1、 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU动物实验的基本知识与操作技术（Basic knowledge and technology for animal test）王 安8/6/2022 11:17 AM1 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM2【目的要求】掌握动物实验的目的、要求与局限性，以及3R原则；了解动物实验设计的基本原则与方法；熟悉动物实验常用的动物选择、动物的编号和随机分组、染毒方法等技术；熟
2、悉常用生物材料的采集。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU.动物实验的基本知识 1.动物实验的目的、要求与局限性 2.动物实验的职业道德-3R原则 3.动物实验设计的基本原则与方法.动物实验的操作技术 1.健康动物的选择，动物的抓取与固定 2.动物的性别与日龄鉴定 3.动物的标记与编号 4.给药途径(口、呼吸道)5.生物材料的收集(血液、尿液)6.动物的处死及生物材料的采集8/6/2022 11:17 AM3【主要内容】Department of Health ToxicologySchool of Public
3、Health,CSU8/6/2022 11:17 AM4Part.动物实验的基本知识 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM5实验动物(Laboratory animals)是专门培育供实验用的动物，主要指作为医学、药学、生物学、兽医学等的科研、教学、医疗、鉴定、诊断、生物制品制造等需要为目的而驯养、繁殖、育成的动物。豚鼠 新西兰家兔 ICR小鼠 Wistar 大鼠 Beagle犬 一、动物实验的目的、要求、局限性 Department of Health ToxicologySch
4、ool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM61.动物实验的基本目的评价化学物的生物学效应；阐明可能的机制和影响因素；补充人体资料的不足。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM72.动物实验的基本要求健康(雌性曾交配与未孕)，均一性要求阐明剂量-效应关系，有高剂量接触组尽可能反映人类实际的接触途径 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM
5、83.动物实验的局限性种属外推的不确定性高剂量向低剂量外推的不确定性样本量到大样本外推的不确定性无法观察主观指标 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM9二、动物实验的职业道德-3R原则实验动物在人类认识生命、预防与治疗疾病的医学发展史上，作出了大量牺牲。18世纪哲学家Jeremy指出：问题不在于它们能否思考，也不是它们能否说话，而是它们痛苦不痛苦。19世纪兴起动物保护主义，成立了动物保护组织，并且通过立法来保障动物福利。禁止虐待动物法、科学动物实验法、动物福利法、实验动物管理条例等
6、。给予实验动物人道主义的管理与处理使痛苦与不适感减少到最低限度避免不必要的使用动物 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM101959年英国动物学家William和微生物学家Rex在人性动物实验技术原则一书中提出：“正确的科学实验设计应考虑到动物的权益，尽可能减少动物用量，优化完善实验程序或使用其他手段和材料替代动物实验的3R原则”。1.减少(Reduction)：减少是在满足实验要求，又不损失应得信息的前提下，尽可能减少实验动物的数量；2.优化(Refinement)：优化是在动物
7、实验时，尽可能选择和改良实验操作技术，减轻动物可能遭受的痛苦；3.替代(Replacement)：替代是不通过与动物相关的实验或过程去获取所需的信息。动物实验替代法的3R原则 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM113R原则使全世界的生物化学、药理学、毒理学和生物医学界对替代方法的发展、验证更加关注，因为替代方法的研究不单纯是动物权益保护问题也是科学本身发展的问题，对于建立一个合理的实验设计，使科研更人性化，科学技术更先进化具有重要意义。目前通过正式验证的替代方法有：急性毒性实验：
8、如上、下法、固定剂量法；皮肤腐蚀性：大鼠皮肤经皮电阻实验和人重组皮肤模型实验；皮肤变态反应：小鼠局部淋巴结试验；皮肤光毒性：3T3中性红摄取光毒实验，猪皮经皮吸收实验，诱变和光诱变性实验；胚胎毒性：全胚胎培养、微团实验和胚胎干细胞实验等。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM12三、动物实验设计的原则与方法(一)动物实验设计的基本原则 对照(Control)重复(Repeat)随机(Random)Department of Health ToxicologySchool of Pub
9、lic Health,CSU8/6/2022 11:17 AM131.对照性原则 对照组：在实验过程中不施加处理因素(实验因素)的组别。目的：1.消除或减少非实验因素的影响。2.监控实验条件。方式：自体对照、组间对照。类型：阴性对照、阳性对照、溶剂对照 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM14溶剂与助溶剂选择的基本要求1.无毒或实际无毒2.与受试物不起反应，受试物在溶剂中稳定3.对受试物的毒动学与毒效学没有影响4.无刺激性或气味 Department of Health Toxic
10、ologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM动物实验常用溶剂和赋形剂水：所有途径，首选 生理盐水：除皮肤与眼周外，所有的途径乙醇：用于皮肤与经口，经口限量为5ml/kg丙酮：用于皮肤与经口，经口限量为5ml/kgDMSO：用于所有途径，浓度超过5可增强吸收甘油：用于经口、皮肤、ip、iv(其水溶液)玉米油：用于经口、皮肤、阴道、直肠、皮下聚乙二醇-400：作为助溶剂羧甲基纤维素：0.10.5%水溶液，用于经口凡士林：用于皮肤、阴道、直肠15 Department of Health ToxicologySchool of Public He
11、alth,CSU8/6/2022 11:17 AM162.重复性原则重复：指精确可靠的实验结果，在相同的条件下的一致性，包含重现性和重复数两方面的含义。目的：估计试验误差、增强样本的代表性、提高实验结果的可信度。如何保证重复：1.严格控制实验条件和可能的干扰因素；2.足够数量的实验动物数。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM17实验动物样本数的一般估计试验动物 资料类型 所需动物数目大、小鼠豚鼠犬、猪计量资料 计数资料 计量资料 计数资料 计量资料 计数资料 1030820620
12、Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM183.随机性原则 随机：总体中的所有个体被选取的机会均等。在抽样研究中，样本要想能代表总体，一个重要的原则就是随机化，以实现样本较好的代表性。目的：减少或避免主观因素的影响，提高样本的代表性。随机化的方法：抽签法、随机数字表、随机函数 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM19(二)动物实验设计的主要方法1.配对设计：将受试动物按一定
13、条件配成对子，再随机分配每对中的两个受试动物到不同的处理组。2.随机区组设计：将受试动物按一定的特征划分为若干配伍组或区组，再将机每一配伍组中的各受试动物随机分配到不同的处理组。3.完全随机设计：将受试动物随机地分配不同的处理组。4.拉丁方设计：按拉丁方阵型将受试动物随机的分配到各个处理组（涉及多个因素，且各个因素无交互作用、水平数相等）。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM20Part.动物试验的基本操作技术 Department of Health ToxicologyScho
14、ol of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM21无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求达到：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。健康动物的重要标志如下:1眼睛：明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物；2耳：耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮；3鼻：无喷嚏，无浆性粘液分泌物；4皮肤：无创伤、无脓疮；疥癣、湿疹；5颈部：要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物；6消化道：无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净；7神经系统：无震颤、麻痹。若动物(大鼠、小鼠)出现圆
15、圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动，应放弃该动物；8四肢及尾、四肢、趾及尾：无红肿及溃疡。(一)健康动物的选择 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM22根据实验要求选择性别，实验如果对性别无特殊要求者，宜选雌雄动物各半。（1）大、小鼠 依肛门与生殖孔间的距离区分,间距大者为雄性，小者为雌性。成年雄鼠卧位可见到睾丸，雌性在腹部可见乳头。图1-1 雌雄大、小鼠肛门与生殖孔间距离（二）实验动物的性别和日龄鉴定1.实验动物的性别鉴定 Department of Health ToxicologyS
16、chool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM232.豚鼠：用一只手抓住豚鼠颈部，另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物则显出三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。3.家兔：将家兔头轻轻夹在实验者左腋窝下，左手按住腰背部，右手拉开尾并将尾巴夹在中指和无名指中间，然后用拇指和食指稍稍把生殖器扒开。雄兔即可见到一圆孔中露出圆锥形稍向下弯曲的阴茎(但幼年雄兔看不的阴茎，只能看到圆孔中有凸起物，即是阴茎)。雌兔此处则为一条朝向尾缝，呈椭圆形的间隙，间隙越向下越窄，此即为阴道开口处。图1-2 兔雌雄生殖器外形特征与差异 Depa
17、rtment of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM24日龄(d)体重(g)初生 1.854.0 10 6.015 11.020 15.02521.030 21.0不同日龄KM小鼠的体重2.实验动物(大、小鼠)的日龄鉴定 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM25不同日龄SD大鼠的体重 日龄(d)体重(g)初生 6-71017-25 20 35-5030 55-9040 100-15050150
18、-21060 170-24070210-27080240-320 注：月龄后，雄鼠取上限，雌鼠取下限。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM26正确地抓取固定动物，是为了在不损害动物健康、不影响观察指标、并防止被动物咬伤的前提下，确保实验顺利进行。1.小鼠的抓取与固定 先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上向后拉，其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可固定（图1-3、图1-4）。该固定法常用作小鼠灌
19、胃、腹腔注射、肌肉注射和皮下注射的实验操作。图1-3 在笼盖上抓取小鼠 图1-4 徒手固定小鼠图（三）实验动物的抓取与固定方法 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM272.大鼠的抓取与固定 大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情凶猛，不易用袭击方法抓取。为避免咬伤，可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手可进行各种实验操作（图1-5）。3.豚鼠的抓取与固定 豚鼠胆小易惊，在抓取时要稳、准、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓
20、住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，另一只手托住臀部即可（图1-6）图1-5 大鼠的抓取与固定图1-6 豚鼠抓取固定方法 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM281.动物的编号与标记（四）动物的编号及标记方法根据不同的动物、不同的实验需要和不同的实验方法选择合适的标记方法。不论采用何种标记方法，应遵守的基本原则是：号码清楚、持久、简便、易认和适用。1）临时性标记（1）染色法：染色法是用化学剂在动物身体明显部位如被毛、四肢等处进行涂染，或用不同颜色等来区别各组动物，是实验室最常用、最
21、容易掌握的方法。常用的标记液有：饱和苦味酸酒精溶液(黄色)。0.5%中性红或碱性品红溶液(红色)。2%硝酸银溶液。龙胆紫溶液(紫色)。煤焦油酒精溶液(黑色)。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU2022年8月6日星期六11时17分56秒29Take a break Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM30编号的方法：从头顶部开始，按从右至左顺时针标号。一般把头顶部记为1号，右前腿处记为2号，右侧腹部为3
22、号，右后腿为4号，尾基部为5号，左后腿为6号，左侧腹部为7号，左前腿为8号，腰背部中央为9号。若动物编号超过10或更大数字时，可使 用上述两种不同颜色的溶液，即把一种颜色作为个位数，另一种颜色作为十位数。这种交互使用可编到99号。此法主要用于大、小鼠、豚鼠和白色家兔。图 1-7 大小鼠的染色法标记 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM31（2）涂漆或贴胶布：用油漆在动物角或体表涂漆进行标记，或用胶布贴在动物腿上进行标记，也都是效果较好的临时性标记方法。2）半永久性标记（1）挂耳标签
23、法：挂耳标签法可用来标记多种动物。市售的耳标签一般是由塑料、铝或钢片制成。使用耳标签时必须仔细挑选大小合适的耳标签。通常使用塑料制品。（2）戴项圈法：首先，将号码冲压在圆形或方形金属牌上。金属牌常用铝板或不锈钢制作，长期使用不生锈。然后，将标有号码的金属薄片固定在拴动物的皮带圈上，将此圈固定在动物颈部。3）永久性标记（1）烙印法：（2）针刺法：（3）打耳孔法：Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM32四、大小鼠常用的给药途径经口给药：口服法、喂服法、灌胃法 经呼吸道给药：吸入法(静式
24、、动式)、气管注入 经皮肤给药：涂布给药、浸尾给药注射给药：腹腔注射、静脉注射、皮下注射 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM33（1）喂饲法:把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取，此法的优点是简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于动物疾病的防治、药物的长期毒性观察，以及制造某些人类疾病的动物模型等。（2）口服法:实验者用左手从背部向头部夹紧动物(如豚鼠、兔、犬等)，并用拇指和食指指分别捏紧左、右口角处，让它开口，右手(或助手)用镊子夹住药物送入舌根，关闭嘴唇，让其咽下。
25、（3）灌胃法：灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内，此法剂量准确、操作简便、快速。缺点：对实验动物造成的机械性损伤和心理上的影响；实验人员有被咬伤的危险性。常用灌胃量：小鼠0.2lml，大鼠14ml，豚鼠15ml。(一)经口染毒 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM34大鼠、小鼠灌胃方法成年动物插入的深度一般是：小鼠3cm，大鼠或豚鼠5cm，兔约15cm，犬约20cm。Department of Health ToxicologySchool of Public Heal
26、th,CSU8/6/2022 11:17 AM35(二)经呼吸道给药法(1)静式吸入特点：设备简便、容易操作实验条件不稳定只适应于易挥发液态化合物或一定体积的气态化合物测定。1.吸入给药法系将实验动物置于一个有一定体积的密闭容器内，加入定量的易挥发液态化合物或一定体积的气态化合物，在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境。根据实验所需浓度可用下述公式计算出应加毒物的毫升数。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM36静式给药的装置 Department of Health Toxi
27、cologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM37实验动物最低需气量及不同体积染毒装置放置动物数（注：按接触2小时计算 引自：湖南医科大学卫生学教研室，卫生毒理学试验方法.北京：人民出版社.1971,46）动物种属 呼吸通气 最低需气量 不同容积染毒柜放置动物数（只）(L/小时)(L/小时)25L 50L100L300L小鼠1.45 3.453-5 6-10 12-1536-40大鼠10.1830.50 1125615-18 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU
28、8/6/2022 11:17 AM38(2)动式吸入动式吸入染毒：由染毒柜、机械通风系统和不断补充受试化合物的配气系统组成。面罩吸入染毒：用一个特制的面罩密封实验动物的口鼻部分，使之与恒定供应的受试物接触。两种方式：特点：基本稳定的实验条件适应于各种动物设备较贵 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM39动式染毒装置 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM40动式吸入染毒装
29、置 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM41面罩式吸入染毒装置 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM422.气管注入法在实验动物被麻醉情况下，将已消毒灭菌的受试化合物(粉尘、混悬液或液体)注入气管，使之分布于左、右肺内。这种方式多用于制造急性中毒模型。在经呼吸道急性毒性试验时多采用吸入给药法，因为它更接近机体实际接触情况。Department of Health Tox
30、icologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM43为了鉴定化学物经皮肤的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤染毒。(三)经皮肤染毒 1.斑贴法（家兔）：斑贴法染毒部位为脊柱两侧的背部皮肤，用脱毛剂脱去被毛，洗净脱毛剂后，放回笼内，至少待24h后才可使用。脱毛过程中应特别注意不要损伤皮肤。次日，仔细检查处理过的皮肤是否有刀伤或过度腐蚀的创口，以及有无炎症，过敏等现象。如有，应暂缓使用，待动物完全恢复。如皮肤准备合乎要求，便可将动物固定好，在脱毛区（2cm2左右）均匀涂布受试物，然后用二层纱布覆盖，再用无刺激性胶带固定，保
31、证受试物与皮肤密切接触，防止实验动物舔食。涂布26h后（观察时间视实验需要而定），用温水将皮肤表面仔细洗净，观察皮肤反应。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM44大、小鼠可采用浸尾方式经尾皮给药，主要目的是定性地判断药物经皮肤的吸收作用。先将动物放人特制的固定盒内，露出尾巴，再将尾巴通过小试管软木塞小孔，插入装有药液或受检液体的试管内，浸泡2-6h，并观察其中毒症状。如果是有毒物，实验时要特别注意，避免实验人员因吸入受检液所形成的有毒蒸气而中毒。为此，要将试管的软木塞塞紧，必要时可
32、将受检液表面加上一层液体石腊。2.浸尾给药：小鼠浸尾试验装置 液体石蜡 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM451.皮内注射：兔、豚鼠和大鼠的皮内注射部位均为背部脊柱两侧的皮肤。2.皮下注射：小鼠皮下注射时，通常选用颈背部皮肤。3.腹腔注射：左手用拇指和食指紧紧抓住颈部背侧的松弛皮肤，手掌成杯状紧握鼠背使得腹部皮肤伸展，同时用小指压住尾根，固定好动物。使小鼠腹部抬高，右手将注射器的针头(5号)刺入皮肤。进针部位是距离下腹部腹中线稍向左或右lmm的位置。针头到达皮下后，继续向前进针3
33、5mm，再以45刺入腹肌，针尖通过腹肌后抵抗力消失，固定针尖，缓缓注入药液。为避免刺破内脏，应将动物头部放低，尾部提高，使脏器移向横膈处。小鼠的一次注射量为0.10.2ml/10g体重。4.肌肉注射法 5.静脉注射法:小鼠、大鼠尾静脉注射 兔耳静脉注射 (四)注射染毒 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM46大鼠、小鼠静脉注射方法 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM4
34、7注射方式 小鼠 大鼠 豚鼠 兔 狗 腹腔 0.21.0 13 25 510 515 肌肉 0.10.2 0.20.5 0.20.5 0.51 25 静脉 0.20.5 12 15 310 515 皮下 0.10.5 0.51 0.52 13 310 几种实验动物不同注射途径常用注射量(ml)Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM48五、大、小鼠生物材料的采集(一)血液的采集大鼠尾静脉切割采血 1.尾静脉采血静脉抽血断尾采血切割采血 Department of Health Toxi
35、cologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM49大鼠眼眶后静脉丛采血 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM50动物种类 最大安全采血量(ml)最小致死采血量(ml)小鼠 0.10.5大鼠 12家兔1040 犬 50300不同实验动物的最大安全采血量 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM51(二)尿液的收集 1.代谢
36、笼集采法；2.强制排尿法(压迫膀胱法、膀胱导尿法、膀胱体外穿刺法)；3.采用无菌手术法，制造输尿管瘘和膀胱瘘。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM52代谢笼装置 Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM53六、常用的大小鼠处死方法1.颈椎脱臼法：2.放血法：摘眼球、股动脉、心脏放血3.断头法：4.麻醉法：乙醚吸入、戊巴比妥钠注射 Department of Health T
37、oxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM54注意事项尽量减少动物的痛苦，尽量避免动物产生惊恐、挣扎、叫喊(尽可能的缩短致死时间)。注意实验人员安全，特别是在使用挥发性麻醉剂(乙醚、安氟醚、三氟乙烷)时，并且要远离火源。不能影响动物实验的结果。动物尸体要妥善处理(焚化)。Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM55谈谈你对实验动物3R原则的理解？思考题如何设计药物毒理学动物实验？Department of Health ToxicologySchool of Public Health,CSU8/6/2022 11:17 AM562022-8-656Thank you very much for your attention!
