1、免疫学诊断技术免疫学诊断技术分子生物学诊断技术分子生物学诊断技术寄生虫感染的免疫学及寄生虫感染的免疫学及分子生物学诊断技术分子生物学诊断技术免疫学诊免疫学诊断技术断技术环卵沉淀试验环卵沉淀试验基本原理基本原理常用方法常用方法方法评价方法评价适用范围适用范围免疫酶染色试验免疫酶染色试验染色试验染色试验环蚴沉淀试验环蚴沉淀试验间接血凝试验间接血凝试验间接荧光抗体试验间接荧光抗体试验常规常规ELISAELISA斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌A A蛋白蛋白ELISAELISA生物素生物素- -亲和素系统亲和素系统ELISAELISA酶标记抗原对流免疫电泳酶标记抗原
2、对流免疫电泳酶联免疫印迹技术酶联免疫印迹技术酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验寄生虫感染的免疫学及寄生虫感染的免疫学及分子生物学诊断技术分子生物学诊断技术n免疫学诊断技术n现有的多种免疫学检测技术均现有的多种免疫学检测技术均已被应用于寄生虫病的临床诊已被应用于寄生虫病的临床诊断或流行病学研究。本章仅介断或流行病学研究。本章仅介绍几种寄生虫病诊断特有的免绍几种寄生虫病诊断特有的免疫检测技术疫检测技术环卵沉淀试验环卵沉淀试验n环卵沉淀试验环卵沉淀试验(circumoval (circumoval Precipitin test,COPTPrecipitin test,COPT) )由由OliverO
3、liverGonzalez(1954)Gonzalez(1954)最早用于曼氏血吸虫最早用于曼氏血吸虫病的诊断病的诊断, ,获得了较好的结果获得了较好的结果, ,阳性率阳性率达达100100, ,假阳性率为假阳性率为8.38.3。 n国内亦于国内亦于19581958年开始应用该法诊断日年开始应用该法诊断日本血吸虫病本血吸虫病, ,取得了满意效果。目前取得了满意效果。目前COPTCOPT仍是国内诊断血吸虫病最常用的仍是国内诊断血吸虫病最常用的方法之一方法之一n基本原理基本原理: :环卵沉淀试验为抗原机环卵沉淀试验为抗原机体反应的一种类型体反应的一种类型, ,属免疫沉淀反属免疫沉淀反应。当成熟血吸
4、虫卵内毛蚴的分泌、应。当成熟血吸虫卵内毛蚴的分泌、排泄物抗原经卵壳微孔透出壳外与排泄物抗原经卵壳微孔透出壳外与血吸虫病患者血清中相应抗体结合血吸虫病患者血清中相应抗体结合后后, ,在虫卵周围形成具有一定折光在虫卵周围形成具有一定折光性的特异性的泡状、指状、带状或性的特异性的泡状、指状、带状或片状沉淀物片状沉淀物, ,即为阳性反应即为阳性反应环卵沉淀试验环卵沉淀试验基本原理基本原理n免疫沉淀物的形成取决于虫卵内分免疫沉淀物的形成取决于虫卵内分泌、排出物透过卵壳微孔的量泌、排出物透过卵壳微孔的量,以以及血吸虫病人血清中特异性抗体水及血吸虫病人血清中特异性抗体水平。在正常人血清中平。在正常人血清中,
5、因无相应的因无相应的抗体存在抗体存在,故虫卵周围不出现特异故虫卵周围不出现特异性沉淀物性沉淀物,即为阴性即为阴性环卵沉淀试验基本原理环卵沉淀试验基本原理n常规常规COPTCOPT需用熔化的石蜡划蜡线、密封盖片需用熔化的石蜡划蜡线、密封盖片, ,操作步骤繁琐操作步骤繁琐, ,不易于标准化不易于标准化, ,因此现有了许因此现有了许多改进方法多改进方法, ,例如例如: :n 塑料管法塑料管法COPT:COPT:是应用聚乙烯塑料管是应用聚乙烯塑料管(2mm)(2mm)采集血样采集血样, ,分离血清分离血清, ,并在管内加入干卵孵育。并在管内加入干卵孵育。该法操作简单、适于现场应用该法操作简单、适于现场
6、应用, ,但在大规模但在大规模查病时难于达到标准化和操作规范化的要求。查病时难于达到标准化和操作规范化的要求。本法也具有很高的敏感性和特异性本法也具有很高的敏感性和特异性环卵沉淀试验常用方法环卵沉淀试验常用方法双面胶纸条法环卵沉淀试验双面胶纸条法环卵沉淀试验(DGS(DGSCOPT)COPT)n是将双面胶纸条制成特定的式样作是将双面胶纸条制成特定的式样作COPT,COPT,省却常规法划蜡线、蜡封片等繁省却常规法划蜡线、蜡封片等繁琐步骤琐步骤, ,操作简单较规范操作简单较规范, ,适于现场及适于现场及临床使用。但该法仍需实验者临时加临床使用。但该法仍需实验者临时加入虫卵，使其难于达到标准化入虫卵
7、，使其难于达到标准化nPVFPVF抗原片法抗原片法: :以以PVFPVF膜为载体膜为载体, ,将于卵用将于卵用5 5棉胶液粘附剂预置其上棉胶液粘附剂预置其上, ,试验时加入待检者试验时加入待检者血清即可血清即可, ,操作方法极其简便易行操作方法极其简便易行, ,且抗原且抗原片便于携带、邮寄、还可保存实验结果。片便于携带、邮寄、还可保存实验结果。由固定的实验人员统一滴加虫卵由固定的实验人员统一滴加虫卵, ,使卵数较使卵数较一致一致, ,易达标准化易达标准化, ,适于现场应用。适于现场应用。n血凝板法血凝板法: :将血清及干卵加入血凝板孔中省将血清及干卵加入血凝板孔中省却了划蜡线的步骤。却了划蜡线
8、的步骤。 PVFPVF抗原片法及血凝板法抗原片法及血凝板法环卵沉淀试验环卵沉淀试验组织内环卵沉淀反应组织内环卵沉淀反应n又称卵内沉淀反应又称卵内沉淀反应(Intraoval (Intraoval precipitin reaction,IOPprecipitin reaction,IOP),),是以血吸是以血吸虫病鼠肝组织制成的石蜡切片为抗原虫病鼠肝组织制成的石蜡切片为抗原与受检者血清作用后与受检者血清作用后, ,如在虫卵内、卵如在虫卵内、卵黄膜与毛蚴之间或在毛蚴的表面出现黄膜与毛蚴之间或在毛蚴的表面出现泡状、指状或条带状有明显折光性的泡状、指状或条带状有明显折光性的沉淀物即为阳性沉淀物即为阳
9、性, ,其敏感性和特异性同其敏感性和特异性同常规法常规法COPTCOPT试验无显著性差异试验无显著性差异n是环卵沉淀反应结合酶免疫测定技术的一是环卵沉淀反应结合酶免疫测定技术的一种改进方法种改进方法, ,其基本原理是先在酶标反应板其基本原理是先在酶标反应板中进行环卵沉淀试验中进行环卵沉淀试验, ,洗去待检血清后加入洗去待检血清后加入酶标记的羊抗人酶标记的羊抗人IgGIgG孵育孵育, ,经洗涤后加入联经洗涤后加入联苯胺底物显色。如虫卵周围及虫卵内有棕苯胺底物显色。如虫卵周围及虫卵内有棕色沉淀物即为阳性色沉淀物即为阳性, ,反之则为阴性。该法具反之则为阴性。该法具有高度的敏感性有高度的敏感性, ,
10、特异性可达特异性可达100100, ,平均环平均环沉率显著高于常规沉率显著高于常规COPTCOPT试验法试验法, ,且总试验时且总试验时间可缩短间可缩短2424小时出结果小时出结果酶联环卵沉淀反应酶联环卵沉淀反应(enzyme(enzymelinked COPT,FLCOPT)linked COPT,FLCOPT)环卵沉淀试验环卵沉淀试验方法评价方法评价nCOPTCOPT为血吸虫病所特有的免疫学诊断方法为血吸虫病所特有的免疫学诊断方法, ,具有较高的敏感性具有较高的敏感性(94.1(94.198.698.6) )和特和特异性异性(1.9(1.93.63.6) )。主要用于：。主要用于：n作为血
11、吸虫病的辅助诊断及病原治疗的作为血吸虫病的辅助诊断及病原治疗的依据依据, ,对无血吸虫病史人群和距末次治疗对无血吸虫病史人群和距末次治疗3 3年以上的血吸虫病病人年以上的血吸虫病病人, ,若环沉率在若环沉率在3 3或或3 3以上者以上者, ,可结合临床表现给予治疗可结合临床表现给予治疗, ,目前目前多将此治疗标准降至多将此治疗标准降至1 1的环沉率的环沉率n作为血吸虫病血清流行病学调查及疫情监测的作为血吸虫病血清流行病学调查及疫情监测的方法方法, ,在血吸虫病流行区在血吸虫病流行区,COPT,COPT环沉率的消长情况环沉率的消长情况, ,能反映感染人群血清特异性抗体水平的动态变化能反映感染人群
12、血清特异性抗体水平的动态变化, ,用以了解疫情趋势用以了解疫情趋势, ,特别在达到传播控制和传播特别在达到传播控制和传播阴转标准的监测地区阴转标准的监测地区, ,可用作监测的方法之一可用作监测的方法之一n考核防治效果考核防治效果, ,经有效药物经有效药物( (吡喹酮吡喹酮) )治疗后治疗后1 1年年病人病人COPTCOPT阴转率达阴转率达 27.127.1, ,治后治后2 2年阴转率年阴转率4040以上以上, ,治后治后4 4年病人血清年病人血清COPTCOPT的阴转率的阴转率8080以上以上n适用范围适用范围 加吸虫病的辅助诊断、疗效考核、流加吸虫病的辅助诊断、疗效考核、流行病学调查及疫情监
13、测行病学调查及疫情监测环卵沉淀试验方法评价环卵沉淀试验方法评价n免疫酶技术主要是利用免疫反应的高度特异免疫酶技术主要是利用免疫反应的高度特异性和酶促反应高效性的特点性和酶促反应高效性的特点, ,在保持抗原抗在保持抗原抗体免疫活性和酶的催化活性的基础上体免疫活性和酶的催化活性的基础上, ,将酶将酶标记于抗原或抗体之上标记于抗原或抗体之上, ,使特异性免疫反应使特异性免疫反应同酶促反应相结合同酶促反应相结合, ,从而使测定方法达到高从而使测定方法达到高度特异性和敏感性。免疫酶染色试验度特异性和敏感性。免疫酶染色试验(immunoenzvmaticstaining test,IEST(immunoe
14、nzvmaticstaining test,IEST) )是是免疫酶检测技术的一种。免疫酶检测技术的一种。KamiyaKamiya等等 (1981)(1981)最早以组织内虫卵石蜡切片为抗原作最早以组织内虫卵石蜡切片为抗原作IESTIEST试试验诊断日本血吸虫病验诊断日本血吸虫病, ,国内首先用微丝蚴固国内首先用微丝蚴固相抗原作相抗原作IESTIEST诊断丝虫病均取得满意结果诊断丝虫病均取得满意结果免疫酶染色试验免疫酶染色试验nIESTIEST是以寄生虫各个生活史时期是以寄生虫各个生活史时期( (如成虫、如成虫、幼虫、虫卵或原虫滋养体等幼虫、虫卵或原虫滋养体等) )制成的切片或制成的切片或涂片
15、作为固相抗原涂片作为固相抗原, ,与待测标本中相应抗体与待测标本中相应抗体特异性结合后特异性结合后, ,再与酶再与酶( (辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP)HRP)标记的第二抗体反应形成酶标记的免疫复合标记的第二抗体反应形成酶标记的免疫复合物物, ,加入相应底物加入相应底物( (二氨基联苯胺二氨基联苯胺,DAB),DAB)后酶后酶催化底物即出现显色反应催化底物即出现显色反应, ,用光学显微镜观用光学显微镜观察即可判断结果。如无特异性抗体即不能形察即可判断结果。如无特异性抗体即不能形成酶标记免疫复合物成酶标记免疫复合物, ,加入底物后加入底物后, ,因无酶的因无酶的催化作用催化作用, ,而不能
16、产生颜色反应而不能产生颜色反应, ,则为阴性则为阴性免疫酶染色试验免疫酶染色试验基本原理基本原理nIESTIEST用于诊断日本血吸虫病时用于诊断日本血吸虫病时, ,以肝组织内虫卵以肝组织内虫卵肉芽肿切片作固相抗原的诊断效果优于成虫切片肉芽肿切片作固相抗原的诊断效果优于成虫切片抗原抗原, ,而虫卵切片抗原则以冰冻切片抗原优于石而虫卵切片抗原则以冰冻切片抗原优于石蜡切片抗原蜡切片抗原n以肝组织虫卵冰冻切片作以肝组织虫卵冰冻切片作IESTIEST四次对比检测血吸四次对比检测血吸虫病人的阳性符合率达虫病人的阳性符合率达 87.387.3-99-99, ,假阳性率假阳性率1.31.3-5.2-5.2,
17、,仅同姜片虫病和肺吸虫病各有仅同姜片虫病和肺吸虫病各有4 4的交叉反应的交叉反应, ,病人治愈后病人治愈后3-103-10年的阴转率达年的阴转率达70.870.8-93.7-93.7n表明该法诊断血吸虫病具有较高的敏感性、特异表明该法诊断血吸虫病具有较高的敏感性、特异性和重现性性和重现性, ,并有一定的疗效考核价值并有一定的疗效考核价值免疫酶染色试验免疫酶染色试验方法评价方法评价n以马来丝虫成虫冰冻切片作以马来丝虫成虫冰冻切片作IESTIEST检测班氏微检测班氏微丝蚴血症者阳性率达丝蚴血症者阳性率达91.291.294.394.3, ,健康健康人假阳性率为人假阳性率为2.62.64.44.4,
18、 ,且可用牛腹腔且可用牛腹腔丝虫成虫切片抗原代替人丝虫作丝虫成虫切片抗原代替人丝虫作IESTIEST亦取得亦取得相似的诊断效果相似的诊断效果n以华枝睾吸虫成虫切片抗原作以华枝睾吸虫成虫切片抗原作IESTIEST诊断华支诊断华支睾吸虫病亦具有较高的敏感性和特异性睾吸虫病亦具有较高的敏感性和特异性nIESTIEST用于寄生虫病的诊断具有敏感性高、特用于寄生虫病的诊断具有敏感性高、特异性强、重现性及稳定性好的特点异性强、重现性及稳定性好的特点, ,且该法且该法抗原用量少、简便易行抗原用量少、简便易行, ,抗原片置抗原片置2020以以下可长期保存下可长期保存, ,光学显微镜观察结果光学显微镜观察结果免
19、疫酶染色试验免疫酶染色试验方法评价方法评价n结果判定不必立即进行结果判定不必立即进行, ,可保存集中检查可保存集中检查, ,并可保留结果以利复查。但该法所用抗并可保留结果以利复查。但该法所用抗原及操作方法尚需标准化。在实际应用原及操作方法尚需标准化。在实际应用中中, ,冰冻切片抗原优于石蜡切片冰冻切片抗原优于石蜡切片, ,但需注但需注意冰冻切片在试验洗涤过程中易于脱片意冰冻切片在试验洗涤过程中易于脱片等问题等问题n适用范围适用范围: :用于血吸虫病、丝虫病、肝吸用于血吸虫病、丝虫病、肝吸虫病、猪囊尾蚴病、肺吸虫病、旋毛虫虫病、猪囊尾蚴病、肺吸虫病、旋毛虫病、弓形虫病等的实验室诊断及流行病病、弓
20、形虫病等的实验室诊断及流行病学调查学调查免疫酶染色试验免疫酶染色试验方法评价方法评价染色试验染色试验n染色试验染色试验(dye test,DT(dye test,DT) )由由SabinSabin和和 Feldman(1948Feldman(1948年年) )创用创用, ,为弓形虫病独特的为弓形虫病独特的免疫学诊断方法免疫学诊断方法n基本原理基本原理: :新鲜活弓形虫滋养体胞质对碱性新鲜活弓形虫滋养体胞质对碱性美蓝染剂具有很强的亲和力美蓝染剂具有很强的亲和力, ,能被其染成蓝能被其染成蓝色。但当弓形虫受特异性抗体和辅助因子色。但当弓形虫受特异性抗体和辅助因子(accessory factor,
21、AF(accessory factor,AF) )协同作用后协同作用后, ,细胞变细胞变性。胞膜破裂、胞质外溢性。胞膜破裂、胞质外溢, ,虫体则不能着色。虫体则不能着色。AFAF为正常人血清成份为正常人血清成份, ,其中含有补体、备解其中含有补体、备解素和素和Mg2Mg2等等nAFAF不耐热不耐热, ,故应在采血后立即分离血清故应在采血后立即分离血清进行筛选进行筛选, ,2020保存备用保存备用, ,将经将经56560 0C30minC30min灭活的待检血清同滋养体及灭活的待检血清同滋养体及辅助因子作用后加碱性美蓝染液染色辅助因子作用后加碱性美蓝染液染色后后, ,如有如有5050或以上虫体不
22、着色者或以上虫体不着色者, ,即即可判为阳性。可使可判为阳性。可使5050虫体不着色的虫体不着色的血清稀释度即为血清阳性液度血清稀释度即为血清阳性液度染色试验原理染色试验原理n该法敏感性高、特异性强该法敏感性高、特异性强, ,具有早期诊断价值具有早期诊断价值, ,一一般在感染弓形虫后般在感染弓形虫后8 81010天天, ,人血清中即出现抗弓人血清中即出现抗弓形虫膜抗原的抗体形虫膜抗原的抗体,DT,DT试验即出现阳性反应试验即出现阳性反应n血清阳性滴度血清阳性滴度1:81:8判为隐性感染判为隐性感染,1:256,1:256的为活动性的为活动性感染感染,1:1024,1:1024为急性感染为急性感
23、染nDTDT试验除肉孢子虫外与其它寄生虫无交叉反应。试验除肉孢子虫外与其它寄生虫无交叉反应。但该法所用辅助因子需从健康人血清中分离但该法所用辅助因子需从健康人血清中分离, ,并进并进行筛选试验行筛选试验, ,符合要求方可使用符合要求方可使用, ,且效能难于一致且效能难于一致n新鲜活虫体作抗原有一定的实验室感染危险性新鲜活虫体作抗原有一定的实验室感染危险性, ,故故限制了该法的推广及一般实验室和现场应用限制了该法的推广及一般实验室和现场应用 n适用范围适用范围: :弓形虫病的辅助诊断弓形虫病的辅助诊断染色试验方法评价染色试验方法评价n环蚴沉淀试验环蚴沉淀试验(circumlarval (circ
24、umlarval precipitin test,CPTprecipitin test,CPT) )为旋毛虫病特为旋毛虫病特有的血清学试验。将分离的旋毛虫幼有的血清学试验。将分离的旋毛虫幼虫与旋毛虫病患者血清在体外共同孵虫与旋毛虫病患者血清在体外共同孵育后育后, ,幼虫分泌、排泄物幼虫分泌、排泄物( (即抗原即抗原) )与与特异性抗体结合特异性抗体结合, ,在幼虫体表在幼虫体表, ,特别是特别是口及肛门部出现具有折光性的团块状口及肛门部出现具有折光性的团块状或泡状沉淀物或泡状沉淀物, ,即为阳性即为阳性环蚴沉淀试验环蚴沉淀试验n本法具有较高的敏感性和特异性本法具有较高的敏感性和特异性, ,同旋
25、毛虫同旋毛虫病人的阳性符合率达病人的阳性符合率达 97.697.6100100, ,特异特异性达性达100100-与蛔虫病、钩虫病、丝虫病、鞭虫病等无交叉与蛔虫病、钩虫病、丝虫病、鞭虫病等无交叉反应。感染后反应。感染后3 3周或症状出现后周或症状出现后10102020天呈阳性天呈阳性反应反应-由于该法活幼虫抗原材料分离较繁琐由于该法活幼虫抗原材料分离较繁琐, ,供应及保供应及保存都有困难存都有困难, ,且实验者有感染的危险且实验者有感染的危险, ,故限制了故限制了它的推广应用它的推广应用-用冻干幼虫和干燥幼虫进行实验用冻干幼虫和干燥幼虫进行实验, ,效果满意效果满意, ,该该法操作简单法操作简
26、单, ,无需特殊仪器设备无需特殊仪器设备, ,适于基层应用适于基层应用n适用范围适用范围: :用于旋毛虫病的辅助诊断用于旋毛虫病的辅助诊断环蚴沉淀试验方法评价环蚴沉淀试验方法评价n间接红细胞凝集试验(indirect haema-gglutination test，IHA)简称间接血凝试验,本试验操作简便快速、器材简单、具有较高的敏感性和一定的特异性。国外普遍用于流行病学调查和实验室常规检查。主要的局限性在于抗原致敏血细胞的批间差异悬殊,以致结果不稳定,重复性欠佳n近年来由于抗原纯化技术和冰冻干燥技术等的发展,在致敏血细胞的制备和保存方面有了新的进展,冻干的致敏血细胞逐步向商品化方向发展,不仅
27、方便现场使用并为血凝试验的标准化提供了条件间接血凝试验间接血凝试验基本原理基本原理n以人以人O O型红细胞或绵羊红细胞为载体型红细胞或绵羊红细胞为载体, ,经特殊处理后吸附上特异性抗原经特殊处理后吸附上特异性抗原, ,此结此结合有抗原的红细胞叫做致敏红细胞合有抗原的红细胞叫做致敏红细胞, ,在在遇到相应的抗体后发生特异性结合遇到相应的抗体后发生特异性结合, ,致致使红细胞发生交联而凝集成肉眼可见使红细胞发生交联而凝集成肉眼可见的团块的团块, ,即为阳性即为阳性n无特异性抗体存在则红细胞不发生凝无特异性抗体存在则红细胞不发生凝集而均匀地沉积于板底，是为阴性集而均匀地沉积于板底，是为阴性n将特异性
28、抗体吸附于红细胞表面将特异性抗体吸附于红细胞表面, ,制备致敏制备致敏红细胞来检测特异性抗原则称之为反向间接红细胞来检测特异性抗原则称之为反向间接血凝试验血凝试验(reverse indirect (reverse indirect haemagglutinationhaemagglutination test) test)n用已知抗原或抗体预先与待测标本作用用已知抗原或抗体预先与待测标本作用, ,以以中和相应的抗体或抗原中和相应的抗体或抗原, ,再加入相应的致敏再加入相应的致敏红细胞红细胞, ,由于与致敏红细胞相应的抗原或抗由于与致敏红细胞相应的抗原或抗体已被中和体已被中和, ,无法交联以致
29、红细胞不能发生无法交联以致红细胞不能发生凝集凝集, ,即为阳性即为阳性, ,此称为间接血凝抑制试验此称为间接血凝抑制试验(indirect haemagglutination(indirect haemagglutination inhibition inhibition test) test) 间接血凝试验基本原理间接血凝试验基本原理n间接血凝试验方法简单间接血凝试验方法简单, ,取材方便取材方便, ,以红细以红细胞为载体胞为载体, ,大小均匀大小均匀, ,性能稳定性能稳定, ,可用人的可用人的“O”O”型红细胞或绵羊红细胞型红细胞或绵羊红细胞, ,红色起到指红色起到指示剂作用示剂作用, ,
30、便于肉眼观察。肉眼判断结果便于肉眼观察。肉眼判断结果, ,不需特殊仪器设备不需特殊仪器设备, ,且具有较高的敏感性和且具有较高的敏感性和特异性特异性n诊断日本血吸虫病诊断日本血吸虫病, ,阳性率达阳性率达929298.798.7, ,非疫区正常人群的假阳性率非疫区正常人群的假阳性率0 02.52.5n肝吸虫病检测阳性符合率达肝吸虫病检测阳性符合率达68689898n猪囊尾蚴病的诊断猪囊尾蚴病的诊断, ,阳性率为阳性率为89.689.69090, ,假阳性率假阳性率1.51.51010间接血凝试验间接血凝试验方法评价方法评价n对于弓形虫病的诊断与染色试验的阳性符合对于弓形虫病的诊断与染色试验的阳
31、性符合率为率为9090左右左右; ;对疟疾的诊断效果不够稳定对疟疾的诊断效果不够稳定, ,原因之一是没有好的纯化的抗原。本法用于原因之一是没有好的纯化的抗原。本法用于寄生虫病的普查过筛及流行病学调查寄生虫病的普查过筛及流行病学调查, ,是一种是一种极为简便、快速、实用的有效方法。不足之极为简便、快速、实用的有效方法。不足之处是有发生非特异性凝集的现象处是有发生非特异性凝集的现象, ,应注意鉴别应注意鉴别和消除和消除n适用范围适用范围n用于血吸虫病、弓形虫病、利什曼原虫病、钩虫用于血吸虫病、弓形虫病、利什曼原虫病、钩虫病、棘球蚴病、旋毛虫病、肺吸虫病、阿米巴病、病、棘球蚴病、旋毛虫病、肺吸虫病、
32、阿米巴病、疟疾的免疫学辅助诊断和流行病学调查疟疾的免疫学辅助诊断和流行病学调查间接血凝试验方法评价间接血凝试验方法评价间接荧光抗体试验间接荧光抗体试验n间接荧光抗体试验间接荧光抗体试验(indirect fluorescent (indirect fluorescent antibody testantibody test，IFA)IFA)是一种实用的免疫标是一种实用的免疫标记技术之一记技术之一, ,它具有免疫学反应的特异性与它具有免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性荧光技术的敏感性n基本原理基本原理 将荧光素如异硫氰酸荧光黄将荧光素如异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiacy
33、anate,FITC(fluorescein isothiacyanate,FITC) )与抗与抗免疫球蛋白抗体免疫球蛋白抗体( (如羊抗人如羊抗人IgGIgG) )结合制成荧结合制成荧光素标记第二抗体。当固相抗原与待测血清光素标记第二抗体。当固相抗原与待测血清中的抗体特异结合后中的抗体特异结合后, ,再用该荧光素标记的再用该荧光素标记的第二抗体与之共同孵育第二抗体与之共同孵育, ,便可形成免疫荧光便可形成免疫荧光复合物复合物, ,在荧光显微镜下可见黄绿色荧光在荧光显微镜下可见黄绿色荧光, ,即即为阳性。若无黄绿色荧光现象即为阴性为阳性。若无黄绿色荧光现象即为阴性nIFAIFA操作简便操作简便
34、, ,具有高度的特异性、敏感性和重具有高度的特异性、敏感性和重现性现性, ,可直接在细胞水平或亚细胞水平上检测、可直接在细胞水平或亚细胞水平上检测、鉴定和定位抗原、抗体或免疫复合物、因而其鉴定和定位抗原、抗体或免疫复合物、因而其应用极广应用极广, ,不仅用于疾病的免疫诊断不仅用于疾病的免疫诊断, ,还用于组还用于组织细胞内特异性抗原的检查与定位织细胞内特异性抗原的检查与定位, ,以及分子生以及分子生物学研究中基因表达产物的检测和鉴定物学研究中基因表达产物的检测和鉴定n是诊断疟疾最常用的方法是诊断疟疾最常用的方法, ,敏感性高、特异性强敏感性高、特异性强, ,重现性好重现性好, ,抗原制备简便抗
35、原制备简便, ,全虫抗原性能稳定全虫抗原性能稳定n以裂殖体的抗原性最好以裂殖体的抗原性最好, ,大滋养体次之大滋养体次之, ,小滋养小滋养体最差。抗原片固定剂以多聚甲醛及福尔马林体最差。抗原片固定剂以多聚甲醛及福尔马林固定效果最好固定效果最好, ,荧光强度最大荧光强度最大, ,丙酮及自然干燥丙酮及自然干燥次之次之, ,甲醇固定效果最差甲醇固定效果最差间接荧光抗体试验间接荧光抗体试验方法评价方法评价n疟疾病人的阳性符合率达疟疾病人的阳性符合率达9090以上以上, ,正常人假阳性正常人假阳性率为率为l l2 2, ,疟疾病人经治疗后疟疾病人经治疗后3 36 6个月个月IFAIFA检测检测滴度迅速下
36、降滴度迅速下降,1,1年后阴转年后阴转, ,固有疗效考核价值固有疗效考核价值n弓形虫滋养体弓形虫滋养体( (速殖子速殖子) )为抗原片作为抗原片作IFAIFA诊断弓形虫诊断弓形虫病的效果与染色试验相似病的效果与染色试验相似, ,敏感性低于敏感性低于ELISAELISA和和IESTIEST法法n杜氏利什曼原虫杜氏利什曼原虫前鞭毛体作抗原进行前鞭毛体作抗原进行IFAIFA检测黑热检测黑热病患者血清抗体病患者血清抗体, ,阳性率达阳性率达100100, ,抗体滴度最低为抗体滴度最低为1:320,1:320,最高可达最高可达1:5120,1:5120,其它疾病和健康人的血清其它疾病和健康人的血清滴度很
37、少超过滴度很少超过1:20,1:20,但病人治愈后抗体的阴转率很但病人治愈后抗体的阴转率很低低, ,治愈治愈2020年后的抗体阳性率仍高达年后的抗体阳性率仍高达28.928.9, ,对黑热对黑热病无疗效考核价值病无疗效考核价值间接荧光抗体试验方法评价间接荧光抗体试验方法评价n阿米巴肝脓肿阿米巴肝脓肿: :阳性检出率达阳性检出率达9595100100, ,而对而对肠阿米巴病的检出率悬殊很大肠阿米巴病的检出率悬殊很大, ,从从5050到到9090不不等等, ,不宜作肠阿米巴病的辅助诊断不宜作肠阿米巴病的辅助诊断n血吸虫病的诊断血吸虫病的诊断:IFAT:IFAT的敏感性与的敏感性与ELISAELIS
38、A、IESTIEST等等相仿相仿, ,但高于但高于COPTCOPT法。本法的不足之处是需要荧法。本法的不足之处是需要荧光显微镜光显微镜, ,结果判断带有一定的主观性结果判断带有一定的主观性, ,且有非特且有非特异性荧光干扰异性荧光干扰, ,并有荧光衰减现象并有荧光衰减现象, ,结果不能久存结果不能久存, ,实验完毕必需立刻镜检实验完毕必需立刻镜检n适用范围适用范围: :用于疟疾、弓形虫病、利什曼原虫病、用于疟疾、弓形虫病、利什曼原虫病、卡氏肺孢子虫肺炎、蓝氏贾第鞭毛虫病、细粒棘卡氏肺孢子虫肺炎、蓝氏贾第鞭毛虫病、细粒棘球蚴病、丝虫病、华支睾吸虫病及血吸虫病的免球蚴病、丝虫病、华支睾吸虫病及血吸
39、虫病的免疫学诊断疫学诊断间接荧光抗体试验方法评价间接荧光抗体试验方法评价酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验n酶联免疫吸附试验是一种免疫标记测定技酶联免疫吸附试验是一种免疫标记测定技术。系术。系19711971年创用，最初把抗体或抗原吸年创用，最初把抗体或抗原吸附于聚苯乙烯管壁上制成固相免疫吸附剂，附于聚苯乙烯管壁上制成固相免疫吸附剂，用以测定抗原或抗体，为用以测定抗原或抗体，为ELISAELISA奠定了基础，奠定了基础，后用塑料微孔板使后用塑料微孔板使ELISAELISA技术迅速得到推广技术迅速得到推广和应用。此项技术具有高度的敏感性和特和应用。此项技术具有高度的敏感性和特异性，目前已广泛用于细
40、菌学、病毒学、异性，目前已广泛用于细菌学、病毒学、寄生虫学、内分泌学、免疫病理学、血液寄生虫学、内分泌学、免疫病理学、血液学以及分子生物学和细胞生物学等领域，学以及分子生物学和细胞生物学等领域，并已涌现出了许多改进的、派生的及综合并已涌现出了许多改进的、派生的及综合的技术方法。的技术方法。 n根据酶具有强大的催化活性和高度特异的特根据酶具有强大的催化活性和高度特异的特点点, ,在不破坏酶活性和抗原抗体免疫学特性在不破坏酶活性和抗原抗体免疫学特性的前提下的前提下, ,通过化学交联或免疫学方法通过化学交联或免疫学方法, ,将酶将酶分子联结到抗体或抗原分子上分子联结到抗体或抗原分子上, ,然后与特异
41、然后与特异性抗原或抗体反应性抗原或抗体反应, ,形成酶标记免疫复合物形成酶标记免疫复合物n结合在免疫复合物上的酶在遇到其相应的底结合在免疫复合物上的酶在遇到其相应的底物时物时, ,催化其水解催化其水解, ,产生氧化还原反应产生氧化还原反应, ,生成生成肉眼可见的颜色变化肉眼可见的颜色变化, ,用微量比色计检测结用微量比色计检测结果果, ,或目视方法比较判断。由于酶降解底物或目视方法比较判断。由于酶降解底物的量与其呈现的色泽浓度成正比的量与其呈现的色泽浓度成正比, ,故可间接故可间接反映被测抗原或抗体的量。因此反映被测抗原或抗体的量。因此,ELISA,ELISA可以可以定性定性, ,还可定量检测
42、抗原或抗体。还可定量检测抗原或抗体。ELISAELISA的基的基本反应类型有三种本反应类型有三种酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验常规常规ELISAELISA基本原理基本原理n间接法间接法- -包被抗原包被抗原+ +待测抗体待测抗体+ +酶标记抗球蛋白抗体酶标记抗球蛋白抗体, ,底物显色底物显色, ,即即AgAgAbAbAb2Ab2酶酶+ +底物底物, ,检测抗体检测抗体n夹心法夹心法- -包被单克隆抗体包被单克隆抗体(McAb(McAb)+)+待测抗原待测抗原(Ag)+(Ag)+特特异性抗体异性抗体(Ab1)+(Ab1)+酶标抗球蛋白抗体酶标抗球蛋白抗体(Ab(Ab- -酶酶),),双抗体双抗
43、体捕获抗原检测抗原法捕获抗原检测抗原法n竞争抑制法竞争抑制法- -小分子抗原或半抗原检测小分子抗原或半抗原检测, ,将特异性抗将特异性抗体吸附于酶标板上体吸附于酶标板上, ,酶标记抗原与待测抗原混合后酶标记抗原与待测抗原混合后再加入反应板中孵育再加入反应板中孵育, ,经洗涤加入底物进行显色反经洗涤加入底物进行显色反应。待测抗原与酶标记抗原以均等的机会竞争结合应。待测抗原与酶标记抗原以均等的机会竞争结合固相抗体。因此固相抗体。因此, ,显色深浅与结合到固相抗体上的显色深浅与结合到固相抗体上的酶标记抗原量成正比酶标记抗原量成正比, ,则与待测抗原的量成反比。则与待测抗原的量成反比。同样同样, ,也
44、可包被抗原也可包被抗原, ,将酶标抗体与待测抗原同时加将酶标抗体与待测抗原同时加到酶标反应中到酶标反应中, ,固相抗原同待测抗原竟争结合酶标固相抗原同待测抗原竟争结合酶标抗体抗体, ,经洗涤后经洗涤后, ,待测抗原待测抗原- -酶标抗体复合物及未结酶标抗体复合物及未结合酶标抗体被洗脱。因此合酶标抗体被洗脱。因此, ,酶标显色反应深浅与待酶标显色反应深浅与待测抗原的浓度成反比测抗原的浓度成反比酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验原理n方法评价方法评价:ELISA:ELISA是免疫学试验中应用最普遍、适是免疫学试验中应用最普遍、适用范围最广的一种免疫酶标记检测技术，已广泛用范围最广的一种免疫酶标记
45、检测技术，已广泛用于多种寄生虫感染的免疫诊断、血清流行病学用于多种寄生虫感染的免疫诊断、血清流行病学调查、寄生虫病的疗效考核及防治效果的监测。调查、寄生虫病的疗效考核及防治效果的监测。检测的标本也多种多样检测的标本也多种多样, ,可以是待检者血清、积液可以是待检者血清、积液( (如胸腔积液如胸腔积液) )、脑脊液、乳汁、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、尿液、唾液n检测内容可为抗体、抗原或免疫复合物。该检测检测内容可为抗体、抗原或免疫复合物。该检测技术已实现试剂标准化、操作规范化和自动化技术已实现试剂标准化、操作规范化和自动化, ,适适于批量样本的检测。最常用的反应类型是间接法于批量样本的检测。最常用
46、的反应类型是间接法和双抗体夹心法和双抗体夹心法n适用范围适用范围: :该法用于血吸虫病、疟疾、卫氏并殖吸该法用于血吸虫病、疟疾、卫氏并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、肝吸虫病、猪囊尾虫病、弓形虫病、棘球蚴病、肝吸虫病、猪囊尾蚴病、姜片虫病、利什曼原虫病等免疫诊断蚴病、姜片虫病、利什曼原虫病等免疫诊断酶联免疫吸附试验方法与适用范围酶联免疫吸附试验方法与适用范围n参照核酸研究中的斑点杂交法结合参照核酸研究中的斑点杂交法结合ELISAELISA试验改良试验改良而成。以硝酸纤维素而成。以硝酸纤维素(NC)(NC)薄膜为载体薄膜为载体, ,这种多孔膜这种多孔膜可作为多种颗粒性抗原及可溶性抗原固相载体可作为
47、多种颗粒性抗原及可溶性抗原固相载体, ,在在单克隆抗体鉴定中应用较多单克隆抗体鉴定中应用较多, ,此法敏感性很高此法敏感性很高, ,检检测测鼠免疫球蛋白可达微微克鼠免疫球蛋白可达微微克(ng(ng) )级水平级水平n基本原理基本原理:ELISA:ELISA基本相似基本相似, ,只是以硝酸纤维素薄膜只是以硝酸纤维素薄膜为固相载体代替酶标反应板以吸附抗原或抗体为固相载体代替酶标反应板以吸附抗原或抗体, ,用用酶催化作用后可形成不溶性有色沉淀的底物酶催化作用后可形成不溶性有色沉淀的底物( (如如DAB)DAB)代替邻苯二胺代替邻苯二胺(OPD)(OPD)或四甲基联苯胺或四甲基联苯胺(TMB)(TMB
48、)等等底物。底物。结果以能在结果以能在NCNC膜上呈现有色斑点膜上呈现有色斑点, ,而阴性对而阴性对照无色者为阳性反应。本法可吸附抗原以检测特照无色者为阳性反应。本法可吸附抗原以检测特异性抗体异性抗体, ,也可吸附特异性抗体也可吸附特异性抗体( (如单克隆抗如单克隆抗体体,McAb,McAb) )夹心法检测特异性抗原夹心法检测特异性抗原斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)Hawkes(Dot-ELISA)Hawkesn方法评价方法评价: :DotDotELISAELISA法是预先将抗原或抗法是预先将抗原或抗体点涂于体点涂于 NCNC膜上膜上, ,便于保存和携带便于保存
49、和携带, ,操作简操作简便、反应快速、肉眼判断结果、直观且可便、反应快速、肉眼判断结果、直观且可保留结果以利复查保留结果以利复查, ,适于现场应用。研究资适于现场应用。研究资料表明料表明, ,该法对丝虫病、弓形虫病、疟疾等该法对丝虫病、弓形虫病、疟疾等的诊断都有很高的敏感性和特异性的诊断都有很高的敏感性和特异性n适用范围适用范围: :本法用于血吸虫病、疟疾、卫氏本法用于血吸虫病、疟疾、卫氏并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、肝吸并殖吸虫病、弓形虫病、棘球蚴病、肝吸虫病、猪囊尾蚴病、利什曼原虫病等免疫虫病、猪囊尾蚴病、利什曼原虫病等免疫诊断诊断斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验方法评价及适用范
50、围方法评价及适用范围n基本原理基本原理: :金黄色葡萄球菌细胞壁金黄色葡萄球菌细胞壁A A蛋白蛋白(SPA)(SPA)能和人及多种哺乳动物的能和人及多种哺乳动物的IgGIgG的的FCFC端结合端结合, ,可可以此取代第二抗体制成酶标记以此取代第二抗体制成酶标记A A蛋白蛋白, ,用于抗用于抗体或抗原的检测。基本原理、操作及结果判体或抗原的检测。基本原理、操作及结果判定同常规定同常规ELISAELISA法法n方法评价方法评价: :仅以酶标仅以酶标SPASPA代替酶标第二抗体作代替酶标第二抗体作为酶结合物为酶结合物, ,该法的突出优点是受检的该法的突出优点是受检的IgGIgG无无动物种、属的限制动
