1、微生物学实验微生物学实验实验要求 课前充分预习，上课不无故缺席，及时上交实验报告。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验器材专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。实验菌种和物品未经许可，不得携出室外，用后的菌种按老师要求妥善处理。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。实验报告要求 统一用A4纸手写实验报告 封面格式 1、实验课程名称 2、实验项目名称 3、学生所在的专业、班级、姓名、学号 4、实验日期 5、同组者姓名 实验报告格式 1、实验目的 2、实验原理 3、实验仪器、溶液试剂 4、实验步骤 5、实验结果（如绘图、列表等）6、思考题 实验成绩的组成 平常成绩40（实验操
2、作表现、实验报告）操作考试30 笔试成绩30实验内容 显微镜的使用及酵母菌、放线菌的形态观察 细菌的单染色和革兰氏染色 霉菌的形态观察 微生物大小测定、显微镜直接计数法 土壤中微生物的分离纯化与活菌计数 微生物生理生化反应 微生物的紫外诱变实验一（一）显微镜的构造、性能和使用方法一、目的要求 了解普通光学显微镜(复式显微镜)的构造、基本原理、维护和保养的方法 学习并掌握普通光学显微镜的正确使用方法二、光学显微镜的基本结构 机械和支架系统 照明系统 光学放大系统三、油镜的工作原理 增加照明亮度 增加显微镜的分辨率1.55 显微镜的分辨率：显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。D=/2NA=/2n
3、sin(/2)D：分辨率 NA：物镜的数值孔径值：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率：镜口角（即入射角）四、显微镜的使用方法 观察前的准备 显微镜的安置 光源调节 根据个人情况，调节双筒显微镜的目镜 右眼看清调节左目镜的视度调节圈调节左目镜的视度调节圈扳动镜管，调节至瞳孔间距扳动镜管，调节至瞳孔间距 显微观察低倍镜观察高倍镜观察（同焦现象）油镜观察 在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用粗调节器将载物台缓慢上升，使油镜浸在镜油中。显微镜用毕后的处理 下降载物台，取下载玻片；用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量酒精乙醚洗液擦去镜头上残留的油迹，最后用干
4、净的擦镜纸擦去残留的洗液（三遍擦拭法）用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件；将镜体各部分复原。五、思考题 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加香柏油有何作用？什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？影响显微镜分辨率的因素有哪些？P47五、2.（）（3）（4）（二）酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 目的要求 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。基本原理 美蓝是一种无毒性染料.氧化型呈现蓝色,还原型呈现无色.用美蓝对酵母的活细胞进行染色,代谢活力强的细胞具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型.因此,具有还原能力
5、的酵母活细胞为无色,死细胞或代谢能力弱的衰老细胞为蓝色.实验器材 菌种 啤酒酵母 溶液或试剂 0.1%吕氏碱性美蓝染色液 仪器或其他用具显微镜，盖玻片，载玻片，滤纸，擦镜纸。实验步骤 制片 在载玻片中央加一滴0.1%美蓝取菌少许混匀盖上盖玻片静置3min、0.5h 观察 用高倍镜观察酵母的形态和出芽生殖 根据颜色鉴别死活细胞 活细胞：无色；死细胞：蓝色实验结果 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征及出芽生殖方式。记录染色时间对酵母菌死活细胞数量的影响。思考题 吕氏碱性美蓝染色液作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。（三）、放线菌的形态观察 目的要求 学习并掌握观察放线菌的基
6、本方法。初步了解放线菌的形态特征。基本原理 利用扦片法观察自然生长状态下放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。实验器材 菌种 细黄链霉菌 培养基 高氏号琼脂培养基 溶液或试剂 0.1%美蓝染色液 仪器或其他用具 显微镜，镊子，载玻片，接种环等。扦片法 倒平板取孢子划线接种无菌操作将灭菌的盖玻片以大约45扦在接种线上28倒置培养3-5d 取培养后的盖玻片用0.1%美蓝对盖玻片染色后观察 油镜下观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的卷曲状况，以及分生孢子的形状，并绘图说明。油镜下观察的放线菌 实验结果 绘图说明你所观察到的放线菌的形态特征。思考题 镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝、气生菌丝及孢子丝？P7
7、6（8）调节手动光轮调节孔径光阑手柄聚光器的升降聚光器的升降调节光轮调节孔径光阑手柄镜头复原、手动光轮调到最低档实验二细菌的单染色及革兰氏染色（一）简单染色法 目的要求 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法；巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。基本原理 借助物理因素（如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等）和化学因素（如：正负离子之间的相互吸引等）的作用而进行的。实验器材 菌种 藤黄八叠球菌 染色剂 草酸铵结晶紫染液 番红染液 仪器或其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。操操作作步步骤骤涂涂 片片干干 燥燥固固 定定 染染 色色 镜镜 检检
8、水水 洗洗 干干 燥燥 实验结果 根据观察结果，绘出细菌形态图。思考题（P76五、2.（）（2）（3）在进行细菌涂片时应注意哪些环节？细菌制片时为什么要进行加热固定？在加热固定时应注意什么？为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？（二）革兰氏染色法 目的要求 学习并初步掌握革兰氏染色法；了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。实验器材 菌种 枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物 染色剂 草酸铵结晶紫染液 卢戈氏碘液 95%乙醇 番红染色液 仪器或其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。操操作作步步骤骤采用三区涂片法制片采用三区涂
9、片法制片大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌与枯草芽孢杆菌大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合涂片混合涂片操操作作步步骤骤大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合涂片油镜下形态（革兰氏染色）大肠杆菌萌发芽孢的枯草芽孢杆菌 实验结果 列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏染色反应。菌菌 种种 形形 态态 颜颜 色色 结果（结果（、）思考题 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？在革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？霉菌的形态观察实验三 目的要求学习并掌握观察霉菌
10、形态的基本方法。了解四类常见霉菌的基本形态特征。基本原理 霉菌的营养体是分枝的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。常见的观察霉菌的有三种：直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃纸培养观察法。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以采用直接制片法制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。实验器材 菌种曲霉、青霉、根霉、毛霉 培养基 察氏琼脂培养基 溶液或试剂乳酸石碳酸棉蓝染色液、50乙醇 仪器或其他用具 显微
11、镜，盖玻片，载玻片，解剖针等。直接制片观察法 在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液；用解剖针挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先用50乙醇洗去脱落的孢子，再放在载玻片的染液中(青霉、曲霉取菌丝时需连同培养基一起挑取)；用解剖针小心分散菌丝，盖上盖玻片；置低倍镜或高倍镜下观察。根霉：假根、匍匐菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子 毛霉：菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子 青霉：菌丝、分生孢子梗、帚状分支小梗及分生孢子 曲霉：菌丝、足细胞、分生孢子梗、初生小梗、次生小梗、顶囊、分生孢子 实验结果 绘图说明你所观察到的霉菌的形态特征。思考题 你主要根据哪些形态特征来区分四种不同的霉菌？(包括菌落特征与个体特征
12、)实验四微生物大小的测定与显微镜直接计数法(一）、微生物大小的测定 目的要求1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。2.增强微生物细胞大小的感性认识。实验原理 镜台测微尺为中央部分刻有精确等分线的载玻片，将1mm等分100格，每格长0.01mm。只用于校正目镜测微尺。目镜测微尺是可放入目镜内的圆形小玻片，精确等分50小格或100小格。由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，测量前需先用镜台测微尺进行校正。球菌以直径表示大小；杆菌用宽长表示。实验器材 菌种：啤酒酵母 仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺实验步骤 安装目镜测微尺 校正目镜
13、测微尺 将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。分别在低、高倍镜、油镜下用镜台测微尺校正目镜测微尺 计算 镜台测微尺：将1mm等分为100小格，每小格长0.01mm（即10m）。目镜测微尺每格长度（m）=（两重合线间镜台测微尺格数10）/两重合线间目镜测微尺格数 菌体大小测定 取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，在高倍镜下测定酵母菌的长和宽。选择有代表性的10个细胞进行测定，取平均值。实验结果记录（书P50）1）将目镜测微尺校正结果填入下表 接目镜放大倍数：接物镜接物镜接物镜倍数接物镜倍数目镜测微目镜测微尺格数尺格数镜台测微镜台测微尺格数尺格数目镜测微尺每格代表的目镜测微尺每格代表的长度长度
14、/um/um低倍镜低倍镜高倍镜高倍镜油油 镜镜2）将啤酒酵母测定结果填入下表测定测定次数次数目镜测微目镜测微尺每格代尺每格代表的长度表的长度/um/um 宽宽 长长菌体大菌体大小小/um/um目镜测微目镜测微尺格数尺格数宽度宽度/um/um目镜测微目镜测微尺格数尺格数长度长度/um/um1 12 23 34 45 56 67 78 89 9平均平均值值目的要求1.明确血细胞球计数板计数的原理。2.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。（二）酵母菌的显微镜直接计数（二）酵母菌的显微镜直接计数 血球计数板的构造 血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台；中间较宽的平台又被一短横槽
15、隔成两半，每一边的平台上各有一个方格网。每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度有两种规格：一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格，每个大方格都由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。基本原理实验器材 菌种：啤酒酵母 仪器：显微镜、血球计数板制制备备适适当当浓浓度度的的菌菌悬悬液液取取洁洁净净的的血血球球计计数数板板盖盖上上盖盖玻玻片片静静置置5
16、分分钟钟用用高高倍倍镜镜计计数数加加样样品品设设5个中方格的总菌数为个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B计数板为计数板为25个中方格个中方格(本次试验本次试验)：1ml菌液的总菌数菌液的总菌数=A/525104B计数板为计数板为16个中方格：个中方格：1ml菌液的总菌数菌液的总菌数=A/516104B 注意事项 取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡；一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜；每个计数室选5个中格（4个角和中央）计数；位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用
17、硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹干。实验结果（书P）测定你所制备的样品的含菌量。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数各中格中菌数各中格中菌数 A B二室平均值二室平均值 菌数菌数/m12345第一室第一室第二室第二室 思考题 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避免？（一）培养基的制备与灭菌实验五、土壤中微生物的分离纯化实验五、土壤中微生物的分离纯化与活菌
18、计数与活菌计数一、培养基的制备 目的要求明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤 按培养基的用途分 基础培养基 鉴别培养基 选择培养基按培养基的物理状态分按培养基的物理状态分固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基基本原理按成分不同分按成分不同分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基半合成培养基半合成培养基培养基的配方 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌）配方：配方：牛肉膏牛肉膏 3g蛋白胨蛋白胨 10g氯化钠氯化钠 5g琼脂琼脂 20g水水 1000mlpH 7-7.2灭菌灭菌 121 20min 高氏号培养
19、基（一种合成培养基，可用于培养放线菌）配方：配方：可溶性淀粉可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂琼脂 20g水水 1000mlpH 7.27.4灭菌灭菌 121 20min 马丁氏培养基（一种合成培养基，可用于分离培养真菌）配方：配方：蛋白胨蛋白胨 g葡萄糖葡萄糖 10gK2HPO4 gMgSO4 7H2O 0.5g琼脂琼脂 20g%孟加拉红水溶液孟加拉红水溶液 3.3ml水水 1000mlpH 自然自然灭菌灭菌 121 30min 使用前，添加链霉素使用前，添加链霉素 固体淀粉培养基（一种鉴别培养基，用于大分子
20、物质水解的生理生化鉴定）配方：配方：蛋白胨蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏牛肉膏 5g 可溶性淀粉可溶性淀粉 2g 蒸馏水蒸馏水 1000ml 琼脂琼脂 20g 灭菌灭菌 121 20min 葡萄糖蛋白胨水培养基（一种鉴别培养基，用于肠道菌的生理生化鉴定）配方：配方：蛋白胨蛋白胨 5g 葡萄糖葡萄糖 5g K2HPO4 2g 蒸馏水蒸馏水 1000ml pH 7.07.2 灭菌灭菌 112 30min 器材l 溶液或试剂 4mol/L NaOH，1mol/L HCl，各类培养基的配方药品。l 仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5
21、.59.0)，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。操作步骤（一）1 计算：根据配方按照用量计算。2.称量：3溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。4、调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节，以pH试纸或pH计测定。5过滤：趁热用四层纱布过滤。（本次实验省略）操作步骤（二）6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3。三角烧瓶：总体积的一半为限。管口或瓶口不得沾有培养基操作步骤（三）7.加塞1.正确；正确；2.管内部分太短，外部太松；管内部分太短，外部太松；3.外部过小外部过小操作步骤（三）8.包扎：注明培养基的名称。9.灭菌：按不同培养
22、基所需的温度、时间灭菌。10.搁置斜面 (1/3l/2，不能超过1/2)。11.无菌检查 实验无菌器皿的准备无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水，经121 20min灭菌。无菌移液吸管、培养皿：报纸包扎后，经121 20min灭菌 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。目的要求目的要求二、消毒与灭菌 灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。基本原理基本原理 干热灭菌 火焰灼烧法 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）湿热灭菌法 加压
23、蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌火焰灼烧法 直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。干热灭菌法 设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170，维持2小时 注意事项：1.温度不可超过180，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。2.灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。3.灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。4.电烘箱内温度70时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。2.湿热灭菌(一）l高压蒸汽灭菌法：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121保持1530min进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性
24、而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。卵白蛋白含水量卵白蛋白含水量/%/%3030分钟内凝固所需温度分钟内凝固所需温度/505625748018809061450160170蛋白质含水量与凝固所需温度的关系蛋白质含水量与凝固所需温度的关系为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温
25、度高，时间长？为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？原因二：湿热的穿透力比干热大。原因二：湿热的穿透力比干热大。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。温度温度/时间时间/h透过布层的温度透过布层的温度/灭菌灭菌干热干热1301404867270.5不完全不完全湿热湿热105.33101101101完全完全在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以排气是否完全很重要。l间歇灭菌法：应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热10030min、连续三天，可彻底灭菌。l煮沸消
26、毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为1015min。l超高温杀菌：此法指在温度和时间标准分别为135150和28s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。2.湿热灭菌(二）l高压蒸汽灭菌法操作步骤（三）手提式高压蒸汽灭菌锅全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅操作步骤（三）（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）1.1.装锅先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭菌物品。菌物品。2.2.加盖 将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。以两两对
27、称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。3.3.灭菌 加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至关上排气阀，升温至l21l21时维持时维持1520min1520min。4.4.降温取物 灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0 0时，打开排气阀，开盖取物。时，打开排气阀，开盖取物。加压蒸汽灭菌法0.1MPa，121，20min灭菌注意事项：1.切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2.锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。3.压力一定要降到“0”时
28、，才能打开排气阀，开盖取物。4.灭菌全程必须有人看守。紫外线灭菌法 适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。若紫外线照射与3%5%的石炭酸溶液或2%3%的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。注意事项：紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。过滤除菌法 适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。滤膜孔径：0.22m 缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。思考题 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？P2（1）在配制培养基的操作过程中应
29、注意哪些问题？为什么？P2（）在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么？P27（1）为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。P27（2）在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？P27（3）实验五实验五土壤中微生物的分离土壤中微生物的分离纯化与活菌计数纯化与活菌计数 目的要求目的要求1.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。物的基本操作技术。2.观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）
30、。（一）微生物的分离纯化及观察（一）微生物的分离纯化及观察基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。1.1.简易单细胞挑取法简易单细胞挑取法 （简易单孢子分离法）（简易单孢子分离法）2.2.平板分离法平板分离法 选择适宜的培养基选择适宜的培养基，微生物在，微生物在固体培养基固体培养基上上生长形成的单个生长形成的单个菌落菌落可以是由一个或几个细胞繁可以是由一个或几个细胞繁殖而成的集合体。殖而成的集合体。挑取单菌落可获得一种纯培养。挑取单菌落可获得一种纯培养。方法：方法：
31、稀释涂布平板法稀释涂布平板法、平板划线分离法平板划线分离法器材分离源：自采集土壤样品培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏号培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。仪器或其他用具 振荡器，无菌培养皿，无菌吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。1、编号：取无菌平皿个。另取无菌水支，依次标明10-2、103、10-4、10-5。2、倒平板：分别将三种培养基溶化后，冷却至5560时，每种培养基各倒皿，标注培养基名称。其中，高氏号培养基在倒入前需先添加滴10%的苯酚。一、稀释涂布平板法（全组完成）一、稀释涂布平板法（全组完成）3、制
32、备土壤稀释液 0.5ml各4.5ml 无菌水各取稀释样0.ml涂布放菌液时吸管尖不要碰到液面，即放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接触一个稀释度。每一支吸管只接触一个稀释度。牛肉膏平板牛肉膏平板马丁氏平板马丁氏平板 102 10-3 10-4 10-510-1 10-2 10-3 10-4 10-5 0.5ml 0.5ml 0.5ml高氏高氏号平板号平板、涂布、培养 将高氏号平板、马丁氏平板倒置于28 培养d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 培养培养12d。、菌落观察观察并描述土壤样品中分离到的细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。、挑菌落 将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置37和28温室中培
33、养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。二、平板划线分离法（个人完成）1、倒平板：将种培养基溶化后，各倒一皿。并用记号笔标明培养基名称、样品编号、个人学号等。2、划线：分别挑取土壤样品中101的土壤悬液一环，在三种平板上划线，以分离细菌、放线菌、霉菌。分区划线、连续划线分区划线分区划线（适用于浓度较（适用于浓度较大的样品）大的样品）连续划线（适用于浓度较连续划线（适用于浓度较小的样品）小的样品）3、培养将高氏号平板、马丁氏平板倒置于28 培养d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 培养培养12d。4、菌落观察、挑菌 挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分
34、离纯化。实验结果(P4 五、.(、)你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因。在不同的平板上你分离得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。思考题 如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。(P4 五.2.(1)如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。(二)、平板菌落计数法 目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法。基本原理 通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内。统
35、计数量时，根据稀释倍数与取样量、平板上长出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数（CFU）。实验器材 菌种：大肠杆菌菌悬液 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5mL无菌水的试管等。两种计数方法 倾注法（本次实验）涂布法操作步骤（全组完成）1.编号：取无菌平皿9个，分别表明104、10-5、10-6（稀释度）各三套。另取无菌水6支，依次标明101、10-2、103、10-4、10-5、10-6。七支无菌吸管也依次编号。10-4 10-5 10-6原样 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-60.5ml0.5ml0.5ml0.5ml
36、0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml2.2.稀释稀释:3.取样取样0.5ml4.倒平板：倒入融化后冷却至45的培养基15ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。5.培养培养：3737倒置培养倒置培养48h48h。.计数计数：选择每个平板上长有：选择每个平板上长有3030030300个菌落数的个菌落数的稀释度计算样品含菌量。稀释度计算样品含菌量。实验结果 P34表格 依据实验结果，分析本次数据是否可靠。计算每毫升大肠杆菌菌悬液的含菌量。思考题（P34（3）（5）（6）（）为什么熔化后的培养基要冷却至45左右才能倒平板？要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？当你的平板
37、上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？倾注法倾注法涂布法涂布法倒平板倒平板a a 皿加法皿加法 b b手持法手持法细细 菌菌放线菌放线菌霉菌霉菌实验六实验六微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应实验内容 大分子物质的水解试验 淀粉水解试验 糖发酵试验 葡萄糖发酵 乳糖发酵 IMViC试验 吲哚试验 甲基红试验 伏-普试验 柠檬酸盐试验一、大分子物质的水解试验 目的要求 证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；掌握进行生物大分子水解试验
38、的原理和方法。基本原理 大分子物质淀粉、蛋白质和脂肪必须通过胞外酶水解成较小的化合物后，才能被微生物吸收利用。实验器材 菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，变形杆菌 培养基 固体淀粉培养基 溶液或试剂 卢戈氏碘液 仪器或其他用具 无菌平板，接种针淀粉水解试验大肠大肠杆菌杆菌变形杆菌变形杆菌枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌37 均均倒倒 匀匀置置 铺铺培培 满满养养 平平24h 板板滴滴入入少少量量碘碘液液，菌苔周围出现无色透明圈：说明淀粉已被水解，阳性；菌苔周围出现无色透明圈：说明淀粉已被水解，阳性；透明圈大小表明胞外淀粉酶活力的高低。透明圈大小表明胞外淀粉酶活力的高低。实验结果 记录实验结果：“+”表示阳
39、性；“-”表示阴性。菌菌 名名淀粉水解淀粉水解枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌大肠杆菌普通变形杆菌普通变形杆菌思考题 你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？二、糖发酵试验 目的要求 了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用；掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。基本原理 糖类是绝大多数细菌的碳源和能源，但是，不同种细菌对不同糖的分解性能和产物并不一致。有些细菌能分解某种糖产酸和产气，有些细菌只产酸不产气，有些细菌则不能分解。实验器材 菌种 大肠杆菌，普通变形杆菌 培养基 葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）仪器或其他用具
40、 试管架，接种环 操作步骤取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支支分别接种普通变形杆菌、大肠杆菌分别接种普通变形杆菌、大肠杆菌第第3支不接种（对照支不接种（对照,老师提供）老师提供）6支试管支试管37培养培养24-48h观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡产生观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡产生产酸：溴甲酚紫指示剂由紫色（产酸：溴甲酚紫指示剂由紫色（pH6.8）黄色（黄色（pH5.2）糖发酵试验左侧阳性结果右侧阴性结果实验结果 记录实验结果：“+”表示产酸或产气；“-”表示不产酸或不产气。糖类发酵糖类发酵大肠杆菌大肠杆菌普通变形
41、杆菌普通变形杆菌对对 照照葡萄糖发酵葡萄糖发酵乳糖发酵乳糖发酵思考题 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？三、IMViC试验目的要求 了解IMViC反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。实验器材 菌种 大肠杆菌，产气肠杆菌 培养基 蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基 溶液或试剂 甲基红指示剂，40%KOH，5%-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。1、吲哚试验 基本原理 检测细菌代谢色氨酸产生吲哚的能力。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸；吲哚和对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于蛋白
42、胨水培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于蛋白胨水培养基37培养培养2d加加6-7滴乙醚，充分摇动，静置滴乙醚，充分摇动，静置1-3min；乙醚上升后，沿管壁徐徐加入乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂滴吲哚试剂若在乙醚和培养物之间产生红色环状物若在乙醚和培养物之间产生红色环状物阳性反应阳性反应2、甲基红（M.R）试验 基本原理 检测细菌是否能分解葡萄糖产酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2）。操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基37培养培养2d加
43、入甲基红指示剂加入甲基红指示剂2滴滴培养基变为红色培养基变为红色阳性；培养基变为黄色阳性；培养基变为黄色阴性阴性3、伏-普（V.P）试验 基本原理 测定细菌发酵葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合、脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇；乙酰甲基甲醇在碱性条件下被氧化为二乙酰；二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。操作步骤操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于葡萄糖蛋白胨水培养基37培养培养2d加入加入5-10滴滴40%KOH，再加入等量的，再加入等量的5%-
44、萘酚，用力振荡萘酚，用力振荡置于置于37温箱中保温温箱中保温15-30min若培养物呈红色若培养物呈红色伏伏-普反应阳性普反应阳性4、柠檬酸盐试验 基本原理 检测细菌利用柠檬酸盐的能力。有些细菌可利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而有些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基由绿色变为深蓝色。操作步骤操作步骤分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于柠檬酸盐斜面培养基分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌于柠檬酸盐斜面培养基37培养培养2d观察斜面培养基上有无细菌生长和变色观察斜面培养基上有无细菌生长和变
45、色培养基变为蓝色培养基变为蓝色阳性；培养基变为绿色阳性；培养基变为绿色阴性阴性实验结果 记录实验结果：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。菌菌 名名IMViC试验试验吲哚试验吲哚试验甲基红试验甲基红试验伏伏-普试验普试验柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌对对 照照思考题 讨论IMViC试验在医学检验上的意义。解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏-普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？实验七微生物的紫外诱变一、目的要求 掌
46、握紫外线诱发微生物突变的基本原理。掌握选育高产突变型菌株的方法。二、基本原理 紫外线是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并将照射处理后的微生物放在暗处培养。三、实验器材 菌株 枯草芽孢杆菌 培养基 淀粉培养基 溶液或试剂 碘液，无菌生理盐水，盛4.5ml无菌水试管 仪器或其他用具 1ml无菌吸管，玻璃涂布棒，血细胞计数板，显微镜，
47、紫外灯（15W），磁力搅拌器，台式离心机，振荡混合器等。四、操作步骤 制备菌悬液 取枯草芽孢杆菌48h斜面培养物4-5支用10ml无菌生理盐水洗下菌苔倒入无菌大试管振荡30s，打散菌块3000r/min离心10min弃上清液用无菌生理盐水洗涤菌体2-3次制成菌悬液用显微镜直接计数法调整细胞浓度108个/ml。（老师完成）制作淀粉琼脂培养基平板 紫外线处理 打开紫外灯预热20min。各取3ml菌悬液，分别加入2套6cm无菌平皿中，并放入一根无菌磁力棒。将平皿置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离30cm，15W的紫外灯下分别搅拌照射1min和3min。盖上皿盖，关闭紫外灯。稀释：把照射过的菌悬液用无
48、菌水稀释成10-1-10-6；涂平板：取 10-4、10-5、10-6稀释液和未经照射的稀释液（对照）各0.1ml涂平板，重复三个平板；培养：用黑布或纸包好，37培养48h。分别计算紫外线处理1min和3min后的存活率和致死率 存活率（%）=致死率（%）=100cfuXcfu处理后每毫升数对照每毫升数100cfucfuXcfu对照每毫升数处理后每毫升数对照每毫升数 观察诱变效应 选取cfu数在5-6个左右的处理后涂布的平板观察诱变效应。分别向平板内加碘液数滴，在菌落周围出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC比值）。选取HC比值大的菌落转接到试管斜面上培养，可用于复筛。五、
49、注意事项 紫外线照射计时从开盖起，加盖止；先开磁力搅拌器，再开盖照射，使菌悬液中的细胞接受均等照射；从紫外线照射处理开始，直到涂布完平板的所有操作步骤都需在红光下进行。六、实验结果观察诱变效应，计算存活率、致死率、HC比值。结果填入1.(1)(2)。稀释倍数稀释倍数平均数平均数/皿皿处理时间处理时间/min存活率存活率/%致死率致死率/%0（对照）（对照）六、实验结果菌落菌落HC比值比值诱变剂诱变剂UV(1min)UV(3min)对照对照七、思考题.(2)、(3)用紫外线进行诱变时，为什么要打开皿盖？为什么要在红光下操作，暗环境下培养？分析你的实验结果：是否获得了比对照组产淀粉酶更高的突变株？试分析其可能的原因。从你的实验结果中，说明致死率与诱变效应的相关性。
