1、 循环生物标志物与精准医学Circulating Biomarkers in Precision Medicine精准医疗（Precision Medicine）2015年1月，美国总统奥巴马宣布启动“精准医学计划“（Precision Medicine Initiative）计划四要素的解读精确（the right treatment）：准时（at the right time）：共享（give all of us access）：个体化（personalized information）：生物标志物（biomarker）能客观测量并可用于评价、预测生理和病理状况的指标。用途用途生物标志物疾
2、病诊断疗效评价风险评估分型分期复发监测用药指导分 类生物标志物组织影像血液血液体液体液循环生物标志物传统生物标志物组织（病理检测）细胞（如 血细胞常规）蛋白（如 PSA)核酸（如 乙肝病毒DNA）传统生物标志物缺陷循环生物标志物概述tissue sampleclassified by histologyLimitations of Tissue Examination Invasive Not always available Partial and temporal information Increase the risk of dissemination Risk AssessmentS
3、creeningDifferential DiagnosisStagingPrognosisTherapy SelectionTherapy MonitoringSurveillanceAm I at risk of developing cancer?Is there a chance that I have cancer today?Do I have cancer today,and what type today?Has my cancer spread?How will my cancer progress?What is the most effective and safe th
4、erapy for me?Is my therapy working?Has my cancer come back?传统生物标志物缺陷循环生物标志物概述Is it possible to monitor dynamic changes of disease in the blood or other body fluids?循环生物标志物概述生物标志物发展方向组织（静态、有创）血液、体液（无创、动态）细胞（细胞群体）稀有细胞蛋白（游离）功能性释放蛋白 基因（组织DNA）游离核酸、非编码RNA 循环稀有细胞（CRCs）新型循环生物标志物1 概 述2 循环核酸（CNA）345问题与挑战 细胞外囊
5、泡（EVs）循环稀有细胞（CRCs）新型循环生物标志物1 概 述2 循环核酸（CNA）345问题与挑战 细胞外囊泡（EVs）循环核酸(Circulating Nucleic Acid）循环DNA（如肿瘤DNA)循环非编码RNA(如miRNA、LncRNA）游离于循环系统中的DNA或者RNA循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA）Tumor cell DNA shed or released into the circulation Specific Sensitive Non-invasive Real-time monitoring 检测手段利用肿瘤特异的基因变异（如突变
6、、重排）进行检测检测技术 荧光PCR 数字PCR 二代测序 DHPLC 临床应用乳腺癌 敏感性ctDNA vs.CA153 96%vs.78%N Engl J Med 2013;368:1199-1209较传统标志物更敏感临床应用ctDNA实时监控乳腺癌病程N Engl J Med 2013;368:1199-1209表阿霉素表阿霉素紫杉醇紫杉醇临床应用JAMA Oncol.2015 May;1(2):149-157非小细胞肺癌cfDNA 突变与组织一致性好 83.9%cfDNA突变可作为靶向药物厄洛替尼的预测指标循环非编码RNA A non-coding RNA(ncRNA)is a fun
7、ctional RNA molecule that is not translated into a protein.Research hotspot:MicroRNAs,Long ncRNAs循环非编码RNAMicroRNAs MiRNA is a small non-coding RNA molecule(E型。追踪4例手术前、后以及6周期化疗后CTC变化A、B、C患者均提示有效，D提示进展(CT证实）疗效快速评价Clinical Chemistry.2015.62:2.CTC应用展望生物学功能与药敏分析基因组转录组甲基化组CTC应用展望单细胞分析Single cell Analysis
8、循环稀有细胞（CRCs）循环生物标志物1 概 述2 循环核酸（CNA）345问题与挑战 细胞外囊泡（EVs）细胞外囊泡(Extracellular vesicles)细胞外囊泡（EVs)是指在正常和病理状态下，机体内细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出30-1000nm的微小囊泡微囊泡EVs命名、分类、结构微囊泡EVs的研究价值 细胞外囊泡最初仅被视作细胞的“垃圾袋”，用于清除不必要的大分子，但现在其被认为是特殊分泌的囊泡，用于细胞间通讯。形象比喻：形象比喻：交通工具？先锋部队？拓荒者？微囊泡EVs的实验研究方法1.形态学分析2.分子生物学鉴定根据其粒径、密度等理化性质理化性质或免疫学性质
9、免疫学性质将其从来源细胞上清/生物液体中分离出来核酸/蛋白质/脂质成分功能分析细胞实验：共培养功能实验、小RNA干扰过表达、细胞通路分离分离鉴定鉴定分析分析微囊泡分离分离离心法（超高速/密度梯度）、过滤法（微孔膜/超滤）、免疫亲合法、聚合沉淀法（SBI/Life试剂盒）、微流体技术等鉴定和评估鉴定和评估形态学鉴定：电镜（透射电镜/免疫金标电镜/扫描电镜）光学粒子追踪（Nanosight）动态光散射分子生物学鉴定：免疫印迹法（Evs常用maker蛋白如CD63、TSG101等）流式细胞术免疫荧光标记免疫定量法（如ELISA）提取提取Evs内容物内容物 RNA蛋白质微囊泡核酸核酸高通量测序技术荧光
10、实时定量PCR基因芯片Bioanalyzer（毛细管电泳定量、RNA芯片、测序）后续分析后续分析蛋白质蛋白质蛋白质组学流式细胞术ELISAWestern Blot微型核磁共振系统微囊泡肿瘤性疾病肿瘤性疾病(应用较多应用较多)疾病疾病MVs中标志物中标志物前列腺癌尿液：miRNA141，PCA3；TMPRSS2：ERG融合；PSA、PSMA、5T4非小细胞肺癌miRNA25，miRNA223卵巢癌EpCAM，8种miRNA特异高表达肺癌EpCAM，12种miRNA与肿瘤组织高表达一致白血病微泡的表型与白血病的分型及临床分期有关 结肠癌CEA，MVs量，与预后有关微囊泡非肿瘤性疾病非肿瘤性疾病疾病
11、疾病MVs中标志物中标志物肾缺血/再灌注损伤急性肾损伤尿液：Aquaporins1/2，胎球蛋白A，活化转录因子3肝损伤CD26、81、10；Slc3A1干燥综合征唾液：miRNA标志物；口腔疾病唾液exosome中一些标志物SLE、MS、巨细胞动脉炎慢性乙肝CD24，SNP与妊娠阶段有关miRNA526a、527、515-5p、521微囊泡Nature.2015 Jul 9;523(7559):177-82.细胞外囊泡应用实例1 循环exosome中GPC1在胰腺癌特异性增高Nature.2015 Jul 9;523(7559):177-82.微囊泡BPD 良性胰腺疾病PCPL 癌前病变较C
12、A199明显优越敏感性与特异性均100%GPC1早期诊断血液exosome GPC1升高早于影像学GPC1含量反映肿瘤负荷Nature.2015 Jul 9;523(7559):177-82.GPC1提供预后判断Nature.2015 Oct 28.doi:10.1038/nature15756.细胞外囊泡应用实例 2肿瘤转移性能与exosome相关exosome整合素家族在肿瘤转移中起关键作用exosome整合素作用于肿瘤转移模型exosome整合素可作为肿瘤转移的生物标志物2011年：Ltvall和Clotilde等长期从事囊泡研究的科学家在瑞典成立了研究囊泡的国际性学术组织国际囊泡协会（
13、International Society For Extracellular Vesicles，ISEV）创办官方会刊 Journal of Extracellular Vesicles（JEV）每年召集世界各地囊泡学者举办国际学术交流会议 召开年会时间召开年会时间地点地点2012，April 18-20Gothenburg,The Sweden2013，April 17-20Boston,The USA2014，April 30 May3Rotterdam,The Netherlands2015，April 23-26Washington DC,The USA2016，May 4-7201
14、7，May 18-21 Rotterdam,The NetherlandsToronto,CanadaISEV汇集全世界学者，收集、评估和宣传EVs（包括exosomes）相关的科学进展，致力于推进EVs在基础医学、转化医学和临床医学方面的研究Exosomes方法学比较研究：exosomes及exosomes内RNA提取方法比较和选择肺癌临床诊断标志物筛查：筛查与肺癌疾病进展相关的RNA和蛋白质泌尿系统疾病临床诊断标志物筛查：尿液和血液标本结合筛查与泌尿系统疾病相关的RNAExosomes与肿瘤微环境机制研究：Exosomes对肿瘤微环境各类分子表达的影响及机制南方医科大学中英循环生物标志物南
15、方医科大学中英循环生物标志物开发与检测实验室开发与检测实验室Systemic Effects of Exosome-Mediated MetastasisExosomes serve as tumor markers for personalized diagnostics owing to their important role in cancer metastasis.Taixue An,Lei Zheng.J Extracell Vesicles.2015 Jun 19;4:27522.Comparison of isolation methods of exosomes and ex
16、osomal RNA from cell culture medium and serum.International Journal Molecular Science,2016,submitted Systemic Effects of Exosome-Mediated MetastasisMesenchymal phenotype cells-derived exosomes contain unique small RNA profiles and promote EMT process of epithelial phenotype cellsExosomes(E-exo,M-exo
17、)A549,16HBE Cells?EMthe expression levels of EMT marker(E-cad,N-cad,Vim):protein,mRNAchangeCellular function:the effect of exosomes on invasiveness and migration capability of A549M-exosomes promote EMT processsmall RNA profiles of M-exosomes Yueting Tang,Yiyao Huang,Lei Zheng,Qian Wang.Dynamic chan
18、ges of circulating exosomes following epithelial-mesenchymal transition in lung cancer.unpublished data初步成果广州市科技计划资助项目：非小细胞肺癌上皮-间质转化过程中exosome的E/M分子分型及其临床应用研究，20万广州市健康医疗协同创新重大专项资助项目（重大慢性疾病早防 早诊早治新技术及 应用研究）：基于循环细胞外囊泡的糖尿病血管相关并 发症早期诊疗新技术研发，400万中英循环生物标志物实验室问题与挑战 新型循环标志物的发掘（核心）检测技术的发展与规范（关键）多中心临床研究（保证）分子机制相关基础研究（支持）
