1、心血管实验病理学方法简介主要内容1.实验病理学的特点2.常用病理学技术与方法3.模式动物的病理学评价1.0 实验病理学的特点1.实验病理的多样性2.实验动物与人的差异3.病理学评价的特点1.1 实验病理的多样性 疾病机制研究 治疗药物研究 植入器械研究 动物种属不一样 动物数量不一样 研究重点不一样1.2 实验动物与人的差异 解剖结构差异 动物自发疾病 病理反应差异 疾病易感性的差异1.3 病理学评价的特点 不同于检验医学 需要研究者参与实验过程 病理学是描述性的、解释性的科学 主观性较强、必须有科学的评价方法2.0 常用病理学技术与方法1.常规组织学技术2.免疫组织化学3.电子显微镜4.形态
2、定量与图像分析2.1 常规组织学技术1.固定与包埋类别2.冰冻切片要点3.常用染色方法2.1.1 常用固定剂交联性固定剂（甲醛、戊二醛，多聚甲醛）非交联性固定剂（酒精、甲醇、丙酮、锇酸）单一固定剂（10%福尔马林）复方固定剂（P-L-P 固定剂）常规固定（一般形态）特殊固定剂（糖原、脂质、嗜铬固定）有利抗原保存固定（短时固定、PLP固定）2.1.1 固定时间 固定时间（2-3mm厚、4-6h）灌注固定（10-20min）+后固定（4-6h）固定液10倍于组织或器官大小（容器问题）“固定不足”问题（自溶、切片透明染色不良，脑及脂肪组织固定中易出现）“过固定”问题（抗原修复困难、福尔马林结晶）2.
3、1.1 包埋方法1.OCT包埋（冰冻切片）抗原、GFP的保存，冰晶与组织形态2.石蜡包埋（常规切片）抗原性包被、GFP破坏、组织形态保存3.树脂包埋（电镜超薄切片）超薄切片、亚细胞分辨、抗原性包被4.塑料包埋（超硬切片或磨片）特殊材料制片、细胞形态与抗原性破坏2.1.2 冰冻切片 优点优点：脂质和抗原性得到良好保存 不需抗原修复 某些抗原会因固定包埋失活 用途：用途：快速病理诊断 脂肪染色 一抗试剂的要求 多重免疫染色（荧光共定位）精确定位和定量 2.1.2 脂肪染色H.E.H.E.Oil Red OOil Red OMouse model of Atherosclerosis免疫荧光与共定位
4、C3d Heart transplant三维重建VincuninThree-dimensional structure of the t-tubular system in a living rat ventricular myocyte,reconstructed from a stack of images of dextran-linked fluorescein fluorescence within the t-tubules.Bar5 m.Circ Res.1999;84:2662752.1.2 冰冻切片的应用限制 缺点：切片质量不及石蜡切片 抗原易移位、扩散 自发荧光 特殊的切片
5、和保存要求 冰晶：细胞内、外水份冻融所产生的对细胞膜和组织结构破坏。冰晶的多少与组织的水分含量和冻融的次数成正比。冰冻切片制作程序 1（常规研究用）1.小块新鲜组织（5 mm)，直接液氮冻结、或直接液氮冻结、或OCTOCT包埋后液氮冻结包埋后液氮冻结2.塑料袋或盒包装，80保存3.冰冻切片（510um）4.风干过夜，或至少1小时（电风扇，室温）5.5.冷丙酮或甲醇固定冷丙酮或甲醇固定10101515分钟分钟6.再风干（电风扇，室温）7.常规染色、或密封后30冰箱保存冰冻切片制作程序 2（优化研究用）1.小块新鲜组织（5 mm)，4%4%多聚甲醛或多聚甲醛或PLPPLP固定液固定液固定固定4 4
6、小时小时2.2.梯度蔗糖替代梯度蔗糖替代 10蔗糖/0.01M PBS 4hrsovernight （15蔗糖/0.01M PBS 4hrsovernight）20蔗糖/0.01M PBS 4hrsovernight3.吸干水分、OCT包埋、液氮冻结4.塑料袋或盒包装，80保存5.冰冻切片（510um）6.风干过夜（电风扇，室温）7.常规染色、或密封后30冰箱保存2.2.2 2.2.2 冰冻包埋的注意事项1.尽早冻存，避免自溶和抗原移位。2.组织宜小、薄，保证冻存效果。3.滤纸吸去水份，清除脂肪4.自制包埋盒（铝箔）、冰冻专用塑料盒5.排除气泡，抚正组织6.激光打印标签或记号笔标记7.7.扶正
7、组织，确定包埋面扶正组织，确定包埋面，快速冻结快速冻结冰冻切片流程和用具2.1.3 常用的组织学染色 H.E van Gieson Elastica van Gieson(ETVG)Masson trichrome Elastic Masson Goldner modified Picrosirius red Movat pentachrome PTAH Oil Red OH.E Masson 三色染色Elastica-van Gieson 染色天狼星红染色天狼星红染色 一种敏感的胶原显示方法 利用胶原的折光特性不同而区分不同组分 I型胶原（黄红色）III型胶原（绿色）IV型胶原（无折光）偏振
8、光显微镜 线性偏振（暗背景）环形偏振（亮背景）PTAHMovat五色套染黑色=弹力纤维 细胞核黄色=胶原纤维砖红=肌纤维蓝色=粘液鲜红=纤维素、红细胞、2.2 2.2 免疫组织化学技术1.免疫组织化学染色的特点2.抗体稀释度计算3.鼠对鼠（MOM）方法4.BrdU标记与染色5.质控与标准化2.2.1 免疫组织化学的特点1.较敏感的方法，且敏感度逐步提高2.定位优势，可达亚细胞水平3.共定位反映分子的空间关系4.追踪分子的动态变化（功能免疫组化）实验原则 选择合适的方法、获得最好的结果1.明视野显微镜，便于形态学分析2.适合低倍率的组织学分析3.无荧光衰减，可永久保存4.显色底物致癌性和毒性2.
9、2.1 酶标免疫组化的优势与注意点2.2.2 抗体稀释度的计算 抗原抗体反应的浓度依赖性2.2.2 抗体稀释度的计算非特异与特异性结合的不同特点非特异与特异性结合的不同特点2.2.2 抗体稀释度的计算影响因素1.抗原密度2.制样对抗原影响3.抗体亲和力4.染色方法的敏感度厂家建议稀释度摸索试验1:25,1:50,1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600一般法则1.一抗工作浓度 15 mg/ml.2.二抗工作浓度 510 mg/ml.计算公式 X=(A*B)/CA，最终工作液容量B，工作液抗体浓度C，原液抗体浓度X，需要的原液容量 2.2.3 MOM方法（二抗非特异结合问题）
10、2.2.3 MOM方法（解决办法）2.2.4 BrdU 标记和染色技术特点1.Cell proliferation activity 2.Non-radiative method标记流程1.Intraperitoneal injection of BrdU 12 h before sacrifice;2.Fixation3.DNA denaturalization in HCl4.Blocking with normal serum.5.Incubation with anti-BrdU antibody6.HRP conjugated secondary antibodies7.Visual
11、ization with DAB or fluorescentMouse intestineMouse model of atherosclerosis2.2.4 BrdU 标记和染色2.2.5 质控与标准化1.全流程的质控（从取材固定开始）2.使用合格的和标准化的试剂和器材3.严格按染色规程操作4.设立试剂和组织对照5.人员的培训，做到染色结果的正确判读。2.3 2.3 电子显微镜技术1.电镜原理2.样品制备特点3.电镜应用实例4.特殊的电镜技术5.应用策略与差错的预防透射电镜扫描电镜2.3.1 2.3.1 电镜工作原理电镜工作原理2.3.2 电镜制样特点光镜光镜透射电镜透射电镜扫描电镜扫描
12、电镜1次固定（甲醛/多聚甲醛）2次固定前固定（多聚甲醛、戊二醛）、后固定（锇酸）1次固定（戊二醛）脱水脱水脱水透明（二甲苯）浸透（丙酮/环氧树脂）替代（醋酸异戊酯）包埋（石蜡）包埋（环氧树脂）/切片（210 um）半薄切片（2 um）/超薄切片（50 80 nm）/临界点干燥（CO2）染色（生物染料）染色（铅、铀）真空喷镀切片铜网样品托2.3.3 电镜应用实例血管的腔面结构血管支架内皮化组织工程化（体外内皮化）支架人工血管材质及表面特性材料损伤与反应（血液相容性）心肌细胞亚细胞结构与心房肽颗粒心肌细胞再生（干细胞分化研究）心肌细胞凋亡实验性病毒性心肌炎心肌缺血再灌注损伤动脉粥样硬化与单核巨噬细
13、胞铁标记2.3.4 特殊的电镜技术/血管铸型2.3.4 特殊的电镜技术血管内皮细胞硝酸银染色2.3.4 特殊的电镜技术免疫金与纳米金标记比较2.3.4 特殊的电镜技术/免疫金标记Dystrophin2.3.4 特殊的电镜技术免疫金标记（双标，10 nm，20 nm）2.3.4 特殊的电镜技术/纳米金标记 纳米金颗粒与免疫球蛋白Fab片段结合而成。探针较小、穿透力强，易获得阳性结果 银增强和金调色的应用使信噪比大大增强。分辨率大大提高Anti collagen IV Anti connexin 262.3.4 特殊的电镜技术免疫金标记电镜的特点1.高分辨率（纳米级）2.特异抗原亚细胞水平的定位
14、3.半定量及动态变化分析4.可双标或多重标记2.3.4 特殊的电镜技术/免疫金标记样品处理的矛盾样品处理的矛盾1.超微形态的保存2.抗原性的保存改善或解决改善或解决办法办法1.低浓度戊二醛或多聚甲醛2.避免锇酸后固定3.缩短脱水时间4.低温聚合5.蚀刻（NaOH 或 H2O2）2.3.5 电镜实验策略1.不能脱离光镜层次；2.定性作用大于定量作用；3.电镜半定量/评分时，注意方法的通用性，并尽量减少组别；4.电镜观察的局限性，避免以偏概全；5.注意送检样品的要求，保鲜、防冻。2.3.5 电镜实验策略心肌缺血再灌注损伤的评分标准2.3.5 电镜实验策略冰晶的影响与细菌污染2.4 2.4 形态定量
15、学1.体视学方法2.计算机辅助图像分析3.免疫组织化学定量2.4.1 体视学方法（Stereology）特点1.传统、有效的方法2.由二维结构信息定量推论三维结构信息基本方法1.点计数2.交点计数3.截面计数4.切线计数5.横穿点计数6.截面面积周长测量7.平均截距测算8.截面平均卡规直径测算9.切片厚度测试参数类别1.密度参数2.尺寸参数3.形状参数4.分布参数5.结构成分总量2.4.2 计算机辅助图像分析特点 高效 简便常用软件 Image Pro Plus NIH Image Scion Image Photoshop2.4.3 免疫组织化学定量可测参数1.染色分布（面积测量）2.阳性细
16、胞的比率（计数测量）3.染色强度（光密度测量）实现方式 计算机辅助的图像分析实际价值1.半定量（不如 Western Blot）2.不能替代生化定量2.4.3 免疫组织化学定量精确定量的前提 抗原浓度与免疫组化产物浓度直线或近似直线相关。要求最优的酶浓度和显色时间。可重复性。要求标准化染色流程。要求在同一批动物实验、同一批次试剂内定量。其它要求：不要衬染，多重标记时不要选用不易定量的非光谱终产物色（棕色、紫色）2.4.3 免疫组织化学定量（eNOS染色光密度定量实例）关键步骤1.心肌细胞选区2.测量选区光密度3.无心肌细胞选区4.以无心肌细胞区光密度（背景）校正心肌细胞区光密度方法优势 解决组
17、织或组织染色的非均质性 具有较高的室间和室内可信度（可重复性）3.0 3.0 模式动物的病理学评价1.急性心肌缺血/再灌注2.慢性心肌缺血3.病毒性心肌炎4.心肌肥厚5.动脉粥样硬化6.肺动脉高压7.心血管植入器材3.1 急性心肌梗死的病理学评价心肌梗死的显示心肌梗死的显示 四唑类染料 TTC 或 NBT 存活心肌（有脱氢酶）红色 坏死心肌（无脱氢酶）不着色 用于显示严重的不可逆的心肌损伤 脱氢酶的丢失缓慢，结果要再灌注数小时后才显示缺血危险区的显示缺血危险区的显示 依文氏蓝（Evens Blue）或台盼蓝（Trypan Blue）直接冠脉灌注 非缺血区 染色 缺血区域 不染色 用于显示心肌缺
18、血并可能发生坏死的组织总量3.1 急性心肌梗死的病理学评价显示实例 1（猪）前降支阻断1h 再灌注3h Ri 缺血危险区 NE 坏死区 红四氮唑 依文氏蓝3.1 急性心肌梗死的病理学评价显示实例 2（大鼠）25 min LAD occlusion+2 h reperfusion例1例23.1 急性心肌梗死的病理学评价原始参数1.缺血危险区 Area of Risk(AR)2.坏死区 Area of Necrosis(AN)计算方法 各层病变面积之和/各层心壁断面之和梗死灶大小 1.坏死区占全心的百分比2.坏死区占左室的百分比3.坏死区占缺血危险区的百分比3.1 急性心肌梗死的病理学评价小动物心
19、脏的切取法 切取方法1.冷冻法（20C）2.琼脂包埋法3.直接切取法4.石蜡包埋组织切片法 组织片厚度 1 mm 至 2 mm 多切面评价 心尖至基底部等距离横断心脏，共5至6个切面 单切面评价 心尖与结扎点的中点横断面，或左室中点横断面3.1 陈旧性心梗的病理学评价周长测量法代替面积测量法3.2 慢性心肌缺血的组织学评价形态定量指标1.心肌纤维化2.侧支循环（左图）3.新生血管密度4.细胞增殖标志物5.心肌超微结构变化3.3 病毒性心肌炎的病理学评价主要项目1.心肌损伤的病理学评分2.病毒蛋白免疫组织化学检测3.病毒核酸的原位检测4.细胞损伤或病毒入侵的电镜观察3.3 病毒性心肌炎的病理学评
20、价心肌损伤的分级或评分0=无炎症;1=1至5个单个核细胞浸润灶，但病灶面积不足切片面积的5%;2=大于5个单个核细胞浸润灶，但病灶面积介于切片面积的5%至 20%;3=弥漫单个核细胞浸润，但病灶面积超过切片面积的 20%，但不伴心肌坏死;4=弥漫单个核细胞浸润，伴心肌坏死。3.4 心肌肥厚的病理学评价主要项目1.心脏重量/左室重量2.心肌细胞大小（横断面面积）3.心肌纤维化程度3.5 心肌肥厚的病理学评价心肌细胞大小的测量参数1.细胞直径2.细胞横断面面积注意点 心肌纤维的切面差异 纵切面（正切）横切面（正切）斜切面（多见）细胞大小的区域差异 心内膜侧心外膜侧 左室右室 细胞分界不清 制片、种
21、属Laminin 免疫组化染色3.5 心肌肥厚的病理学评价心肌纤维化的定量替代性纤维化间质纤维化血管旁纤维化3.6 动脉粥样硬化的测量（家兔）3.6 动脉粥样硬化的测量（家兔）3.6 动脉粥样硬化的测量（小鼠）主动脉窦主动脉窦全主动脉全主动脉3.7 肺动脉高压的组织学测量常用参数1.动脉中膜厚度（%）测量法1.厚度（/直径）直接测量2.面积转换血管选择1.管径范围2.视野数量3.血管数量3.7 肺动脉高压的组织学测量 腺泡前肺动脉/肌性动脉（终末细支气管以上）腺泡内肺动脉腺泡内肺动脉 /肌性或半肌性动脉（终末细支气管以下），在肺血流动力学中作用更重要。1.肌型、半肌型和无肌型动脉的构成（%）2.管径100 m动脉中，肌型动脉所占百分比3.8 心血管植入器材的病理学评价主要试验器材1.人工瓣膜2.血管内支架3.人工血管3.瓣膜成形环4.封堵器5.心脏(起搏)电极6.射频或冷冻治疗仪3.8 心血管植入器材的病理学评价评价原则1.生物相容性为主、疗效评价为辅2.规范剖解，注意大体改变3.扫描电镜为必选项目4.注意区分手术损伤、异物反应、自发疾病注意事项1.熟悉器材结构和术式2.保持心腔和血管腔清洁（抗凝/涮洗）3.禁止用力牵拉和挤压血管可降解支架的降解过程（偏振光形态观察）成型环的临床前病理学评价主动脉支架与夹层封堵器室间隔封堵器的临床前病理学评价
