1、靶向PCR CTC检测技术帮助临床医生更全面地评估肺癌 Lung Cancer in Solid Tumor in China=？液态活检液态活检通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤病理活检病理活检通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤 CTC ctDNA mircoRNA LNC RNAOthers 传统的组织细胞学检测液态活检在肺癌中的应用液态活检在肺癌中的应用治疗策略事件肺癌待查辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择疗效评估耐药机理新药研发治疗策略事件疑似肺癌辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择耐药机理新药研发CTC的临床应用价值疗效评估CTC(数量）(
2、负向富集+靶向PCR）ctDNA(基因变异）1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015什么是循环肿瘤细胞（什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor CellCirculating Tumor Cell，CTCCTC）？）？肿瘤释放如外周血中肿瘤释放如外周血中CTCsCTCs数量的多少，数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态可间接反应肿瘤发生发展的功能状态CTCCTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由
3、原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1CTCCTC有转移有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征干细胞特征的DTC所形成的微形成的微转移灶转移灶，逃避免疫识别逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2第9周的乳腺管组织切片：乳腺管周围非典型性增生第30周的肿瘤组织切片：新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质CK+ cellsHER-2+ cells什么时候可以检测到CTC？早期肿瘤外周血中即可检出CTCW He, et al. Proc Natl Acad
4、Sci, 2007早期肿瘤外周血中即可检出CTCl表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面l移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞l移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升l在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象CTC富集技术密度与大小免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集)微流体CTC检测方法CTC检测技术靶向PCR免疫荧光普通PCR=+“方法”“收获”“垃圾”蟹饵没水了，我们躲不了了放水负向富集负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低正向富
5、集正向富集优势：纯度高劣势：回收率低（漏掉CTC）幸好没贪嘴，我们逃了“方法”“收获”“垃圾”没水了，我们躲不了了放水负向富集负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低大小富集（大小富集（ISETISET）优势：简单劣势：漏掉小的CTC细胞幸好没吃胖，我们逃了网筛CytoploRare （FR靶向PCR CTC检测技术）检测原理负向富集负向富集靶向靶向PCRPCRFRFR阳性靶标阳性靶标肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达CTC：FR=1:50万EMT转化不影响FR丰度其他血细胞不表达FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自动化灵敏度超高灵敏度超高，负向富集可满足检测要求信号二次放大，1个C
6、TC信号放大1012倍无需人工经验判读，结果客观准确可实现CTC的定量CytoploRare FR靶向PCR CTC检测靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性1个CTC信号放大1012倍优势一：阴性富集不丢失循环肿瘤细胞优势二：靶向探针特异性高优势三：PCR扩增信号，确保高敏感性优势四：PCR仪判断CTC技术，避免人为误差CytoploRarel 敏感性l 特异性l 可重复性l 临床应用便捷性CytoploRarel 敏感性l 特异性l 可重复性l 临床应用便捷性3mL血1mL/3mL血3mL血1个CTC/3mL血50万FR/1个CTC1个CTC/1slide100万信号/1个FR1个信号/1个
7、CTCFR靶向PCR 1个CTC细胞信号方法细胞免疫荧光 1个CTC细胞信号几乎没有放大CytoploRare FR靶向PCR CTC检测敏感性试验：1ctc in 1,200,000白细胞Jiatao Lou, et al. Plos One 2013l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）l FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100%，且呈线性分布l检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万掺入细胞数量掺入细胞数量( (个个) )检出细胞数量检出细胞数量(CU)(CU)复管复管1 1复管复管2 2复管复管3 3检测均值检测
8、均值检出细胞数检出细胞数( (个个) )回收率回收率(%)(%)平均回收率平均回收率(%)(%)R R600571.52 565.13 586.37 574.34 584.12 97.35 98.75 0.9998400372.13 372.99 379.75 374.96 379.59 94.90 200198.93 192.81 185.90 192.55 192.46 96.23 10093.66 96.73 90.08 93.49 90.84 90.84 5056.56 52.07 50.80 53.14 49.44 98.89 2020.43 24.58 23.87 22.96 18
9、.48 92.40 1017.48 17.16 14.56 16.40 11.75 117.51 59.90 9.26 10.58 9.91 5.09 101.87 05.00 5.44 4.40 4.95 0.00 /l 将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）l 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万CytoploRare FR靶向PCR CTC检测敏感性试验：1ctc in 6,000,000白细胞CytoploRarel 敏感性l 特异性l 可重复性l 临床应用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术FR（
10、叶酸受体，高度特异性的靶向探针）l 特异性高：特异性高：加入FR靶向探针前，加入高浓度叶酸封闭细胞表面的叶酸受体，检测结果为阴性l 背景表达：背景表达：去除FR靶向探针，仅保留特异性DNA片段，与保留FR靶向探针相比，检测结果一致，提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值Jiatao Lou, et al. Plos One 2013Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定22EpCAM 上皮细胞粘附分子 APC 异藻蓝蛋白荧光染料 CK 细胞角蛋白 PE 藻红蛋白荧光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料） 上皮细胞白细胞抗抗 EpCAM 磁流体磁
11、流体EpCAM 抗原抗原CD45 抗原抗原CK 抗原抗原抗 CD45-APC 染料抗 CK-PE 染料荧光染料荧光染料EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTCJiatao Lou, et al. Plos One 20132004Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低2011Cell Research: 采用的抗体采用的抗体(EpCAM)对对EMT细胞特异性差细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程l 有报道，部分激活的巨噬细胞存在FR的高表达1l 临床
12、前研究证实，这部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2l 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后，CTC的检测结果无明显改变31、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术巨噬细胞（可能存在FR表达）不影响检测结果CytoploRarel 敏感性l 特异性l 可重复性l 临床应用便捷性CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术同一患者重复检测，可重复性高Cyto
13、ploRarel 敏感性l 特异性l 可重复性l 临床应用便捷性3mL血6个小时得到报告检测流程检测流程肺癌领域，CTC检测技术对比CytoploRare（格诺）CellSearchCyttelTM（北京莱尔）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy（武汉友之友)核心技术免疫磁珠负向富集靶向配体PCR技术 流式正向富集技术荧光标记免疫磁珠负向富集、Fish技术ISET（滤膜）原位杂交RNA分析ISET（滤膜)荧光标记特异性88%80%83%75%70%灵敏度80%30%腺癌：46%30%30%自动化半自动全自动半自动半自动全自动血样体积3mL7.5mL4mL5mL10mL适应症早、中
14、和晚期早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌肿晚期癌肿早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未报道未报道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%报告时间6h/12样本样本6h/8样本48h/1样本48h/1样本3天可视化否否是是是是唯一获得CFDA批准的肺癌CTC检测试剂盒CTCsCTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态：可反应肿瘤发生发展的功能状态Cancer Control, 2015肺癌辅助诊断降低胸部降低胸部CTCT假阳性率，减少肺癌漏诊假阳性率，减少肺癌漏诊肺癌化疗疗效评估评估肿瘤功能活性状态，弥补评估肿瘤功能活性状
15、态，弥补RECISTRECIST标准不足标准不足CTCsCTCs：可反应肿瘤发生发展的功能状态：可反应肿瘤发生发展的功能状态Cancer Control, 2015肺癌辅助诊断降低胸部降低胸部CTCT假阳性率，减少肺癌漏诊假阳性率，减少肺癌漏诊肺癌化疗疗效评估评估肿瘤功能活性状态，弥补评估肿瘤功能活性状态，弥补RECISTRECIST标准不足标准不足1210例受试者肺癌560例肺部良性疾病350例其他肿瘤 (150例) 肝癌 30例结直肠癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例331例A A100例B B 50例C C（21例DD) 79例D DA: 基线CTC检测B：术前术后
16、CTC监测C：一线含铂双药化疗中CTC监测D：基线CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE检测 300例A A 50例D D健康人150例100例A A 50例D D150例A A非动态研究非动态研究 肺癌 560例A A肺部良性疾病 350例A A 健康人 150例A A 动态监测研究动态监测研究 非小细胞肺癌 100例B B 50例C C对比研究对比研究 肺癌 100例D D 肺部良性疾病 50例D D 健康人 50例D D肿瘤特异性研究肿瘤特异性研究 其他肿瘤 150例A A CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测）临床试验设计（1210例, 最大样本量）Jiata
17、o Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015特特征征例数例数(%)(%)肺癌（肺癌（n=560n=560）年龄（平均值，范围）59.3岁(21-79岁)性别（男性/女性）349/211TNMTNM分期分期期期150(26.8%)150(26.8%)期48(8.6%)期157(28.0%)期205(36.6%)病理亚型病理亚型非小细胞肺癌465(83.0%)肺腺癌320(68.8%)肺鳞癌107(23.0%)大细胞肺癌5(1.1%)肺腺鳞癌1(0.2%)其他
18、非小细胞肺癌32(6.9%)小细胞肺癌81(14.5%)其他肺癌14(2.5%)肺部良性疾病（肺部良性疾病（n=350n=350）年龄（平均值，范围）50.1岁(18-80岁)性别（男性/女性）310/140健康人健康人（n n=150=150）年龄（平均值，范围）34.7岁(22-60岁)性别（男性/女性）69/8136患者特征Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015不同CTC计数对于肺癌诊断的特异性与敏感性CTCCTC计数计数诊断肺癌敏诊
19、断肺癌敏感性感性诊断肺癌特诊断肺癌特异性异性2.099.5%2.3%4.096.1%21.3%6.089.5%44.8%8.778.0%83.6%10.068.1%90.3%12.054.1%95.2%95.2%14.040.1%97.6%97.6%16.027.6%98.1%98.1%18.020.5%98.6%98.6%20.016.2%99.5%99.5%CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 叶酸受体阳性CTC作为诊断标志物38 最大样本量最大样本量CTCCTC检测数据检测数据 CutoffCutoff： 8.70 CTC Units/3mL敏感性：敏感性：79.6%79
20、.6%特异性：特异性：88.2%88.2%Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015AUC: 0.8797020406080100All NSCLCSStage Stage Stage and CTCCEANSE CA211 SCCASensitivity%CytoploRare（FR靶向PCR CTC检测） 所有肺癌，敏感性提高3倍；I期肺癌提高10倍CTCCTCCEACEA NSENSE CA211CA211 SCCASCCAAll80.9
21、%80.9%33.8%25.4%25.4%49.7%29.5%Stage67.5%67.5%11.3%5.6%5.6%28.6%8.8%Stage61.9%30%6%55%24.7%Stage、83.2% 37.3%30%52%30.1%CTC对肺癌的诊断显著优于一般肿瘤标志物辅助诊断辅助诊断指标指标AUCAUC值值P P值值CTCCTC0.910.91P0.0001P0.0001CEA0.56NSE0.61CYFRA21-10.71SCCA0.49 CTC与一般肿瘤标志物对肺癌诊断的准确性（AUC值）单项CTC检测的辅助诊断价值优于多个一般肿瘤标志物联合AUC=0.91, P0.0001AU
22、C=0.76不同病理类型中，CTC辅助诊断价值均优于一般肿瘤标志物CTC对期肺癌的阳性检出率高达67.2%其他最优的肿瘤标志物的敏感度仅为32.3%1cm肺癌总体敏感性: 62.5%患者编号患者编号CTC Units/3mL病理诊断病理诊断TNM分期分期临床分期临床分期-整理整理nodule diameter（CT）1 10.53 肺腺癌T1aN0M00.32 0.04 肺腺癌T1N0M00.33 3.83 肺腺癌T1N0M00.54 8.78 肺腺癌tisTis0.55 8.77 肺腺癌T1aN0M00.66 3.93 肺腺癌T1N0M00.77 3.98 肺腺癌T2aN0M00.88 4.
23、84 肺腺癌T1N0M00.89 10.32 肺腺癌T1aN0M0110 13.55 肺鳞癌T1N0M0111 6.29 肺腺癌T1aN0M0112 12.65 肺腺癌T1N0M0113 14.999074肺腺癌T1aN0M00.314 2.5497534肺腺癌T1aN0M00.515 6.2322726肺腺癌T1aN0M00.516 11.312907肺腺癌T1aN0M00.617 14.444199肺腺癌T1aN0M00.618 7.1141741肺腺癌T1aN0M00.719 11.134588肺腺癌T1N0M00.720 11.56小细胞肺癌T2aNxM00.721 13.461248
24、肺腺癌T1aN0M00.722 10.009388肺腺癌T1aN0M00.823 17.296369肺腺癌T1aN0M00.824 10.44506其他肺癌T1aN0M00.925 11.8572肺腺癌T1aN0M00.926 8.7681014其他肺癌T1aN0M0127 10.092346肺腺癌T1N0M0128 11.787912肺腺癌T1aN0M0129 9.2499084肺腺癌T1aN0M0130 12.696456肺腺癌T1aN0M0131 13.279299肺腺癌T1aN0M0132 15.906467肺腺癌T1aN0M01肿瘤大小CT特异性（） CTCTC特异性（）30 mm
25、(n134）59.79420-30 mm (n44 )65.995.510-20mm (n69 )55.192.810mm (n21)61.995.2CTC联合CT可以大大提高小结节诊断的特异性CTC辅助CT可以将小结节的判别假阳性率降低到16: 8/12（75%）患者）患者PR，DCR 100%l 8.7CTC16: PFS 448天天l 8.7CTC16: PFS 94天天Cut off为16cu/3ml, 高表达患者的PFS明显优于低表达者总结 靶向靶向PCR CTCPCR CTC检测技术检测技术敏感度最高，反应肿瘤发生发展的功能状态，可做为新一代肿瘤标志物新一代肿瘤标志物更全面帮助临床
26、诊疗 肺癌辅助诊断 CTC的诊断价值显著优于显著优于一般肿瘤标志物 靶向PCR CTC技术：所有肺癌敏感性提高3 3倍，I期肺癌提高1010倍 肺癌化疗疗效评估 反应肿瘤功能状态，联合胸部CT评估肿瘤更全面更全面 对化疗疗效为SDSD患者患者及RECISTRECIST评估缓慢进展评估缓慢进展患者的评估价值，尤其重要l 目前常规检测肺癌转移和评价治疗效果的方法主要是胸部CTl 胸部胸部CTCT只能评价肿瘤的大小部位，无法评估肿瘤的动态功能只能评价肿瘤的大小部位，无法评估肿瘤的动态功能l CTC CTC检测做为检测做为新一代肿瘤标志物新一代肿瘤标志物，敏感度更高，可用于评估肿瘤发生发展的功，敏感度更高，可用于评估肿瘤发生发展的功能状态。能状态。CTCCTC联合胸部联合胸部CTCT， 更全面的评估肿瘤更全面的评估肿瘤
