1、白血病分子诊断技术康圣环球医学特检集团 周 荣WH0血液肿瘤分类方案（1999年）新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的“真实本质”。提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。形态学免疫学细胞遗传学WH0血液肿瘤分类方案（2008年）组织蛋白细胞基因白血病分子诊断的意义精确诊断准确预后指导治疗科研资料白血病初发MICM诊断系统诊断异常标记残留监测靶向治疗WHO血液肿瘤新分类实验技术平台 实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及更为重要的掌握这类实验技能并具有血液
2、肿瘤专业知识的血液病理学医师。遗传工作站流式细胞基因平台基因检测 融合基因 基因突变“二次打击”学说D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417基因突变融合基因白白血血病病发发生生CML Indications for Diagnostic TestsMilestones and Monitoring in Patients with CML Treated with Imatinib(2008 ASH Education Program Book p420)TestIndicati
3、onPhysical ExamDiagnosis/StagingEvery three month until resolution of splenomegalySuspected progression or resistanceComplete Blood Count Diagnosis/StagingEvery 1-2 weeks until blood count have stabilized, then at 6 weeks intervalsSuspected progression or resistanceBone Marrow KaryotypingDiagnosis/S
4、taging6, 12, 18 months or until complete cytogenetic responseSuspected progression or resistanceQuantitative PCR for Bcr-Abl Every three months once CCyR (complete cytogenetic response) documentedFISH for BCR-ABL Uncertain Diagnosis (typical clinical presentation, but metaphase (peripheral blood)cyt
5、ogenetics not successful, or Ph chromosome negative)Every 3 months if no access to high quantitative PCR monitoringQualitative (low sensitivity) Uncertain Diagnosis (typical clinical presentation, but metaphase PCR for BCR-ABL cytogenetics not successful, or Ph chromosome negative)BCR-ABL Kinase Mut
6、ation Screen Suspected progression or resistanceMolecular Measurements of Treatment ResponseClinical Application(2008 ASH Education Program Book p367) Application Action Detect poor early treatment responseTreatment intensification Detect good early treatment responseTreatment deintensification Dete
7、ct relapseTreatment intensification Prepare for HSCT Measure MRD before HSCT Optimize timing of HSCT Measure MRD after HSCT Modulate immunosupressionDLI, etc. Measure MRD at end of clinical trial Evaluate the result of novel anti- ALL agents or therapy分子诊断在白血病诊断中的应用分子诊断在白血病诊断中的应用提供早期辅助诊断及预后判断提供早期辅助诊
8、断及预后判断对治疗过程进行跟踪对治疗过程进行跟踪进行白血病治疗后的微小残留检测进行白血病治疗后的微小残留检测各病例中的具体应用各病例中的具体应用AMLCML ALLCLL 淋巴瘤淋巴瘤AML病例中应用t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO t(15;17)(q22;q21) PML-RARa inv(16)( p13; q22) CBFB-MYH11 AML融合基因全套检测FLT3基因突变检测NPM1基因突变检测c-kit/D816V突变检测CEBPA基因突变检测WT1基因表达定量检测t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO 融合基因 t(8;21)出现在大约7%的AML
9、病例中，在年青的患者中更为常见。其主要出现在AML-M2这一亚型中，大约有20-40%的病例具有t(8;21)。 AML1-ETO 融合基因出现在所有的t(8;21)阳性的AML中，同时也出现在具有复杂易位的t(8;21)阴性的AML病例中。 t(8;21)易位是一个较好的标志。 PML-RAR APL是一类临床凶险的急性白血病，常见广泛的严重的出血，以颅内出血最为严重。1、t （15;17)，是APL特有的遗传学标志。（70%-90%的APL存在）2、由于PML基因上融合位点的不同，分为bcr1(55%)、bcr2(4%)、 bcr3(40%)三种融合型。3、PML-RARa 融合基因（+）
10、的患者，可使用全反式维甲酸并提示预后复发。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测。inv(16)( p13; q22) CBFB-MYH11融合基因 Inv(16)(p13;q22)或t(16;16)(p13;q22) 通常见于AML-M4Eo亚型，占总AML患者的10%。 inv(16)( p13; q22)的病人通常有较好的预后。AML相关基因全套筛查相关基因全套筛查MLL/AF6MLL/AF9MLL/AF10MLL/AF17MLL/ELLdupMLLAML1/ETOPML/RARaPLZF/RARaNPM/RARaCBFB/MYH11NPM/MLF1TLS/ERGDEK/CAN
11、EVI1Hox11基因突变检测 AML 患者预后判断 C-Kit、FLT3、NPM1、CEBPA染色体核型正常的AML患者CEBPA(15%)Molecular Markers additional to cytogenetics with independent prognostic significances as regarding remission duration or survival in AML of adultsAML: Challenge of Capturing Diesease Variety(2008 ASH Education Program Book p3)Pr
12、ognosisGeneGene mutation withCEPBAmutfavorable impact NMP1mut but FLD3-ITDnegGene mutation withKITunfavorable impactFLD3-ITD but no NMP1mut MLL-PTD*(5-10% of normal karyotype AML)WT-1* among normal karyotype AML预后判断基因突变好CEBPA（+）FLT3（-）/NPM1（+）差FLT3（+）/NPM1（-）C-Kit（+）AML患者4种基因突变检测小结WT1定量检测 MDS/AML监测指
13、标 WT1基因在AML和MDS病人中经常异常高表达，与AML和MDS的发生和进展，以及凶险判断，疗效跟踪和预后复发判断有非常密切的关系。 通过定量PCR检测WT1的表达能够有助于AML和MDS病人的风险判断，疗效跟踪和预后复发的判断。WT1在正常标本和AML病例中的表达情况正常骨髓患者骨髓基因检测 CMPD诊断CMPD相关异常（外周血象、骨髓象）相关异常（外周血象、骨髓象）阴阴性性阳阳性性JAK2基基因因突突变变阴阴性性阳阳性性PV、ET、CMFHES/CEL、SMCML诊诊断断可可能能BCR/ABL融合基因融合基因（FISH、PCR） 在WHO2008分类系统中，将有无JAK2突变列为主要的
14、诊断指标： 如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增加，就可以诊断真性红细胞增多症（PV），即使患者就诊时血红蛋白低于以往WHO所规定的指标值，但却持续超过正常值20g/l，也可以确诊PV。 如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于450*109/L，骨髓巨核细胞增生，可以诊断原发性血小板增多（ET）。PV/ET诊断FIP1L1-PDGFRA部分高嗜酸性粒细胞综合征（高嗜酸性粒细胞综合征（HES）患者含有FIP1L1-PDGFRA融合基因，FIP1L1-PDGFRA有持续活化的酪氨酸激酶活性，对酪氨酸激酶抑制剂非常敏感，可用格格列卫列卫治疗。ETV6-PDGFRB有少部分CMPD
15、病例（病例（BCR-ABL阴性）阴性）的PDGFRB基因持续性活化表达，格列卫能够特异性的抑制ETV6-PDGFRB的酪氨酸激酶活性，携带该融合基因的CMPD病例可以选择格列卫格列卫治疗。CML病例中的应用 BCR-ABL融合基因检测： t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p210 t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p230 BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测BCR-ABL融合基因 超过95%的CML病例中存在BCR-ABL融合基因 P210型 M-bcr（绝大多数） b3-a2（ 55% ） b2-a2（ 40% ） b3-a2和b2-a2 （ 5% ）
16、b3-a3 （罕见） b2-a3 （罕见） p230型 u-bcr e19-a2（罕见）定性检测：定性检测：RT-PCR定量检测：定量检测：QRT-PCR定性检测报告模板定量检测报告BCR-ABL融合基因融合基因ABL激酶突激酶突变检测变检测 ABL激酶突变会引起伊马替尼治疗耐药 T315I 耐药机制: T315突变后不能与伊马替尼形成关键性的氢键，可完全阻断伊马替尼与ABL激酶区的结合,从而耐药。 P环的突变环的突变(244-255) 耐药机制：如 Y253FH、E255KV、Q252H、G250E等通过改变ABL激酶的空间构象，亦可阻碍伊马替尼与之结合。 A环突变环突变(381-402)
17、一般提高用药量可以降低耐药程度。 其它突变其它突变 对于耐药程度较弱的突变，如M244V、G250E、F317L、E355G、F359V及V379I等，通过提高药物剂量，可以克服耐药。报告模板ALL病例中应用t(1;19)( q23; p13) E2A-PBX1 t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4 t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL ALL相关基因全套检测t(1;19)( q23; p13) E2A-PBX1融合基因 t(1;19)( q23; p13) 易位可以在5-6%的儿童ALL病例和3%的成人ALL病例检测
18、到。 这一易位几乎全部出现在前B细胞ALL病例中。 携带有该易位的病人，其临床症状都比较凶险。t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4 融合基因 在50-70%的婴幼儿ALL和将近5%的小儿和成人ALL病例中有MLL-AF4 融合基因。 t(4;11)(q21;q23)与前B-ALL相关。 在婴幼儿ALL中MLL-AF4 融合基因被认为是预后不好的标志。在成人ALL中也是一个坏的标志，但对于成人ALL，该融合基因的存在似乎能增强高剂量的阿糖胞苷（Ara-c） 的疗效。t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1融合基因 t(12;21)(p13;q22)是儿童ALL中最为常见的
19、易位，几乎25%的小儿ALL有该易位。其主要的阳性病人出现在1-12岁之间，其中2-5岁这个年龄段最多。 所有的病例其免疫分型都是前B细胞ALL。 t(12;21)阳性的病人都有较好的预后，其复发的时间也会较晚。t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL 融合基因 Ph染色体在5%的小儿ALL和20-50%（随年龄增加比例也增加）的成人ALL中也可见。 在Ph+的ALL中40%的BCR-ABL融合基因是p210型的，60%是p190型的。 在ALL中，PH阳性和随之出现的BCR-ABL融合基因是一个非常不好的标志。ALL相关基因全套检测MLL/AFXMLL/AF1PMLL/AF4MLL/
20、AF6dupMLLMLL/ENLE2A/PBX1BCR/ABL（p210）E2A/HLFBCR/ABL（p190）SIL/TAL1TEL/AML1TLS/ERGTEL/ABLHOX11CLL病例中的应用 IgVH基因重排检测：基因重排检测： IgVH突变状态：按照细胞IgVH的突变状态可以将CLL分为突变的CLL（M-CLL）与未突变的CLL(U-CLL)。前者预后较好。而后者则疾病进展快，生存期短。IgVH基因重排基因重排阳性的阳性的CLL患者预后较好融合基因套系临床意义白血病31种融合基因筛查ALL、AML、CML、MDS等的辅助诊断、预后判断和疗效监测AML16种融合基因筛查AML的辅助
21、诊断、预后判断和疗效监测ALL15种融合基因筛查ALL的辅助诊断、预后判断和疗效监测融合基因套系白血病31种融合基因筛查其它检测项目TCR/IgH重排BCL-1/JH、BCL-2/JH检测IGH与TCR重排 淋巴细胞克隆性的检测对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值。单克隆重排：单克隆重排：淋巴细胞异常标志多克隆性重排：多克隆性重排：淋巴细胞正常生长发育IgH基因基因TCR基因基因T细胞B细胞重排重排成熟B细胞成熟T细胞 ALL、CLL、淋巴瘤辅助诊断 CLL预后判断ALL、CLL、淋巴瘤辅助诊断BCL-1/JH检测 BCL-1/JH t(11;14)(q13;q32)基因重排主要发生在套
22、细胞淋巴瘤（MCL）当中, 在60-70%的MCL病例中有该易位的存在，检测BCL-1/JH基因重排可帮助鉴别诊断套细胞淋巴瘤。 BCL-2/JH t(14;18)易位是B细胞淋巴瘤的特有性变异，90%的滤泡性淋巴瘤和20-30%的弥漫性大B细胞淋巴瘤含有此易位。BCL-2/JH检测标本要求骨髓2-3ml或外周血3-5mL（复发和 微小残留的检测：骨髓2-3ml）EDTA抗凝（紫头管）， 4，24h内送检。 细胞遗传学 染色体核型分析 FISH染色体核型分析适应症 1.造血系统疾病初诊 2.末次化疗结束两周以上意义 对恶性血液病的诊断，分类分型，治疗方案选择，疗效评估和预后预测方面都有重要的价
23、值。46，XYt (9;22)(q34;q11), 约占95%CML Ph染色体染色体核型分析 诊断8三体 单独或附加异常，较多见于M1，M4， M5，预后差或中等46,XY,+8 FISH检测荧光标记的DNA探针原位杂交荧光显微镜检测 FISH相对于染色体检测，灵敏度高，特异性高。 可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，FISH可能为阳性。 患者用药后，染色体阳性率较低，FISH可提高检出率。 染色体核型与FISH 变异型h（复杂遮蔽型）易位FISH探针：探针：BCR/ABL 检测结果nuc ish 9q34(ABL2) ,22q34(BCR2)(ABL con BCR 1)200/400
24、正常FISH组合结果，中位生存期约为111个月。 FISH探针套系：探针套系：CLL各探针中位生存期（月）p53基因缺失32ATM缺失7912号三体11413q14133RB1缺失133FISH探针套系：MM各探针中位生存期（月）P53缺失24.7RB1缺失42.3D13S319缺失42.31q21位点扩增提示预后差IgH基因重排辅助诊断FISH探针套系：MDS预后预后各探针各探针中位生存期（月）中位生存期（月）好5q-24中+818差-7/7q-30%），肝素钠抗凝，48小时内， 4送检，详细填写申请单。 70病例一：病例一： AML病例资料： 女，3岁，2009.6 初发FCM印象：在CD
25、45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的26%，主要表达HLA-DR、CD13、CD15、CD33、CD34、CD38、CD117，（CD19+2.27%）。淋巴细胞比例降低。提示：急性髓系细胞白血病（AML-M2可能）。 基因：AML1/ETO 阳性。02565127681024data.008SSC-Height -101010101001234data.002CD33 PE -712009.7 化疗 D33：FCM：可见残留，CD33+CD19+细胞约占0.04%。基因： AML1/ETO 阳性。101010101001234data.004SSC-H
26、eight -101010101001234data.004CD33 PE -722009.9 D70：FCM：未做。基因：AML1/ETO 阴性。2010.3 D245：FCM：未见免疫表型明显异常的细胞。基因：AML1/ETO 阴性。101010101001234Data.004CD33 PE -101010101001234Data.002SSC-Height -73病例资料： 病人陈某，2008年2月在协和医院确诊CML。 BCR-ABL定量检测为阳性。 格列卫治疗。00.1110100初发3个月8个月19个月13个月BCR-ABL/ABL(%)0.1 MMR病例二：病例二：CML海南海南北京北京黑龙江黑龙江吉林吉林辽宁辽宁内蒙古内蒙古天津天津河北河北山东山东山西山西陕西陕西新疆新疆台湾台湾西藏西藏青海青海江西江西河南河南安徽安徽湖南湖南浙江浙江甘肃甘肃宁夏宁夏重庆重庆云南云南福建福建广东广东香港香港广西广西四川四川贵州贵州上海上海江苏江苏湖北湖北谢谢大家！关注健康 关注康圣环球
