1、蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第第 三三 节节（一）一级结构是（一）一级结构是空间构象空间构象的基础的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 构型构型(Configuration)(Configuration)：指指分子中各个原子或基团特分子中各个原子或基团特有的固定的空间排列。有的固定的空间排列。立体异构体中取代基团或立体异构体中取代基团或原子因受某种因素的限制，在空间取不同位置就原子因受某种因素的限制，在空间取不同位置就形成的不同立体结构。构型的改变涉
2、及共价键的形成的不同立体结构。构型的改变涉及共价键的断裂，也断裂，也往往使分子的化学活性发生变化。往往使分子的化学活性发生变化。构象构象(Conformation)(Conformation)：分子中不同碳原子上的各原分子中不同碳原子上的各原子或基团的空间排列关系，即不要改变共价键就子或基团的空间排列关系，即不要改变共价键就可以使分子的立体结构发生改变，此立体结构就可以使分子的立体结构发生改变，此立体结构就称构象。称构象。蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；基础，一级结构决定空间结构；一级结构并非决定空间结构的唯一因素。一级结构并
3、非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。空间结构是生物活性的直接体现。牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性1、不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不、不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能同结构不同功能【举例举例】胰岛素胰岛素（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系 表中九种动物之间胰岛素分子一级结构中存在的氨基酸残基组成的差异不影响胰岛素的生物活性。临床上曾经应用猪和牛的胰岛
4、素治疗人的糖尿病，取得了显著的疗效。来 源胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分A5 A6 A10 A30人 Thr Ser Ile Thr猪 The Ser Ile Ala狗 Thr Ser Ile Ala兔 Thr Ser Ile Ser牛 Ala Ser Val Ala羊 Ala Gly Val Ala马 Thr Gly Ile Ala抹香鲸 Thr Ser Ile Ala 鲸 Ala Ser Thr Ala 2、同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间、同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构结构【举例举例】酶原激活、蛋白变性与复性酶原激活、蛋白变性与复性 天然状态，天然状态，有催化
5、活有催化活性性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性3、保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨、保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变基酸不变，功能不变【举例举例】分子病分子病N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。镰刀形红细胞贫血症原因：链第6位由Glu6 Va
6、l6。4、氨基酸序列提供重要的生物进化信息、氨基酸序列提供重要的生物进化信息【举例举例】细胞色素细胞色素c真菌植物蝗虫苍蝇蜜蜂蛾,天蛾海星七鳃鳗角鲨昆虫类软骨鱼类响尾蛇龟企鹅鸡、火鸡鸵鸟鸸鹋鸟类和与爬行类鸽鸭蚯蚓牛蛙金枪鱼鲤鱼两 类硬骨鱼类河马狗、海豹、蝙蝠马、猪、羊、牛小鼠兔人类、猩猩猴袋鼠哺乳类513718169168239228973164618161111112161354231112229 0 1 0 12 11 011 10 1 010 9 3 2 0 11 10 6 5 3 010 9 5 4 2 3 0 9 8 6 5 4 5 2 0 10 11 7 8 6 7 6 6 0 1
7、3 12 11 10 9 10 9 8 12 013 12 12 11 10 10 9 8 10 2 011 10 10 9 8 8 7 6 10 3 3 0 14 15 22 21 20 21 19 18 21 19 20 17 0 15 14 11 10 9 9 8 9 11 8 8 7 22 018 17 14 13 11 12 11 11 13 11 12 11 24 10 021 21 19 18 17 18 17 17 18 17 18 17 26 18 15 027 26 22 22 22 21 22 21 24 23 24 22 29 24 22 24 031 30 29 28
8、 27 25 27 26 28 28 27 27 31 28 29 32 14 0人,猩猩猕猴马驴猪、牛、羊狗小灰鲸兔袋鼠鸡、火鸡企鹅北京鸭响尾蛇啮龟牛蛙金枪鱼螺旋蝇蚕蛾 蚕蛾螺旋蝇金枪鱼牛蛙啮龟响尾蛇北京鸭企鹅鸡，火鸡袋鼠兔 小灰鲸狗猪牛羊驴马猕猴人，猩猩人与一些动物细胞色素人与一些动物细胞色素C一级结构氨基酸差异的数量比较一级结构氨基酸差异的数量比较5 5、一级结构差别很大的蛋白质可能有相似的一级结构差别很大的蛋白质可能有相似的空间结构空间结构【举例举例】磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶 磷酸丙糖异构酶磷酸丙糖异构酶 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 二、蛋白质的功能依赖特定空间结
9、构二、蛋白质的功能依赖特定空间结构 体内蛋白质所具有的特殊的生理功能都与其体内蛋白质所具有的特殊的生理功能都与其所具有的特定的空间构象有密切关系的。所具有的特定的空间构象有密切关系的。例如：角蛋白例如：角蛋白 丝心蛋白丝心蛋白（一）肌红蛋白的空间结构与功能的关系肌红蛋白的空间结构与功能的关系 肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin,Mbmyoglobin,Mb）是由）是由153153个氨基酸个氨基酸残基组成的单一多肽链的蛋白质，含残基组成的单一多肽链的蛋白质，含8 8个个 螺旋螺旋（A A、B B、C C、D D、E E、F F、G G、H H），其辅基为血），其辅基为血红素。红素。NNNNO
10、HOHOONNFe2+O2NNF8 HisE7 HisIIIIIIIV血红素结构与氧结合模示图 血红素是4个吡咯环通过4个甲炔桥相连形成的平板状铁卟啉化合物，2价铁离子居于卟啉环的中央。铁离子有6个配位键，其中4个配位键与4个吡咯环的N原子相连接，1个与F8（-螺旋F中第8个残基）组氨酸（93）相结合，氧分子则与第6个配位键相结合，并与E7组氨酸（64）相接近。血红素未结合氧时，Fe偏离卟啉平面约0.06nm，偏向-螺旋F8组氨酸侧，当结合氧后，Fe被拉入卟啉环中，这样带动F8发生位移，进而引发一系列构象改变。血红蛋白肌红蛋白结合氧释放氧 肌红蛋白与血红蛋白的氧解离曲线肌红蛋白的氧饱和曲线为距
11、形双曲线,血氧饱和度为20%时仍能带氧,肌肉缺氧时(氧饱和度为5%)大量释放氧,以供肌肉收缩需要;血红蛋白的氧饱和曲线为S形曲线,表明血红蛋白四个亚基对氧的结合具有正协同效应。（二）血红蛋白空间结构与功能的关系（二）血红蛋白空间结构与功能的关系 成人血红蛋白由2个亚基与2个亚基组成的四聚体（22），每个亚基含1个血红素分子。血红蛋白每1个亚基可结合1个氧分子。氧分子与血红蛋白的结合具有正协同效应。紧张态（T态）：铁原子偏离卟啉平面约0.06nm,偏向F8 His侧，11与22呈双重对称排布，对氧的亲和力低。松弛态（R态）：铁原子被氧分子拉入卟啉环中，牵动作用Hb亚基三维结构发生改变，亚基间 盐
12、键断裂，亚基间结合疏松，11与22 之间移位15，对氧的亲和力高。血红蛋白T态与R态血红蛋白4个亚基的排布是1/1和22呈双重对称排布。紧张态（T态）Hb对氧的亲和力低。当血红蛋白结合氧时，由于铁离子的位移带动-螺旋F做相应的移动，进而引发亚基间的盐键断裂，使亚基间的结合松弛，1/1和22之间移位15；松弛态（R态）的Hb亚基对氧的亲和力高，容易与氧结合。1511222112+O2 O2T态R态 脱氧血红蛋白各亚基内和各亚基间的盐键NH3+NH3+NH3+NH3+COOCOOCOOCOOCOOCOO天冬94组146赖40精141天冬126精天冬141126赖40组146天冬942112 血红蛋
13、白四个亚基之间和亚基内共有8个盐键。在血红蛋白结合氧时，由于亚基的变构和亚基间的协同效应，亚基间的盐键一一断开，使血红蛋白由T态构象转变为R态构象。Hb氧合与脱氧的构象转换：Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合，Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百分数的百分数（称（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线协同效应协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体
14、结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative cooperativity)变构效应变构效应(allosteric effect)蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发
15、生改变，从而促使生物学活性变化的现象称发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为为变构效应变构效应。包括。包括正协同、负协同效应正协同、负协同效应（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象病蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生，此类疾病称为疾病发生，此类疾病称为蛋白质构象病蛋白质构象病。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病痴呆症、亨停顿
16、舞蹈病（Huntington disease）、疯牛病等。疯牛病等。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀淀粉样纤维沉淀，产生毒性而，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。变。例如：疯牛病中的蛋白质构象改变例如：疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)(prion protein,PrP)引起的一引
17、起的一组人和动物神经退行性病变。组人和动物神经退行性病变。朊病毒蛋白（朊病毒蛋白（prion protein,PrPprion protein,PrP）是正常存在于人是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白。（由诺奖得主白。（由诺奖得主S.PrusinerS.Prusiner发现命名的）发现命名的）朊病毒（朊病毒（prion,PrPscprion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（是正常朊病毒蛋白（PrPcPrPc）的空间构象由的空间构象由 螺旋变成螺旋变成 折叠所致。朊病毒本身不能自折叠所致。朊病毒本身不能自我复制（不含核酸
18、），但可以攻击大脑的正常朊病毒蛋我复制（不含核酸），但可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体。此二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体。周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病变。退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋Pr
19、Psc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病正常朊病毒蛋白结构正常朊病毒蛋白结构（显示（显示-螺旋螺旋）朊病毒结构朊病毒结构（显示（显示-片层结构片层结构）第四节第四节蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein一、蛋白质的两性电离一、蛋白质的两性电离1.1.可解离基团可解离基团 :-COOH -COOH 、非、非-COOH-COOH（Asp Asp、Glu)Glu)、-NH-NH2 2、非非-NH-NH2 2(Lys)(Lys)、咪唑基
20、、咪唑基 (His)(His)、-SH(Cys)-SH(Cys)、胍基胍基 (Arg)(Arg)2.2.等电点：等电点：当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成正、时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的为零，此时溶液的pHpH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)(isoelectric point,pI)。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的
21、直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的沉淀溶液中蛋白质的沉淀(蛋白质未变性蛋白质未变性)三、蛋白质的变性、沉淀和凝固三、蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质的变性蛋白质的变性(denat
22、uration):在某些物理在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。变性的本质变性的本质:破坏非共价键和二硫键，不破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。改变蛋白质的一级结构。造成变性的因素造成变性的因素(1)(1)物理因素：物理因素：加热、加热、X X射线、紫外线射线、紫外线 、超声波、剧烈搅拌、超声波、剧烈搅拌等。等。(2)(2)化学因素：化学因素：强酸、强碱、尿素、乙醇、重金属离子、三强酸、强碱、尿素、乙醇、重金属离子、三氯醋酸等。氯醋酸等。应用举例
23、应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation)。但是许多蛋白质变性后，空间结构严重但是许多蛋白质变性后，空间结构严重被破坏，不能复原，这样的蛋白质变性称为被破坏，不能复原，这样的蛋白质变性称为不可逆变性不可逆变性。天
24、然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝
25、块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。变性变性物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等沉淀改变pH至pI破坏水溶液中蛋白质的水化膜和中和电荷（变性蛋白质）（蛋白质未变性）凝固加热加热（变性，不再溶解）变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固均变性并不溶解加热加热四、蛋白质的紫外吸收四、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中由于蛋白质分子中含有共轭双键的含有共轭双键的Tyr和和Trp，因此在，因此在280nm波波长处有特征性吸收峰。长处有特征性吸收峰。蛋
26、白质的蛋白质的OD280与其浓与其浓度呈正比关系，因此可度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。作蛋白质定量测定。280nm五、蛋白质的呈色反应五、蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解
27、程度。程度。茚三酮反应茚三酮反应3 3、酚试剂呈色反应（、酚试剂呈色反应（Lowry testLowry test）：）：除蛋白质分子中肽键与碱性除蛋白质分子中肽键与碱性Cu2+Cu2+发生双缩脲发生双缩脲反应外，蛋白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基反应外，蛋白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基还将试剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色还将试剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化合物（钼蓝）化合物（钼蓝）4.4.染料结合法（染料结合法（BradfordBradford法）法）蛋白质与考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250G-250反应反应亮蓝色化合亮蓝色化合物，在物，在595nm595nm处有最大吸收。在一
28、定蛋白质浓度处有最大吸收。在一定蛋白质浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间线性关系。范围内，吸收强度与蛋白质含量之间线性关系。第五节第五节蛋白质的分离纯化与结构分析蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation,Purification and Structure Analysis of Protein 蛋白质的理化性质与常用的纯化方法蛋白质的理化性质与常用的纯化方法 蛋 白 质 的 理 化 性 质 常 用 的 纯 化 方 法分 子 质 量 离 心 凝 胶 过 滤 透 析、超 滤电 荷 离 子 交 换 层 析 电 泳 等 电 聚 焦溶 解 度 调 整 pH 调 整 离 子 强 度 降
29、低 介 电 常 数特 异 结 合 部 位 亲 和 层 析 亲 和 洗 脱其 他 性 质 吸 附 层 析 液 相 层 析 气 相 层 析一、蛋白质的分离和纯化一、蛋白质的分离和纯化蛋白质粗制品分离的一般步骤蛋白质粗制品分离的一般步骤:1.1.材料的预处理及细胞破碎材料的预处理及细胞破碎 材料必须新鲜，蛋白质含量高。材料必须新鲜，蛋白质含量高。机械破碎法机械破碎法 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。渗透破碎法渗透破碎法 利用低渗条件使细胞溶胀而破碎。利用低渗条件使细胞溶胀而破碎。反复冻融法反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细生物组织经冻结后，细胞内液结
30、冰膨胀而使细胞胀破。胞胀破。对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。超声波法超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。细胞破碎。酶法酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。如用溶菌酶破坏微生物细胞等。2 2、蛋白质的抽提、蛋白质的抽提:抽提：把生物物质从生物组织中以溶解状态释放出来。抽提：把生物物质从生物组织中以溶解状态释放出来。根据所要制备的蛋白质的性质，可选择合适的溶剂将蛋白根据所要制备的蛋白质的性质，可选择合适的溶剂将蛋白质与其他杂质分开。质与其他杂质分开。抽提液抽提液=离子强度调节剂离子强度调节剂
31、+pH+pH缓冲剂缓冲剂 +温度效应剂温度效应剂 +蛋蛋白酶抑制剂白酶抑制剂 +抗氧化剂抗氧化剂 +重金属络合剂或重金属重金属络合剂或重金属 +增溶增溶剂剂 膜蛋白的抽提膜蛋白的抽提:加入表面活性剂加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠、tritonX-tritonX-100100等等)膜结构破坏膜结构破坏蛋白质与膜分离。蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等以防止蛋白在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等以防止蛋白质的变性。质的变性。3.3.蛋白质粗制品的获得蛋白质粗制品的获得:等电点沉淀法：盐浓度要尽量低。等电点沉淀法：盐浓度要尽量低。盐析法：分级盐析，常用硫酸
32、铵（溶解度大，受温度影响盐析法：分级盐析，常用硫酸铵（溶解度大，受温度影响小）。小）。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，可与水混溶，中性有机溶剂如乙醇、丙酮，可与水混溶，能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低；有机溶能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低；有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水化层。剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水化层。注意：易变性，宜低温下进行。注意：易变性，宜低温下进行。（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法透析透析(dialysis)(dialysis)：1.1.利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开利用透析袋把大分子蛋白质与小分子
33、化合物分开的方法称为透析。的方法称为透析。2.2.透析袋：用具有超小微孔的膜如硝酸纤维素膜制透析袋：用具有超小微孔的膜如硝酸纤维素膜制成，微孔仅允许分子量小于成，微孔仅允许分子量小于10kD10kD的化合物通过。的化合物通过。蛋白质常用的纯化方法：蛋白质常用的纯化方法：磁力搅拌器透析前透析后透析袋透析透析超滤法超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。白质溶液的目的。磁力搅拌器待超滤的蛋白质溶液加压的氮气超滤膜（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用
34、使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。此外，也可质被丙酮沉淀后，应立即分离。此外，也可用乙醇沉淀。用乙醇沉淀。*盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。*免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物将某一纯化蛋白质免疫动物,可获得抗该蛋白的特异抗体。利用
35、特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。（三）电泳（三）电泳蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物的不同，可分
36、为薄膜电泳、凝胶电泳等。胶电泳等。（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析离子交换层析()：利用各
37、蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利用利用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。目目 录录目目 录录（五）超速离心（五）超速离心*超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。*蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示表示,沉降系沉降系数与蛋白质的密度和
38、形状相关数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数因为沉降系数S大体上和分子量成正比大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。根据转速分类：根据转速分类：常用离心机常用离心机 10 000 rpm50 000 rpm50 000 rpm蛋白质纯度的鉴别标准蛋白质纯度的鉴别标准 可通过电泳或层析的方法鉴定蛋白质纯度可通过电泳或层析的方法鉴定蛋白质纯度 纯度是相对的。纯度是相对的。1.1.在不同在不同pHpH条件下电泳，蛋白质呈现一条分
39、离带。条件下电泳，蛋白质呈现一条分离带。2.2.等电聚焦电泳，蛋白质呈现一条分离带。等电聚焦电泳，蛋白质呈现一条分离带。3.3.纯化后，蛋白质应保留活性。纯化后，蛋白质应保留活性。4.4.在超速离心场中，蛋白质以单一的沉降速度运动。在超速离心场中，蛋白质以单一的沉降速度运动。50372575100 1 2 3 4 5 6Mass(kDa)蛋白分离纯化效果电泳示意图二、多肽链中氨基酸序列分析二、多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的测定多肽链的N N端与端与C C端氨基酸残基端氨基酸残基(Dansyl-氯法氯法,羧肽酶羧肽酶法法)把肽链
40、水解成片段把肽链水解成片段 (胰蛋白酶法胰蛋白酶法,胰凝乳蛋白酶法胰凝乳蛋白酶法,溴化氰溴化氰法法)测定各肽段的氨基酸排列顺序测定各肽段的氨基酸排列顺序(Edman降解法降解法)一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。(一一)分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定他们的量，子交换树脂将各
41、种氨基酸分开，测定他们的量，计算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或者个数。计算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或者个数。(二二)末端分析末端分析1.N-1.N-末端测定末端测定(1)2,4-(1)2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（FDNBFDNB）法）法(2)(2)丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法优点：优点：DNSDNS试剂是荧光试剂，灵敏度高试剂是荧光试剂，灵敏度高100100倍。倍。FDNB法法:二硝基氟苯二硝基氟苯二硝基苯二硝基苯AA Dansyl-氯法氯法2.C-末端测定末端测定:羧肽酶法羧肽酶法 羧肽酶羧肽酶A:作用于除作用于除Arg，Lys，Pro和和Hyp外的所有氨外的所有氨基
42、酸（基酸（C端倒数第二个是端倒数第二个是Pro时除外）。时除外）。羧肽酶羧肽酶B:作用于作用于Lys和和Arg（C端倒数第二个是端倒数第二个是Pro时时除外）。除外）。（三）肽链的拆分（三）肽链的拆分1.1.非共价键肽链拆分非共价键肽链拆分:蛋白质变性剂。蛋白质变性剂。2.2.二硫键的拆分二硫键的拆分(1)(1)还原法还原法:巯基化合物还原成巯基，再用碘乙酸乙酰化保巯基化合物还原成巯基，再用碘乙酸乙酰化保护。护。(2)(2)氧化法：氧化法：过甲酸（过甲酸（HCOOOHHCOOOH）二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇碘乙酸碘乙酸乙酰化乙酰化过甲酸过甲酸（四）肽链的部分水解和肽段的分离四）肽
43、链的部分水解和肽段的分离1.溴化氰（溴化氰（CNBr）裂解法）裂解法:专一水解专一水解Met的羧的羧基端基端3.胰凝乳蛋白酶法水解法胰凝乳蛋白酶法水解法:水解芳香族氨基酸（水解芳香族氨基酸（Phe,Tyr,Trp）2.胰蛋白酶（胰蛋白酶（Trypsin）水解法）水解法:（五）肽段的氨基酸排列顺序的测定（五）肽段的氨基酸排列顺序的测定 以以Edman降解法为基础的氨基酸人工或自动测降解法为基础的氨基酸人工或自动测序序苯乙内酰苯乙内酰硫脲丙氨酸硫脲丙氨酸异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰基肽苯氨基硫甲酰基肽通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演
44、出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列三、蛋白质空间结构测定三、蛋白质空间结构测定*二级结构测定二级结构测定通常采用通常采用圆二色光谱圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的螺旋的CDCD峰有峰有222nm222nm处的负峰、处的负峰、208nm208nm处的处的负峰和负峰和198 nm198 nm处的正峰三个成分；而处的正峰三个成分；而-折叠的折叠的CDCD谱不很固定。谱不很固定。*三级结构测定三
45、级结构测定X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共和核磁共振技术振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。空间结构。根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系
46、，总结出规律，出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。用于新的蛋白质空间结构的预测。1 1、同源建模，、同源建模，2 2、折叠识别，、折叠识别，3 3、从无到有、从无到有本章要求本章要求1 1、名词：、名词：isoelectric pointisoelectric point；motifsmotifs；domain;subunitdomain;subunit；allosteric effect;allosteric effect;protein denaturation;molecular diseaseprotein denaturation;molecular
47、 disease；proteomicsproteomics2 2、结构层次、结构层次元素组成：元素组成：C C、H H、O O、N N（16%16%）、）、S S结构单位：结构单位：2020种种L-L-氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等）等）一级结构一级结构：肽键；多肽链；肽键；多肽链；N N端端C C端端二级结构：稳定力（氢键）；类型（二级结构：稳定力（氢键）；类型（螺旋，螺旋，折叠，折叠，转角，无转角，无规卷曲）规卷曲）三级结构特点、四级结构特点三级结构特点、四级结构特点3 3、重要性质：、重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性4 4、分离纯化：、分离纯化：透析、透析、超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛分子筛层析层析5 5、结构与功能关系（举例）、结构与功能关系（举例）
