1、 Rapid magnetic isolation of extracellular vesicles via lipid-based nanoprobes 脂质纳米探针磁式快速分离外泌体脂质纳米探针磁式快速分离外泌体 NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING 10 APRIL 2017 | VOLUME: 1 | ARTICLE NUMBER: 0058Yuan Wan. 1Department of Biomedical Engineering, Micro and Nano Integrated Biosystem (MINIBio) Laboratory, The P
2、ennsylvania State University, University Park, Pennsylvania 16802, USA 方法血浆样品收集血浆样品收集. 健康人、晚期肺癌 真空采血管 K2-EDTA tubes (Becton Dickinson) 4 离心。先300 g5 min，然后16,500 g20 min， 收集血浆，0.22 m滤膜过滤，存于 80 备用。 细胞培养细胞培养 MDA-MB-231, SW620 and SK-N-BE(2). 支原体检测无污染 无酚红DMEM ，10% (v/v) FBS, 100 units ml1 penicillin and
3、 100 g ml1 streptomycin. nEVs模型样品制模型样品制备（该文把从细胞上清提取的外泌体称作备（该文把从细胞上清提取的外泌体称作模型样品）模型样品） MDA-MB-231 培养于9个T75 flasks (Falcon) 2-3天，达80%融合。然后培养于SFM (无血清培养基) ， 48 h。（无血清培养基） 收集培养液，300 g5 min；然后 16,500 g20 min；弃掉细胞渣。用0.22 m (pore size) 滤膜过滤。 共收集108 ml 培养液后，4，100,000 g2 h。 获得的nEV（纳米级外泌体）沉淀用200 l SFM重悬，400 l
4、 nEVs分装6份。 标准样品用于评价LNP分离 nEVs的效果，重复3次。 模型组样品用10 l DNase I (1 units / l; Life Technologies) 或5 g/ ml Rnase， 37 度2 h。上清存于 80备用。细胞摄取细胞摄取nEV实验实验 溶剂C配制nEVs 、再配PKH26染料。 用2 l PKH26 染料 (Sigma)混合上述nEV，孵育 5 min 4。再超离纯化。 细胞摄取：PKH26染料标记的 nEVs加于96孔板细胞中， 2 h 37度。 细胞用4% 多聚甲醛4固定10 min，然后用DAPI (1 g /ml)染色10 minRT。 O
5、lympus 显微镜40倍观察用细胞优化用细胞优化LNP（脂质纳米探针（脂质纳米探针） LP: FITC标记的C18PEG、DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、胆固醇PEG粉购于Nanocos公司。 FITC- PEGylated lipids 溶于无水乙醇，终浓度1 mM，存于 80。 每种LP 10nmol 加于 250 l 溶剂C。 107 细胞重悬于250 l 溶液C或5% 人白蛋白(PBS)中。 LP加入细胞悬液，轻柔混合5 min4 ， 500 g5 min 去掉多余LP，然后4% 多聚甲醛10 min固定 4度。 用1.5 ml PBS重悬细胞, DAPI 染色RT，PB
6、S洗3次， 500 l PBS重悬。 20 l细胞悬液加到玻璃盖片上，用于荧光显微镜观察。荧光强度用ImageJ 软件分析。捕获探针（捕获探针（CP）制备和特性）制备和特性. Fe3O4SiO2核心-外壳亚微米颗粒用改进的Stber solgel process。30 mg上述Fe3O4 亚微米颗粒用超声分散于混合液体中：160 ml 乙醇, 40 ml 水，10 ml 浓氨水 (28% w/w)。然后在超声状态下逐滴加正硅酸乙酯（Tetraethyl orthosilicate）0.3 ml , 然后搅拌3 h RT. 所得产物用磁场分离，去离子水、乙醇洗涤，60、12h干燥.。氨基活化MM
7、Ps（磁性亚微米颗粒）：250mg MMPs、250l 3-丙基三乙氧基甲硅烷胺（3-aminopropyltriethoxysilane），超声分散于30 ml 甲苯（toluene）中。该混合物在氮气环境下回流(加热?)12小时。收集产物，甲苯、乙醇洗涤，80度过夜晾干。颗粒形态用扫描电镜检测。傅里叶变换红外光谱用 Bruker Vertex V70 检测。5 mg氨基活化的MMPs，加入二甲基甲酰胺（含10%吡啶、1mM异硫氰酸苯酯isothiocyanate）2h。然后用二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水洗涤。氨基活化前后的MMPs界面电位（Zeta potential）用Zetasizer
8、 (Malvern)测定。去离子水溶625g NeutrAvidin蛋白(NA，Life Technologies) ，链接 异硫氰酸酯-MMPs37度、1h，然后1%BSA封闭，PBS洗3次。上述新制的NA-包被MMPs立即用于nEV提取。 用用LNP分离分离nEV. LP (生物素化的DSPEPEG) 粉末溶于无水乙醇，终浓度1 mM ，存于 20 度。 依据前述PKH26标记方法，用LP 标记nEV。 100 l nEV模型样品加入 1 ml 溶液C；LP (0.001, 0.01, 0.1, 1, 5 ,10 nmol) 加入另外1 ml 稀释液C；4度轻柔混合样品 5 min ，和1
9、012 CP (NA-MMPs) RT 30 min混合。磁铁分离后，CPs 用PBS洗3次，去掉非特异吸附到CPs上的分子。电镜检测nEV-CPs。 用 稀释液 C,分装1,10,50,100,200 nmol的LP为500l，加入100l血浆，混合5 min 4度，用CPs混合RT 10 min；另用100 l 血浆加入30 ml PBS 超离100,000 g4度，2 h，提取nEV。用生物素释放用生物素释放EVs. 准备DSPEPEGdesthiobiotin(Nanocs)无水乙醇液。【desthiobiotin：脱硫生物素】 按前述方法, 用DSPEPEG脱硫生物素标记nEVs，用
10、CPs捕获。多余未捕获的nEVs 用PBS洗掉。 准备20nmol生物素（PBS溶）用于替换 DSPE PEGdesthiobiotin，室温30 min加于捕获的nEV, 用加样器抽吸PBS洗涤CPs。 上清用于RNA 抽提，释放效率：上清RNA/捕获的总RNA nEVs特性：特性： 电镜方法电镜方法 划痕划痕实验：实验：3 105 MCF-7细胞接种到24孔板，第二天100%融合后枪头划痕，冲掉漂浮细胞。 8 108 MDA-MB-231 nEVs 加入孔内，连续3天观察划痕情况用用SYTO RNASelect 染色法估计染色法估计RNA含量含量 分装0, 5, 15, 25, 35,45
11、l模型nEV ，混合于5l 500 nM SYTO RNASelect 染液 (Life Technologies). 用PBS终体积定于50l，37，20 min。 绿色荧光用读板仪读取（490、530 nm） 其他组，用等量nEVs抽提RNA。 标准曲线 预热标准液(5 l) 加入50 l 样品，孵育20 min37。标记结束，测定荧光。ELISA样法测定样法测定nEV 膜蛋白膜蛋白 1011 nEVs 悬浮于100 l 无血清培养基，用5 nmol LP标记 nEVs 锚定到NA-包被玻璃板上（室温30min） stabilizing fixative (BD, Biosciences)
12、 固定10 min PBS洗 1%BSA 封闭30min FITC标记的CD9、CD326孵育过夜4 PBS洗，显微镜观察，ImageJ分析 核酸和蛋白抽提 PCR 测序 质谱 （略）结果和讨论 外泌体的作用，和肿瘤发生、转移、耐药关系 现有外泌体提取方法的弊端 本方法的原理：LNP=脂质纳米探针 用biotin-tagged 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphethanolamine-poly(ethylene glycol) (DSPEPEG)标记nEV。中文名，1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺-聚（乙二醇、甘醇） 标记的nEV再用NA-MMPs捕获 MMP
13、s英文名：magnetic sub-micrometre particles (MMPs) 和传统的离心法相比，分离时间降到15min，不需大型和昂贵设备，方法灵活能适用于各种下游实验（核酸、蛋白等）。Fig1 原理图原理放大图Fig1 下游检测流程图LNP的设计优化和特征分析 LNP=LP（标记探针）+CP（捕获探针） LP =脂质尾巴（用于插入nEV膜）+ PEG间隔 (约45环氧乙烷单位, 156 ，增加试剂溶解性) +生物素标签（用于分离nEV），如放大图所示。 比较FITC-PEG化的单酰脂(C18), 二酰脂 (DSPE)和胆固醇标记nEV效果。 Figure S1. 优化LP.
14、(a) MDA-MB-231细胞用FITC-聚乙二醇化的脂质 (DSPE, C18和胆固醇) 标记，溶剂为 Diluent C 或5% 人BSA. (b) 荧光定量分析Figure S2. MMPs的特征(a) The changes of zeta potential of MMPs after APTES and PDITC modification. (b) FTIR of APTES conjugated MMPs. MMPs Zreta势能为 32.0 mV 来自于silica shell。铵盐修饰后，吸收峰在2,920 cm1 and 2,852 cm1 （Fourier tran
15、sform infrared spectroscopy ）PDITC、 APTES：苯二异硫氰酸酯、氨基丙基三乙氧基甲硅烷超离的nEV 约30200 nm (Supplementary Fig. 3a), TEM为saucer-shaped 茶盘样 (Fig. 2b and Supplementary Fig. 3b) 、低温扫描电镜下为球形(cryo-SEM; Fig. 2c). Supplementary Fig. 3We also showed that nEVs labelled with DSPEPEGFITC can be effectively taken up and inte
16、rnalized by MDA-MB-231 cells (Supplementary Fig. 4). Supplementary Fig. 4LNP法捕获的培养细胞nEV 重悬于SFM, 即模型nEV样品每个样品含 1.4109 nEVs, (Malvern NanoSight 测定) (Fig. S5a) ,平均348.5 ng 总RNA、 189.4 ng DNA, Fig. S5b,c). Supplementary Fig. 5Figure 2 LNP形态分离方法优化形态分离方法优化ad, 电镜形态. 标尺100 nm. a, MMPs(mean 465nm). (b) TEM a
17、nd (c) cryo-SEM images showing the morphology of nEVs. d, Cryo-SEM image showing that LP-labelled nEVs (arrowheads) were captured on the surface of the CPs. eg, (e)Isolation efficiency for nEVs as a function of LP quantity, (f) incubation time of the LPs with model samples， and (g)incubation time of
18、 the LP-labelled nEVs and CPs 我们首先评价LP量对分离效果的影响，从1 pmol-10 nmol (捕获的nEV RNA：总nEVs RNA). 分离效果逐渐增加直到 77.6% (相当于10 nmol LP). 进一步增加LP量，分离效果不增加(Fig. 2e). 随后，用10 nmol LP、不同孵育时间，观察时间影响。尽管分离效果有少许增加(Fig. 2f), 但并无明显差别(P 0.05). 后面的实验，从可靠性和操作角度考虑，我们都用孵育5 min。这也是通常PKH26染膜时间; ref. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 1
19、738017385 (2013).g, 我们也发现CP的最长孵育时间可缩短为10min。综合起来分析，模型样品中80%的nEV可以用10nmol LP和足量CP结合和分离。h, 人血浆样品用LP分离nEV的效果. 当我们用DSPEPEGdesthiobiotin作为LP, NA-MMPs捕获MDA-MB-231 nEVs，可以用生物素替换DSPEPEGdesthiobiotin，因为生物素结合NA力量比desthiobiotin更强 843% nEVs可在30min内释放 (超离法nEV低温-TEM图和释放实验图见 Supplementary Fig. 6a,b).Figure S6. 释放的
20、释放的nEV形态和形态和迁移迁移 (a, b) Cryo-TEM images of nEVs harvested by ultracentrifugation(a) and released LP-labelled nEVs (b). (c) Wound healing assay of MCF-7 cells educated with released nEVs or uneducated. Migration was assessed at 24 h and 48 h time points after wounding, respectively. Scale bars 200 m.
21、(d) Quantification of wound closure showing that the nEVs induced more migration compared to the control (n = 34, * indicates p 0.998 (Supplementary Fig. 10d)。 最近有报道 FBS-derived miRNAs 干扰后续转录分析. 但我们在观察前14个FBS miRNAs时发现，它们在两种方法获得nEV miRNA分析中影响很小。 (Supplementary Table 1). 而且LNP分离的nEV，蛋白/RNA 比从12.1降到4.
22、9 (Supplementary Fig. 11a), 提示此方法尽管没有再次洗涤EV，但是蛋白含量降低了68.5%。 LNP分离法丢失22%的nEVs, 我们推测丢失的重量主要是污染的蛋白。 而超离法获得61.4% 的nEVs，再PBS纯化洗涤重悬，得率降到13.9% (Supplementary Fig. 11b).Figure S11. Protein and RNA measurement. (a) The quantity of protein and RNA obtained in nEVs before and after isolation with LNPs system,
23、respectively. (b) RNA amount collected from plasma using ultracentrifugation once and twice (n = 3). LCMS/MS进一步分析两法nEV蛋白情况(Supplementary Dataset 3). 我们把自己的质谱和最近报道的30个主要蛋白进行比较 (Supplementary Table 2). 蛋白种类相似. 另外，Vesiclepedia (www.vesiclepedia.org)数据库8,452 EV 蛋白中，有91% 和 94% 相符（Ultr、LNP）. 同样ref. 26 EV蛋
24、白也有94%的数据库符合率(Supplementary Fig. 12a). 同样，数据库前100中蛋白里，Ultr有76、LNP有89 个相符；文献26有96相符 (Supplementary Fig. 12b). 蛋白的细胞定位分析可见, ultr, LNP、ref. 26 分别有 51.8%, 64.7% and 57.2% 蛋白位于exosomes；34.2%, 39.7% and 47.6% 位于溶酶体(P 0.01; two-tailed t-test; Supplementary Fig. 12c). 最后，我们的结果证明vimentin, cytokeratin, EGFR,
25、乳癌干细胞标志CD44 出现在MDA-MB-231 nEVs, 这些是三阴乳腺癌的重要标志Figure S12. Comparative analyses of nEVs cargo proteins isolated by ultracentrifugation and LNP, respectively. (a and b) Venn diagram showing the overlap among our MDA-MB-231 nEV proteomic data from ultracentrifugation, LNP, proteomic data of small EVs de
26、rived from human dendritic cells in a published report (Ref) 2, and public EV database Vesiclepedia. (c) Gene ontology based functional enrichment analysis of proteins enriched by ultracentrifugation, LNP and in the Ref. (* indicated p 0.01, two-tailed t-test). Detection of mutated DNA in nEVs isolated from blood-plasma samples from NSCLC patients. 验证部分略
