1、2022-6-231生化过程参数的检测和控制生化过程参数的检测和控制2022-6-232教学时数：教学时数：4 4学时学时教学目的与要求：教学目的与要求：了解生化过程参数的分类及了解生化过程参数的分类及生物传感器的种类及特点，能利用生物传感器生物传感器的种类及特点，能利用生物传感器对生化反应中的直接参数进行检测，并通过参对生化反应中的直接参数进行检测，并通过参数判断生产过程是否染菌，掌握杂菌染菌的途数判断生产过程是否染菌，掌握杂菌染菌的途径及挽救；径及挽救；教学重点：教学重点：直接参数的检测、生产过程中的染直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制；菌及其控制；教学难点：教学难点：直接参数的检测
2、、生产过程中的染直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制。菌及其控制。2022-6-233本章主要内容本章主要内容v第一节第一节 直接参数的检测与控制直接参数的检测与控制v第二节第二节 生物传感器生物传感器v第三节第三节 生产过程中的染菌及其控制生产过程中的染菌及其控制2022-6-234教学时数：教学时数：4学时学时教学目的与要求：教学目的与要求：了解生化过程参数的分类及生物了解生化过程参数的分类及生物传感器的种类及特点，能利用生物传感器对生化反传感器的种类及特点，能利用生物传感器对生化反应中的直接参数进行检测，并通过参数判断生产过应中的直接参数进行检测，并通过参数判断生产过程是否染菌，掌握
3、杂菌染菌的途径及挽救；程是否染菌，掌握杂菌染菌的途径及挽救；教学重点：教学重点：直接参数的检测、生产过程中的染菌及直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制；其控制；教学难点：教学难点：直接参数的检测、生产过程中的染菌及直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制；其控制；2022-6-235 在发酵工业中，除了要考虑已接种的微生物在发酵工业中，除了要考虑已接种的微生物本身的特殊需要外，由于产品的要求还应适当考本身的特殊需要外，由于产品的要求还应适当考虑培养基的组成、虑培养基的组成、pHpH值、温度、水分、氧气、杂值、温度、水分、氧气、杂菌污染等条件。这些条件的变化反映了发酵过程菌污染等条件。这些条
4、件的变化反映了发酵过程的动态。人们在实践中，正是通过观察和控制这的动态。人们在实践中，正是通过观察和控制这些工艺条件从而控制和完成发酵过程。当然，这些工艺条件从而控制和完成发酵过程。当然，这些条件之间是相互联系的、相互影响的，认真研些条件之间是相互联系的、相互影响的，认真研究发酵产物的调控机制，并创造所必需的分析和究发酵产物的调控机制，并创造所必需的分析和传感仪表，以提供这些控制发酵工艺取得成效，传感仪表，以提供这些控制发酵工艺取得成效，显然也是生化工程的重要课题。显然也是生化工程的重要课题。2022-6-236生化过程参数的分类生化过程参数的分类 反映生化过程变化的参数分为两大类：一类是反映
5、生化过程变化的参数分为两大类：一类是可以直接采用特定的传感器检测的参数称为直接可以直接采用特定的传感器检测的参数称为直接参数，包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数，包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数：如温度、压力、流量、搅拌功率、转速、参数：如温度、压力、流量、搅拌功率、转速、泡沫、黏度、浊度、泡沫、黏度、浊度、pHpH、离子强度、溶解氧和基、离子强度、溶解氧和基质浓度等。另一类是综合参数，包括细胞生长速质浓度等。另一类是综合参数，包括细胞生长速率、产物合成速率、呼吸商等。率、产物合成速率、呼吸商等。2022-6-237 用于发酵工业的传感器，除了应满足一般测用于发酵工业的传感器，除
6、了应满足一般测量仪表的要求外，还应具有几个方面的面的特量仪表的要求外，还应具有几个方面的面的特征：征：（1 1）传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽）传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（120-135,30min120-135,30min以上）灭菌处理；以上）灭菌处理；（2 2）传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，）传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在在1-21-2周内其测量误差应小于周内其测量误差应小于5%5%；2022-6-238（3 3）最好能在使用过程中随时校正；）最好能在使用过程中随时校正；（4 4）材料不易老化，使用寿命长；）材料不易老化，使用寿命长；（5 5）传感器的探头安装和使
7、用方便；）传感器的探头安装和使用方便；（6 6）探头不易被物料粘住、堵塞；）探头不易被物料粘住、堵塞；（7 7）价格便宜。）价格便宜。2022-6-239 第一节第一节 直接参数的检测和控制直接参数的检测和控制一一. . 温度检测和控制温度检测和控制 严格保持菌种的生长繁殖和生物合严格保持菌种的生长繁殖和生物合成所需的最适温度，对稳定发酵过程，成所需的最适温度，对稳定发酵过程，缩短周期，提高产量，具有重要意义。缩短周期，提高产量，具有重要意义。通常可以采用水银温度计、热电阻监通常可以采用水银温度计、热电阻监测系统中的温度。测系统中的温度。普遍使用的热电阻普遍使用的热电阻有铂电阻和铜电阻。有铂电
8、阻和铜电阻。2022-6-2310铂电阻铂电阻精度高、稳定性好、性能可靠；铜电阻超精度高、稳定性好、性能可靠；铜电阻超过过100100时易被氧化。为了使生物反应在适当的时易被氧化。为了使生物反应在适当的温度下进行，必须采取措施温度下进行，必须采取措施在夹套或蛇管内在夹套或蛇管内通入冷却水加以控制。通入冷却水加以控制。发酵热的测定发酵热的测定(1)(1)通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出。的进出。Q Q发酵发酵= =GC(TGC(T2 2-T-T1 1)/V)/VQ Q发酵发酵-发酵热发酵热;C-;C-冷却水的比热冷却水的比热G-G-冷却水的流量冷
9、却水的流量; ;T T1 1T T2 2-进出口冷进出口冷却水的温度却水的温度; V-; V-发酵液的体积发酵液的体积2022-6-2312(2)(2)通过罐温度的自动控制，先使罐温达到恒通过罐温度的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升的速率的速率S S。 Q Q发酵发酵=(M=(M1 1C C1 1+M+M2 2C C2 2)S/V)S/VM M1 1-发酵液重量发酵液重量;M;M2 2-发酵发酵罐重量罐重量;C;C1 1-发酵液比热发酵液比热;C;C2 2-发酵罐材料比热发酵罐材料比热;S-;S-温升速率温升速率Q Q发酵发酵
10、-发酵热发酵热2022-6-2313(3)(3)根据化合物的燃烧值计算发酵过程中生物热的根据化合物的燃烧值计算发酵过程中生物热的近似值。近似值。 根据赫斯定律，热效应决定于系统的初态和终根据赫斯定律，热效应决定于系统的初态和终态，而与变化的途径无关。反应的热效应等于产物态，而与变化的途径无关。反应的热效应等于产物的生成热总和减去作用物的生成热总和，也可以用的生成热总和减去作用物的生成热总和，也可以用燃烧热来计算热效应，特别对于有机化合物，燃烧燃烧热来计算热效应，特别对于有机化合物，燃烧热可直接测定，所以采用燃烧热来计算更合适。热可直接测定，所以采用燃烧热来计算更合适。2022-6-2314 反
11、应热效应等于作用物的燃烧热总和（消反应热效应等于作用物的燃烧热总和（消耗培养基释放的能）减去生成物的燃烧热总和耗培养基释放的能）减去生成物的燃烧热总和（产物和菌所具有的能），可用下式计算：（产物和菌所具有的能），可用下式计算：()()HHH 作 用 物产 物 (4)测定微生物生长代谢中的耗氧量。测定微生物生长代谢中的耗氧量。 -发酵过程中生成的发酵热数量；发酵过程中生成的发酵热数量； -基质完全氧化需氧量与菌体和基质完全氧化需氧量与菌体和产物完全氧化需氧量之差，即微生物产物完全氧化需氧量之差，即微生物在生长和代谢过程中所消耗的氧；在生长和代谢过程中所消耗的氧；20()OQHQ2O2022-6-
12、2316 - -代表微生物呼吸（供氧）反应的代表微生物呼吸（供氧）反应的焓变，若以有效电子转移（物质在氧化过程中焓变，若以有效电子转移（物质在氧化过程中伴随着能量释放所进行的电子转移）为基准，伴随着能量释放所进行的电子转移）为基准，则：则： 其中为有机化合物氧化时每转移一个有效其中为有机化合物氧化时每转移一个有效电子所平均释放出的热量；电子所平均释放出的热量；4 4为消耗为消耗相应的有效电子转移数（当相应的有效电子转移数（当1 1葡萄糖葡萄糖0H024() 4 ( 26.5)106 /)aveHHkal m olO 2022-6-2317完全氧化时，需要消耗完全氧化时，需要消耗6 6氧气，相应
13、的有氧气，相应的有效电子转移数为效电子转移数为2424，释放的能量应为，释放的能量应为: : 04()4 ( 26.5)106/)aveHHkal mol 葡萄糖21 0 6OQ所以：所以： 由此可见，通风（耗氧）发酵过程生成的发酵热由此可见，通风（耗氧）发酵过程生成的发酵热数量与过程所消耗的氧是成正比。当测得发酵过程数量与过程所消耗的氧是成正比。当测得发酵过程中氧的消耗（可根据气体分析和通风量进行计算得中氧的消耗（可根据气体分析和通风量进行计算得到），就能把发酵过程中需要移去的热量计算出来。到），就能把发酵过程中需要移去的热量计算出来。2022-6-2318 根据理论推导和试验验证，可以用下
14、式对通根据理论推导和试验验证，可以用下式对通风发酵过程生成热进行估算：风发酵过程生成热进行估算：Q QH H=(0.1060.124)Q=(0.1060.124)QO2O2(1/10)Q(1/10)QO2O2Q QO2O2-比耗氧速率比耗氧速率(mmolO(mmolO2 2/g/g菌体菌体.h).h)Q QH H-发酵热生成的比速发酵热生成的比速(kcal/g(kcal/g菌体菌体.h).h) 当通风发酵出现溶解氧不足时，有的的微生当通风发酵出现溶解氧不足时，有的的微生物能够进行厌氧反应。则出现物能够进行厌氧反应。则出现: : Q QH H(0.1060.124)Q(0.1060.124)QO
15、2O2。如果出现这种情况，就。如果出现这种情况，就可以得出溶氧不足的结论。可以得出溶氧不足的结论。 二二. pH. pH的检测和控制的检测和控制pHpH值可用耐灭菌的玻璃电极和银值可用耐灭菌的玻璃电极和银- -汞参比电极以及汞参比电极以及pHpH测量仪表的检测系统检测，可连续指示罐内酸碱变化。测量仪表的检测系统检测，可连续指示罐内酸碱变化。微生物反应过程中微生物反应过程中pHpH的变化具有一定规律。的变化具有一定规律。在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种不同，相对于接种后的起始不同，相对于接种后的起始pHpH值有上升或下降趋势值有上升或下降趋
16、势2022-6-2320在生产阶段，一般反应液的在生产阶段，一般反应液的pHpH值趋于稳定，维值趋于稳定，维持在最适合产物形成的范围。持在最适合产物形成的范围。在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃，微生物自溶，引起培养液中的氨基氮等的增跃，微生物自溶，引起培养液中的氨基氮等的增加，致使加，致使pHpH值有上升。值有上升。引起反应液引起反应液pH pH 值下降的主要原因有：值下降的主要原因有：1.1.培养基中的碳培养基中的碳/ /氮比例不当，碳源过多，特别是氮比例不当
17、，碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质氧化不完全，培养液中有机酸会致使糖等物质氧化不完全，培养液中有机酸会大量积累，从而使大量积累，从而使pHpH值下降值下降2. 2. 消泡油加得过多；消泡油加得过多；3. 3. 微生物生理性物质的存在，使微生物生理性物质的存在，使pHpH值下降。值下降。2022-6-2322引起反应液引起反应液 pHpH值上升的主要原因有：值上升的主要原因有：1.1.培养基中的碳培养基中的碳/ /氮比例不当，碳源过多，氨基氮比例不当，碳源过多，氨基氮释放氮释放会使会使pHpH值上升。值上升。2.2.生理
18、碱性物质存在。生理碱性物质存在。3.3.中间补料液中氨水或尿素等碱性物质的加入中间补料液中氨水或尿素等碱性物质的加入过多。过多。1.1.调节培养基中的原始调节培养基中的原始pHpH值，或加入缓冲溶液制成值，或加入缓冲溶液制成缓冲能力强、缓冲能力强、pHpH值变化不大的培养基。值变化不大的培养基。2. 2. 可在反应过程中加入弱酸或弱碱进行可在反应过程中加入弱酸或弱碱进行pHpH值的调节，值的调节，进而合理地控制发酵条件，也可通过调整通风量进而合理地控制发酵条件，也可通过调整通风量来控制来控制pHpH值。值。3. 3. 进行补料，既调节了培养液的进行补料，既调节了培养液的pHpH值，又可补充营值
19、，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高产率。提高产率。反应液中反应液中pHpH值的控制方法值的控制方法2022-6-23244. 4. 采用酸性铵盐作为氮源时，由于采用酸性铵盐作为氮源时，由于NHNH4 4+ +被利用被利用后，剩下的酸根会引起发酵液中的后，剩下的酸根会引起发酵液中的pHpH值下降，值下降，在培养液中可加入碳酸钙来调节在培养液中可加入碳酸钙来调节pHpH值。值。5. 5. 根据根据pHpH值的变化可用流加氨水的方法来调节，值的变化可用流加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。同时又可把氨水作为氮源供给。6.
20、6. 以尿素作为氮源进行流加调节以尿素作为氮源进行流加调节pHpH值。值。三三. . 泡沫的影响和控制泡沫的影响和控制太多的泡沫给反应带来不利的影响太多的泡沫给反应带来不利的影响1. 1. 使反应器的装填系数减少；使反应器的装填系数减少；2. 2. 造成大量逃液，导致产物的损失；造成大量逃液，导致产物的损失；3. 3. 泡沫泡沫“顶罐顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加了染菌的机会。渗出，增加了染菌的机会。2022-6-23264. 4. 由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮，使微生物生长的环境发生了生物随泡
21、沫漂浮，使微生物生长的环境发生了变化，影响了微生物群体的效果，增加了微生变化，影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的不均一性。物群体的不均一性。5. 5. 影响了搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼影响了搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸。吸。6. 6. 使微生物提早自溶。使微生物提早自溶。7. 7. 为了控制泡沫，需加入消泡剂。对产物的提为了控制泡沫，需加入消泡剂。对产物的提取不利。取不利。微生物反应过程产生泡沫的原因微生物反应过程产生泡沫的原因1. 1. 由外界引进的气流被机械地分散形成由外界引进的气流被机械地分散形成2. 2. 反应过程产生的气体聚结生成的泡沫反应过程产生的气体聚结生成的
22、泡沫培养基的物理化学性质对泡沫形成的表面现象起培养基的物理化学性质对泡沫形成的表面现象起决定作用，此外，培养基的温度、酸碱度、浓度决定作用，此外，培养基的温度、酸碱度、浓度等对过程的泡沫也有一定的影响。培养基中的蛋等对过程的泡沫也有一定的影响。培养基中的蛋白质含量越多，反应液的黏度也越大，越容易起白质含量越多，反应液的黏度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久稳定。泡，泡沫多而且持久稳定。泡沫的控制泡沫的控制化学消泡化学消泡消泡机理：消泡机理：1.1.消泡剂是表面活性物质，降低气泡表消泡剂是表面活性物质，降低气泡表面张力，使气泡破裂面张力，使气泡破裂2. 2. 降低机械强度（降低液膜降低机械强度（
23、降低液膜的弹性）的弹性）3.3.降低膜表面的黏度。降低膜表面的黏度。天然油脂类、高级醇类、聚醚类、硅酮类、氟化烷天然油脂类、高级醇类、聚醚类、硅酮类、氟化烷烃等烃等2022-6-2329生产中的一些用法：生产中的一些用法：(1)(1)通过机械搅拌，使消泡剂更易于分散在反应通过机械搅拌，使消泡剂更易于分散在反应液中。液中。(2)(2)将消泡剂与载体一起使用，使消泡剂溶于或将消泡剂与载体一起使用，使消泡剂溶于或分散于载体中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡剂时，分散于载体中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡剂时，以豆油为载体的消泡增效作用明显。以豆油为载体的消泡增效作用明显。(3)(3)多种消泡剂并用可增强消泡作
24、用。多种消泡剂并用可增强消泡作用。(4)(4)使用乳化剂增强消泡剂的消泡作用，如消泡使用乳化剂增强消泡剂的消泡作用，如消泡剂聚氧丙烯甘油用吐温剂聚氧丙烯甘油用吐温-80-80为乳化剂的增效作用为乳化剂的增效作用可提高可提高1212倍。倍。 机械消泡机械消泡 靠机械强烈振动和压力的变化，促使细胞破裂，靠机械强烈振动和压力的变化，促使细胞破裂，或借助机械力将排出气体中的液体加以分离回收，或借助机械力将排出气体中的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。机械消泡的优点是不需在从而达到消泡的作用。机械消泡的优点是不需在发酵液中加入其他物质，减少了由于加入消泡剂发酵液中加入其他物质，减少了由于加入消泡剂所
25、引起的染菌机会和对后续分离的影响。但是机所引起的染菌机会和对后续分离的影响。但是机械效果不如化学消泡迅速、可靠、不能根本上消械效果不如化学消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起稳定泡沫的因素，而且它还需要一定的设除引起稳定泡沫的因素，而且它还需要一定的设备和消耗一定的动力。备和消耗一定的动力。液位电极控制消泡剂的流加液位电极控制消泡剂的流加液位电极是根据空气与带有发酵液的泡沫液位电极是根据空气与带有发酵液的泡沫导电率不同的原理制造。导电率不同的原理制造。采用双位式的控制方法，当反应物液面达采用双位式的控制方法，当反应物液面达到一定的高度时，自动打开消泡剂的阀门，到一定的高度时，自动打开消泡剂的阀门
26、，当液面降回到正常时，自动关闭消泡剂当液面降回到正常时，自动关闭消泡剂的阀门。的阀门。2022-6-2332第二节第二节 生物传感器生物传感器传感器（电极或探头）：传感器（电极或探头）：能感受规定的被测量并能感受规定的被测量并按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装置，它通常由敏感元件、转化元件及相应的机械置，它通常由敏感元件、转化元件及相应的机械结构和线路组成。结构和线路组成。生物传感器：生物传感器：是利用酶、抗体、微生物等作为敏是利用酶、抗体、微生物等作为敏感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进行检测
27、的传感器。行检测的传感器。2022-6-2333生物传感器的应用领域生物传感器的应用领域临床检测：葡萄糖临床检测：葡萄糖85%85%，乳酸盐及其他，乳酸盐及其他4%4%，研究研究4%4%。药物：药物：3%3%环境：环境：2%2%食品：食品：2%2%机器人、国防及其他：机器人、国防及其他：1%1%2022-6-2334生物传感器的结构和原理生物传感器的结构和原理 生物传感器的结构一般是在基础传感器生物传感器的结构一般是在基础传感器( (电化电化学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探
28、头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物质时，形成复合体，随之进行生化和电化感物质时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知的学反应，产生普通电化学装置能感知的O O2 2、H H2 2、 NHNH4 4+ +、COCO2 2等，并通过电化学装置转换为电信号等，并通过电化学装置转换为电信号生物传感器的特点生物传感器的特点1)1)对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。2)2)操作简单，需用样品少，能直接完成
29、测定。操作简单，需用样品少，能直接完成测定。3)3)经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感器可经得住反复使用。器可经得住反复使用。4)4)能在短时间内完成测定。能在短时间内完成测定。5)5)不要求样品具有透明度。不要求样品具有透明度。6)6)主要缺点是寿命较短。主要缺点是寿命较短。2022-6-2336生物传感器的种类生物传感器的种类酶传感器酶传感器微生物传感器微生物传感器免疫传感器免疫传感器细胞传感器细胞传感器组织传感器组织传感器生物电子传感器生物电子传感器2022-6-2337发酵工业中的传感器的特点发酵工业中的传感器的特点1.1.传感器能安装在发
30、酵罐内耐受高压蒸汽传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（120135120135、30min30min以上）灭菌处理；以上）灭菌处理；2.2.传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在1212周内其测定误差应小于周内其测定误差应小于5%5%；3. 3. 最好在使用过程中随时校正；最好在使用过程中随时校正；2022-6-23384. 4. 材料不易老化，使用寿命长；材料不易老化，使用寿命长；5.5.传感器探头安装和使用方便；传感器探头安装和使用方便；6.6.探头不易被物料粘住、堵塞；探头不易被物料粘住、堵塞；7.7.价格便宜价格便宜2022-6-2339第三节第三
31、节 生产过程中的染菌及其控制生产过程中的染菌及其控制生物反应过程染菌的分析生物反应过程染菌的分析1. 1. 种子培养和发酵的异常现象种子培养和发酵的异常现象种子培养异常种子培养异常异常的主要表现有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化异常的主要表现有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。以及培养液的理化参数变化。发酵异常发酵异常主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮或过早老化，主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮或过早老化，以及糖、氮、以及糖、氮、pHpH、泡沫、发酵产物、发酵浓度等理化参、泡沫、发酵产物、发酵浓度等理化参数不正常。数不正常。2022-6-2340染菌的检查与判
32、断染菌的检查与判断 在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。成严重经济损失的重要手段。 1. 1. 显微镜检查法（镜检法）显微镜检查法（镜检法） 对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。特征区别，判断是否染菌。2022-6-2341 如发现有与生产菌形态特征不一样的其他如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物的存在，就可断定为发生
33、了染菌。此微生物的存在，就可断定为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、最直接，也是最常用法检查杂菌最为简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。必要时还可进行芽孢染色的检查方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。或鞭毛染色。2. 2. 肉汤培养法肉汤培养法 通常用组成为通常用组成为0.3%0.3%牛肉膏、牛肉膏、0.5%0.5%葡萄糖、葡萄糖、0.5%0.5%氯化钠、氯化钠、0.8%0.8%蛋白胨、蛋白胨、0.4%0.4%的的1%1%酚红溶液酚红溶液（pH7.2pH7.2）的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将）的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基待检样品直接接入经完
34、全灭菌后的肉汤培养基中，分别于中，分别于3737和和27 27 进行培养，观察微生进行培养，观察微生物生长情况，并进行镜检，判断是否染菌。常物生长情况，并进行镜检，判断是否染菌。常用来检查培养基和无菌空气中是否带菌。用来检查培养基和无菌空气中是否带菌。2022-6-23433. 3. 平板划线培养或斜面培养检查法平板划线培养或斜面培养检查法 将待检样品在无菌平板上划线，分别于将待检样品在无菌平板上划线，分别于37 37 和和2727下进行培养，一般下进行培养，一般24h24h后即可进行镜检观后即可进行镜检观察察, ,检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的
35、灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37 37 条件下培养条件下培养6 6小时，使杂菌迅速增殖后再划线。小时，使杂菌迅速增殖后再划线。 4. 4. 发酵过程的异常现象观察法发酵过程的异常现象观察法 根据发酵过程出现的异常现象如溶解氧、根据发酵过程出现的异常现象如溶解氧、pHpH值、排出气中的值、排出气中的COCO2 2含量以及微生物菌体的酶活力含量以及微生物菌体的酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。溶解氧水平等的异常变化来检查发酵是否染菌。溶解氧水平异常变化，对于特定的发酵过程具有一定的溶解异常变化，对于特定的发酵过程具有一定的溶解氧水平，而且在不同的发
36、酵阶段其溶解氧的水平氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵染菌发生的表现。了异常的变化，一般就是发酵染菌发生的表现。2022-6-2345谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化 由于染菌的杂菌的好氧性不同，产生的溶解氧由于染菌的杂菌的好氧性不同，产生的溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好气性微生异常的现象也是不同的。当杂菌是好气性微生物，溶解氧的变化是在短时间内下降，直至接物，溶解氧的变化是在短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是
37、非近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。长，使耗氧量减少，溶解氧升高。 排气中的排气中的COCO2 2异常变化，好气性发酵排出异常变化，好气性发酵排出的气体中的的气体中的COCO2 2含量与糖的代谢有关。对于特含量与糖的代谢有关。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中的定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中的COCO2 2含量的变化是有规律的。含量的变化是有规律的。2022-6-2347染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中气中CO
38、2CO2含量的异常变化，如杂菌污染时，糖含量的异常变化，如杂菌污染时，糖消耗加快，消耗加快， CO2CO2含量增加，噬菌体污染污染后，含量增加，噬菌体污染污染后，糖消耗减缓，糖消耗减缓， CO2CO2含量。含量。 还可根据其他一些现象，如泡沫异常增多、还可根据其他一些现象，如泡沫异常增多、发酵液的颜色异常变化，代谢产物异常下跌、发酵液的颜色异常变化，代谢产物异常下跌、发酵周期拖长、黏度异常增加等来判断染菌。发酵周期拖长、黏度异常增加等来判断染菌。 在众多的方法中，应以在众多的方法中，应以无菌试验和平板培养无菌试验和平板培养为为主，主，其他方法为辅来进行染菌的判断其他方法为辅来进行染菌的判断。无
39、菌试。无菌试验时，如果肉汤培养基连续三次发生变色反应验时，如果肉汤培养基连续三次发生变色反应或产生混浊，或平板培养连续三次发现有杂菌或产生混浊，或平板培养连续三次发现有杂菌菌落的出现，即可判断为染菌。菌落的出现，即可判断为染菌。2022-6-2349有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑的染菌反应，并经镜检品的各项参数确有可疑的染菌反应，并经镜检等其他方法确认连续三次有相同类型的杂菌存等其他方法确认连续三次有相同类型的杂菌存在，也应该判断为杂菌。无菌试验期间应每六在，也应该判断为杂菌。无菌试验期间应每六小时观察一次无菌试验样品，以便
40、能及早发现小时观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。染菌。2022-6-2350杂菌染菌的途径和防治杂菌染菌的途径和防治1.1.种子带菌及其防治（种子带菌及其防治（5%10%5%10%）2.2.空气带菌及其防治（空气带菌及其防治（2030%2030%）3.3.设备的渗漏或死角造成的染菌及其防治设备的渗漏或死角造成的染菌及其防治（10%25%10%25%）4.4.培养基灭菌不彻底导致的染菌（培养基灭菌不彻底导致的染菌（2%5%2%5%）5.5.噬菌体及其防治噬菌体及其防治2022-6-23512022-6-23522022-6-2353噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治 对于利用细菌或放线
41、菌进行的发酵容易受噬菌对于利用细菌或放线菌进行的发酵容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。噬菌体是一种病毒，直径噬菌体是一种病毒，直径0.1m0.1m，可以通过环境，可以通过环境污染、设备的渗漏或死角、空气系统、培养基灭污染、设备的渗漏或死角、空气系统、培养基灭菌不彻底、补料过程及操作失误、菌种带进噬菌菌不彻底、补料过程及操作失误、菌种带进噬菌体或本身是病源性菌株等途径而染菌。体或本身是病源性菌株等途径而染菌。2022-6-2354以谷氨酸生产过程染上
42、了噬菌体为例：以谷氨酸生产过程染上了噬菌体为例： 初期初期ODOD值不上升或回降；值不上升或回降； pHpH值逐渐上升，可到值逐渐上升，可到8.08.0以上，且不再下降或以上，且不再下降或pHpH值稍下降，停滞在值稍下降，停滞在7.07.27.07.2之间，氨的利用之间，氨的利用停止；糖耗、升温缓慢或停止；产生大量泡沫，停止；糖耗、升温缓慢或停止；产生大量泡沫，有时使发酵液呈现粘胶状；谷氨酸的产量很少，有时使发酵液呈现粘胶状；谷氨酸的产量很少，增长缓慢或停止；增长缓慢或停止；镜检时发现了菌体数量显著镜检时发现了菌体数量显著减少，甚至找不到完整的菌体；减少，甚至找不到完整的菌体；排出的排出的CO
43、CO2 2量量异常，含量急剧下降。发酵周期延长。异常，含量急剧下降。发酵周期延长。噬菌体的分布和防治 噬菌体分布很广，在土壤、腐烂的有机物和噬菌体分布很广，在土壤、腐烂的有机物和空气中均有存在。噬菌体是专一性的活菌寄生空气中均有存在。噬菌体是专一性的活菌寄生体，脱离寄主菌体不能自行生长繁殖，由于作体，脱离寄主菌体不能自行生长繁殖，由于作为寄主的菌体大量存在，并且噬菌体对于干燥为寄主的菌体大量存在，并且噬菌体对于干燥有相当的抗性，同时噬菌体有时也能脱离菌体有相当的抗性，同时噬菌体有时也能脱离菌体在环境中长期存在。在实际生产中，常由于空在环境中长期存在。在实际生产中，常由于空气的传播，使噬菌体潜入
44、发酵的各个环节。气的传播，使噬菌体潜入发酵的各个环节。2022-6-2356至今最有效的防治噬菌体染菌的方法是净化环至今最有效的防治噬菌体染菌的方法是净化环境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、消灭污染源、改进提高空气的净化度、保证纯消灭污染源、改进提高空气的净化度、保证纯种培养、做到种子本身不带噬菌体、使用抗噬种培养、做到种子本身不带噬菌体、使用抗噬菌体的菌种、改进设备装置、消灭死角、药物菌体的菌种、改进设备装置、消灭死角、药物防治。防治。杂菌染菌的挽救或处理1.1.种子培养期染菌的处理种子培养期染菌的处理 该种子不能再接入到发酵罐中，应经灭菌后
45、弃该种子不能再接入到发酵罐中，应经灭菌后弃之采用备用的种子，选择生长正常无染菌的种之采用备用的种子，选择生长正常无染菌的种子接入发酵罐，继续生产。子接入发酵罐，继续生产。2022-6-23582. 2. 发酵前期染菌的处理发酵前期染菌的处理 如培养基中的碳氮含量比较高时，终止反如培养基中的碳氮含量比较高时，终止反应，将培养基加热至规定的温度，重新进行灭应，将培养基加热至规定的温度，重新进行灭菌处理，再接入种子进行反应。如此时染菌已菌处理，再接入种子进行反应。如此时染菌已造成较大的危害，培养基的碳氮源消耗量已比造成较大的危害，培养基的碳氮源消耗量已比较多，则可以放掉部分料液，补充新鲜培养基，较多
46、，则可以放掉部分料液，补充新鲜培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行生产。重新进行灭菌处理后，再接种进行生产。 3. 3.发酵中期后期染菌发酵中期后期染菌 如果轻微染菌，可以加入适当的杀菌剂或如果轻微染菌，可以加入适当的杀菌剂或抗生素，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降抗生素，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度，降低通风量，停止搅拌，少量补低培养温度，降低通风量，停止搅拌，少量补糖等措施进行处理。如发现产物的含量达一定糖等措施进行处理。如发现产物的含量达一定的值，只要明确是染菌也可放罐。对于没有提的值，只要明确是染菌也可放罐。对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至取价值的发酵液，废弃前应加热至120120以上，以上，灭菌灭菌30min30min后才能排放。后才能排放。2022-6-23604. 4. 染菌后对设备的处理染菌后对设备的处理 染菌后的发酵罐在重新使用前必须在放罐后染菌后的发酵罐在重新使用前必须在放罐后彻底清洗，空罐加热无菌后至彻底清洗，空罐加热无菌后至120 120 、灭菌、灭菌30min30min后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡液浸泡1212小时以上。小时以上。
