于定量分析。4.4.定性与定量分析定性与定量分析 薄层层析法与纸层析一样，用Rf值来表示被分离物质在薄层上的位置，与已知标准物
32、质 的Rf对照，可进行定性分析。 定量分析时，可把斑点所在位置的支持剂连同物质一起刮下，然后用适当溶液将其从支持剂上溶解下来，再测定其含量。用目测法比较样品斑点和对照品斑点的颜色深度和面积大小， 或测量斑点的面积，可以进行半定量分析和限度检查，有条件时，可用薄层扫描仪进行定量分析。 http:/ 芍药甙薄层层析扫描图 图2 丹皮酚薄层层析扫描图 1 1、为什么不能用开裂的薄板来展开？、为什么不能用开裂的薄板来展开？ 2 2、薄板展开时如果展开缸不密闭会引起什、薄板展开时如果展开缸不密闭会引起什么结果？么结果？ 3 3、要分离一个酸性化合物，使用哪种吸附、要分离一个酸性化合物，使用哪种吸附剂比较
33、好？剂比较好？4、吸附柱层析(1)基本原理(2) 吸附剂的选择(3) 洗脱涤的选择(4) 操作 （1）基本原理）基本原理 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲冲洗的过程称为洗脱，洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱加入的溶剂称为洗脱剂。剂。 在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解
34、吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。 如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。 (2) 吸附剂的选择 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附
35、剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。 1.羟基磷灰石 羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，简称HA的吸附容量高，稳定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如有时有些样品如RNARNA、双链、双链DNADNA
36、、单链、单链DNADNA和杂合型双链和杂合型双链DNA-RNADNA-RNA等，等，经过一次经过一次HAHA柱层析，就能达到有效的分离。柱层析，就能达到有效的分离。 使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按16体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液
37、洗涤平衡，如此处理后即可使用； (4) 就操作容量来说，细颗粒HA比粗的大。而从分辨率比较，细的比粗的好。用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能达到满意的流速。 2. 2. 硅胶硅胶 最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 u水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活失去活性性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程称为活化活化。如果将硅如果将硅胶加热到胶
38、加热到500，硅醇基结构会变成硅，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。氧烷结构，吸附能力显著下降。 u硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。3.氧化铝 分酸性、碱性和中性酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的酯类等化合物。 氧化铝用前也需脱水活化氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间， 可得到级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。4.大孔吸附树脂和
39、聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。 (3) (3) 洗脱涤的选择洗脱涤的选择 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件： 纯度较高； 稳定性好； 能较完全洗脱所分离的成分； 黏度小； 易和所需要的成分分开。 u洗脱剂根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 u选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。u总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。 (4) 操作 柱层析的
40、设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。 1.1.层析柱层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为110- 140。采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。 2.2.吸附剂的用量吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时， 吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大
41、于样品的100倍 3.3.装柱装柱 装柱的方法分干装法和湿装法干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内， 排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。 装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗
42、脱剂一致。4. 4. 上样和洗脱上样和洗脱 经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2 (当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率)。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。u随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。u根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐
43、标，有合适的检测器和记录仪时，洗脱液流经检测器再收集，用记录仪可自动绘制洗脱曲线。 http:/ 理想的洗脱曲线如图所示。图中的峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。必恰当控制。n 如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；n 如果太慢，洗脱物会扩散。n 若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，n 若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加 大洗脱剂的强度(极性)，n 成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到
44、强的梯度洗脱 (方法见离子交换层析)。 4 离子交换层析一、基本原理一、基本原理二、离子交换剂二、离子交换剂三、操作三、操作 离子交换剂是由基质基质、电荷基团电荷基团(或功能基团)和反离子反离子构成的，基质与电荷基团以共价键连接，电荷基因与反离子以离子键结合。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+ RB+A+ 一、一、基本原理基本原理 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白
45、质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，它的大小是由离子交换剂的选择性决定的它的大小是由离子交换剂的选择性决定的。n强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+ 的小；n强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl- 的小得多；n弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；n弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。衡是决定吸附容量的重要
46、因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。u 离子价数越高，结合力越大。离子价数越高，结合力越大。u 在离子间电荷相同时，水合离子半径越小，在离子间电荷相同时，水合离子半径越小，结合力亦越大结合力亦越大。氨基酸的分离过程氨基酸的分离过程二、离子交换剂二、离子交换剂 离子交换剂应满足的基本条件有：离子交换剂应满足的基本条件有： 有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解； 有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换； 有较多的交换基团； 有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理
47、或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。 ( (一一) ) 离子交换剂的种类离子交换剂的种类 根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类： 1. 1. 疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：离子交换树脂以电荷基团的性质分则有： 阳离子交换树脂阳离子交换树脂 阴离子交换树脂阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团分别包括强、中、弱三种电荷基团)
48、 螯合离子交换树脂螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性对金属离子有较强的选择性)(1) (1) 阳离子交换剂阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。因此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型( 带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种。 (2) (2) 阴离子交换剂阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺季胺-N(CH-N(CH3 3) )3 3、叔胺、叔胺-N(CH-N(CH3 3) )2 2、仲胺、仲胺 -NHCH -NHCH3 3和伯胺和伯胺-NH-NH2 2
49、基团构成的。 当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。 当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。 疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留能力。阳离子交换树脂对氨基酸的分离 2. 2.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 这类交换剂与水的亲和力较大，载体孔径大，适合于分离生物大分子，有多种类型： (1) (1) 纤维素离子交换型纤维素离子交换型 以纤维素为基质，常用的功能基因有磷酸基(P.中强酸型)、磺酸乙基(SE，强酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，强碱型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱碱型)、氨基乙基(AE，中等碱型)、三乙醇基氨
50、基(ECTE，中等碱型)等，可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型。 (2) (2) 葡聚糖系离子交换剂葡聚糖系离子交换剂 以SephadexG25和G50为基质，分别引入DEAE、QAE(二乙基(二羧丙基)氨基乙基，弱碱型)、CM、SP(磺丙基、强酸型)等功能基因，构成8种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除离子交换作用外，还有分子筛作用，但层析时床体积随洗脱剂离子强度的增加而缩小，以SephadexG50为基质的交换剂尤其明显，为使用带来不便。 ( (二二) ) 离子交换剂的选择离子交换剂的选择 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品。因此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的
