1、一般一般 一一.概述概述 二二.急性毒性作用急性毒性作用 三三.局部毒性作用局部毒性作用 四四.短期、亚慢性和慢性毒性作用短期、亚慢性和慢性毒性作用 （蓄积性与耐受性）（蓄积性与耐受性）重复暴露毒性重复暴露毒性 一、一般毒性作用概念和意义一、一般毒性作用概念和意义 1.1.确定受试物毒作用表现与性质；确定受试物毒作用表现与性质；2.2.确定受试物毒作用的剂量与反应关系；确定受试物毒作用的剂量与反应关系；获得的参数有：获得的参数有：LDLD5050、LOAELLOAEL、NOAELNOAEL 3.3.确定毒作用靶器官；确定毒作用靶器官；4.4.评价毒性损害的可逆性；评价毒性损害的可逆性；5.5.
2、了解化学药物毒作用的影响因素等。了解化学药物毒作用的影响因素等。第一节第一节 概概 述述二、一般毒性试验的动物选择二、一般毒性试验的动物选择 （一）实验动物选择（一）实验动物选择 1.1.物种物种 与人体生物学特征相似的动物；与人体生物学特征相似的动物；自然寿命不太长的动物；自然寿命不太长的动物；易于饲养与实验操作的动物；易于饲养与实验操作的动物；经济并易于获得的动物。经济并易于获得的动物。（一般选择两个物种进行试验）（一般选择两个物种进行试验）2.2.品系品系 一般在毒理学系列研究中应使用同一品系。一般在毒理学系列研究中应使用同一品系。3.3.级别（级别（质量质量）级（清洁级）或级（清洁级）
3、或级（级（SPFSPF级）的动物级）的动物 4.4.性别性别 受试物毒性如果有性别差异，应选择敏感的性别，受试物毒性如果有性别差异，应选择敏感的性别，若没有应选择两种性别进行试验（若没有应选择两种性别进行试验（/各半各半）。）。5.5.年龄与体重年龄与体重 急性试验急性试验-选择成年动物；慢性试验选择成年动物；慢性试验-刚断乳动物。刚断乳动物。同一性别动物的起始体重差异同一性别动物的起始体重差异。6.6.生理与健康状况生理与健康状况 不选择怀孕、哺乳其动物，须选择健康动物（不选择怀孕、哺乳其动物，须选择健康动物（）。）。（二）染毒方式（二）染毒方式 1.1.呼吸道染毒呼吸道染毒 有：气管注入染
4、毒有：气管注入染毒 吸入染毒（静式与动式两种）吸入染毒（静式与动式两种）2.2.消化道染毒消化道染毒 有：灌胃法、喂饲法和胶囊法。有：灌胃法、喂饲法和胶囊法。3.3.经皮染毒经皮染毒 有：表皮涂药、浸尾法。有：表皮涂药、浸尾法。4.4.注射途径注射途径 有：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内等。有：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内等。一、急性毒性概念一、急性毒性概念 是指是指1 1次接触或次接触或2424小时内多次接触外源化学物小时内多次接触外源化学物在短期内所产生的健康损害作用和致死效应。在短期内所产生的健康损害作用和致死效应。实验效应观察期：实验效应观察期：2 2周。周。2424小时多次染毒：小时多
5、次染毒：毒性很低或溶解度很低的受试物。毒性很低或溶解度很低的受试物。一般规定：一般规定：第二节第二节 急性毒性作用急性毒性作用二、急性毒性试验的目的二、急性毒性试验的目的 1.1.评价急性毒性大小评价急性毒性大小 求出求出LDLD5050、LDLD100100、LDLD0101、LDLD0 0或或MTDMTD、LOAELLOAEL、NOAELNOAEL等。等。2.2.了解急性毒性特征（了解急性毒性特征（）3.3.为亚急性、亚慢性、慢性、致癌等试验提为亚急性、亚慢性、慢性、致癌等试验提供剂量设置的依据。供剂量设置的依据。4.4.为毒作用机制研究提供初步线索。为毒作用机制研究提供初步线索。用用LD
6、LD5050作为剂量参考依据的毒性试验作为剂量参考依据的毒性试验 试验类别试验类别 剂量设组要求剂量设组要求 蓄积毒性试验蓄积毒性试验 1/20-1/51/20-1/5 LDLD5050范围设组范围设组 亚慢性试验亚慢性试验 1/20-1/51/20-1/5 LD LD5050作最高剂量作最高剂量 慢性慢性(致癌致癌)试验试验 1/10 1/10 LDLD5050作最高剂量作最高剂量三、急性毒性试验方法要点三、急性毒性试验方法要点 （一）经典急性毒性试验（一）经典急性毒性试验 （）1.1.检疫观察检疫观察3-5d3-5d，成年健康动物（，成年健康动物（）；）；2.5-72.5-7个剂量组，每组
7、个剂量组，每组1010只动物以上（只动物以上（）；）；3.3.剂量组距合适，一般为等比级数；剂量组距合适，一般为等比级数；4.4.给药途径尽量与实际接触一致；给药途径尽量与实际接触一致；（隔夜禁食（隔夜禁食（12-14h12-14h），给药后再禁食），给药后再禁食3-43-4小时）小时）5.5.毒性观察期至少毒性观察期至少2 2周以上，每天观察周以上，每天观察1 1次。次。曲线拟合法曲线拟合法 （概率单位法或（概率单位法或BlissBliss法）法）插值法插值法 累积法累积法 移动平均法移动平均法 等等 参考同系物或类似物的急性毒性资料；参考同系物或类似物的急性毒性资料；最大耐受致死量（最大耐
8、受致死量（LDLD0 0）测定；）测定；WHOWHO规定给药剂量：经口规定给药剂量：经口 经呼吸道经呼吸道 5000ppm5000ppm 经皮肤经皮肤 2000mg/kg2000mg/kg 预试验测定致死剂量范围预试验测定致死剂量范围 即死亡率从即死亡率从0%0%100%100%（10%10%90%)90%)-Lork-Lork法（法（改良法的组距为改良法的组距为1.3-1.51.3-1.5）-组距法组距法公式：公式：i=i=（lgLDlgLD9090-lgLD-lgLD1010）/（n-1n-1）或或 i=i=（lgLDlgLD100100-lgLD-lgLD0 0）/（n-1n-1）式中：
9、式中：i-i-为组距为组距 n-n-为设计的剂量组数为设计的剂量组数组距法确定各组剂量组距法确定各组剂量 假定某化学药物假定某化学药物LDLD100100为为2000mg/kg,LD2000mg/kg,LD0 0为为500mg/kg,500mg/kg,设设6 6个剂量组个剂量组，各染毒组的剂量是多少？，各染毒组的剂量是多少？1.1.按公式求出对数剂量组距（按公式求出对数剂量组距（I）公式：公式：I=I=（lgLDlgLD100100-lgLD-lgLD0 0）/（n-1)n-1)=（lg2000-lg500lg2000-lg500）/(6-1)/(6-1)=（-）/5/5 =0.120 =0.
10、120 2.2.确定各组实际剂量（见下表）确定各组实际剂量（见下表）实例实例某化学药物急性毒性试验剂量设置某化学药物急性毒性试验剂量设置 组别组别 剂量对数剂量对数 剂量（剂量（mg/kgmg/kg）1 502.3 2 2.821 662.2 3 2.941 873.0 4 3.061 1150.8 5 3.181 1517.1 6 注：剂量对数组距注：剂量对数组距=0.12=0.12，剂量组间的等比级数，剂量组间的等比级数=1.318=1.318 5 56 6个剂量组，每组动物数相等；个剂量组，每组动物数相等；死亡率呈正态分布；死亡率呈正态分布；最低剂量组死亡率最低剂量组死亡率20%20%；
11、最高剂量组死亡率最高剂量组死亡率80%80%，各组剂量呈等比级数各组剂量呈等比级数（）。）。计算结果简便（按公式计算）计算结果简便（按公式计算）精确度高精确度高 公式：公式：lgLDlgLD5050XkXki(i(p p0.50.5)pq pq S Si i n n LDLD5050的的95%95%可信限可信限(LD(LD50501.96 S)1.96 S)LDLD5050计算公式：计算公式：式中：式中：m-lgLDm-lgLD5050;i-i-组间对数剂量差值；组间对数剂量差值；Xk-Xk-最大剂量的对数值；最大剂量的对数值；q-q-存活率（存活率（q=1-pq=1-p）；）；p-p-各剂量
12、组死亡率总和；各剂量组死亡率总和；n-n-每组动物数。每组动物数。应用实例应用实例npqiSmpiXkm)5.0(公式：公式：lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5)=1.35210213.01009.01021.01025.01016.008.0SmSm lgLD50及其及其95%可信限为可信限为1.960.0213=LD50及其及其95%可信限为可信限为（20.4424.76 mg/kg）4 4个剂量组，每组动物数相等（个剂量组，每组动物数相等（）雌雄分开试验雌雄分开试验 每组剂量为固定倍数递增（每组剂量为固定倍数递增（）动物用量少动物用量少 结果查表可得（结果查表可得（）精
13、确度不高精确度不高 霍恩霍恩(Horn)(Horn)法查表法查表-2.15倍组距倍组距 霍恩霍恩(Horn)(Horn)法查表法查表-3.16倍组距倍组距(二）急性毒性替代法二）急性毒性替代法 ：替代（替代（Replacement）减少（减少（Reduction）优化（优化（Refinement）1.1.限量试验（限量试验（limit test）2.2.固定计量法（固定计量法（fixed dose method）3.3.急性毒性分级法急性毒性分级法（acute toxic class method）4.4.上下法（上下法（up and down procedure）-序贯法序贯法 受试物急性毒
14、性很低时可采用此法。受试物急性毒性很低时可采用此法。：受试动物一般为受试动物一般为；给予受试物；给予受试物；动物，雌雄各半；动物，雌雄各半；给予最大剂量，一般为给予最大剂量，一般为；毒性观察期毒性观察期；LDLD5050给药剂量（给药剂量（）固定剂量：固定剂量：5 5、2000mg/kg2000mg/kg；预试验：用单性别预试验：用单性别1 1只动物只动物循序进行循序进行，接受试验前，接受试验前后的后的2 2只动物间隔只动物间隔2424小时。如一个剂量无中毒表现，其上个小时。如一个剂量无中毒表现，其上个剂量动物死亡，需在中间插入剂量进行试验；剂量动物死亡，需在中间插入剂量进行试验；正式试验：根
15、据预结果，取正式试验：根据预结果，取5 5只动物进行试验；只动物进行试验；限量试验：如果限量试验：如果2000mg/kg2000mg/kg预试验和正式试验预试验和正式试验均不均不出现中毒表现出现中毒表现，试验终止，为未观察到毒性，试验终止，为未观察到毒性(U)(U)。若正式试验若正式试验5mg/kg5mg/kg，试验终，试验终止，可定为高度止，可定为高度 FDFD法急性毒性分级选定：法急性毒性分级选定：注：按全球化学品分类及标签协调制度（注：按全球化学品分类及标签协调制度（GHSGHS）标准评价定级）标准评价定级 先以一个剂量进行一个动物试验，如动物死亡，则以下先以一个剂量进行一个动物试验，如
16、动物死亡，则以下一个较小剂量试探，若仍动物死亡则以下一个更小剂量试探；一个较小剂量试探，若仍动物死亡则以下一个更小剂量试探；如动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终按公式计如动物存活，则以较大剂量试探，依次类推，最终按公式计算算LDLD5050值。值。节省动物（节省动物（）；）；适用于毒性反应快速的化学药物。适用于毒性反应快速的化学药物。序贯法实验序贯法实验计算公式：计算公式：式中：式中：n-n-使用动物总数；使用动物总数；x-x-每个剂量组的剂量；每个剂量组的剂量；f-f-每个剂量组动物数。每个剂量组动物数。xfnLD1502/1222)1()(nnxffxns应用实例应用实例 （三）急
17、性毒作用观察（三）急性毒作用观察 中毒症状中毒症状（，）；）；试验前后记录体重试验前后记录体重（）；）；死亡记录死亡记录（）；）；大体解剖与病理学检查等。大体解剖与病理学检查等。四、急性毒性分级四、急性毒性分级 注：注：GHS-GHS-全球化学品分类及标签协调制度全球化学品分类及标签协调制度 （Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals）LDLD5050评价问题评价问题 1.1.毒性大小比较毒性大小比较 LDLD5050值较大者的值较大者的95%95%可信限的下限可信限的下限LDLD5050值较小
18、值较小者的者的95%95%可信限的上限。可信限的上限。如果可信区间存在重叠，按公式进行如果可信区间存在重叠，按公式进行t t检验检验：公式：公式：2.2.剂量剂量-反应曲线斜率比较反应曲线斜率比较 3.LD3.LD5050值表示值表示 动物品系；动物品系；染毒途径；染毒途径；95%95%可信限范围。可信限范围。LDLD50 50 1.96 S1.96 S 例如：异氰酸甲酯例如：异氰酸甲酯 大鼠大鼠经口经口 LDLD5050值为值为69mg/kg69mg/kg5.65.6 即即63.463.474.6mg/kg74.6mg/kg。概念：概念：又称局部损害作用，是指生物机体暴露于又称局部损害作用，
19、是指生物机体暴露于化学物后，在其化学物后，在其造成的局部毒性损害作用，造成的局部毒性损害作用，包括腐蚀性、刺激性与过敏性作用。包括腐蚀性、刺激性与过敏性作用。目的：目的：1.1.评价化学物对眼睛、皮肤的刺激与腐蚀作用和皮肤的评价化学物对眼睛、皮肤的刺激与腐蚀作用和皮肤的致敏作用及其程度或等级；致敏作用及其程度或等级；2.2.为制定化学物安全使用规范提供科学依据。为制定化学物安全使用规范提供科学依据。第三节第三节 局部毒性作用局部毒性作用一、眼睛刺激试验一、眼睛刺激试验 眼刺激性眼刺激性（eye irritation）指眼球表面接触受试物后）指眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。所产生的
20、可逆性炎性变化。眼腐蚀性眼腐蚀性（eye corrosion）指眼球表面接触受试物后）指眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤引起的不可逆性组织损伤 。试验方法：试验方法：Draize Draize 法（法（19441944年）年）常用动物：白兔常用动物：白兔Draize 法：法：一般采用一般采用4 4只白兔，受试物以一次剂量滴入每只白兔，受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼结膜囊内（只实验动物的一侧眼结膜囊内（0.1ml0.1ml），以生理盐水处理另），以生理盐水处理另一侧眼作为自身对照。在规定的时间内观察对兔眼的刺激和一侧眼作为自身对照。在规定的时间内观察对兔眼的刺激和腐蚀作用程度
21、，并按规定的分级标准进行评分。腐蚀作用程度，并按规定的分级标准进行评分。结膜结膜(发红、球结膜水肿和分泌物发红、球结膜水肿和分泌物)，角膜角膜(混混浊程度和范围浊程度和范围)，虹膜虹膜(充血、肿胀和角膜周围充血充血、肿胀和角膜周围充血)。一般为一般为7 7天，必要时延长至天，必要时延长至2121天天(观察期能足观察期能足已评价刺激是否存在可逆性已评价刺激是否存在可逆性)。如如72h72h眼刺激反应仍不消退时，需另取眼刺激反应仍不消退时，需另取4 4只白兔观察洗眼效果，即滴只白兔观察洗眼效果，即滴入受试物后分别在入受试物后分别在4s4s和和30s30s时，用生理盐水洗眼时，用生理盐水洗眼5min
22、5min，观察洗眼后的眼睛，观察洗眼后的眼睛反应。（反应。（）Draize Draize 法眼损伤程度评分表：法眼损伤程度评分表：1.1.受精鸡卵尿囊绒膜试验受精鸡卵尿囊绒膜试验 2.2.细胞膜损伤溶血试验细胞膜损伤溶血试验 3.3.血红蛋白变性试验（用酶标仪测定）血红蛋白变性试验（用酶标仪测定）4.4.细胞毒性试验细胞毒性试验 5.5.生物膜替代法等方法生物膜替代法等方法 二、皮肤刺激试验二、皮肤刺激试验 （dermal irritationdermal irritation）指皮肤接触或涂敷）指皮肤接触或涂敷受试物后，局部产生的可逆性炎性变化。受试物后，局部产生的可逆性炎性变化。(derm
23、al corrosion(dermal corrosion）指皮肤接触或涂敷受）指皮肤接触或涂敷受试物后，引起局部的不可逆性组织损伤试物后，引起局部的不可逆性组织损伤 。单次和多次皮肤刺激试验；单次和多次皮肤刺激试验；完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。试验方法：试验方法：Draize Draize 法（法（19441944年）年）常用动物：常用动物：家兔或豚鼠家兔或豚鼠 是人为将动物皮肤某部位擦伤（不能伤及真皮和产是人为将动物皮肤某部位擦伤（不能伤及真皮和产生出血），以比较受试物对完整皮肤及受损皮肤造成的生出血），以比较受试物对完整皮肤及受损皮肤造成的刺激反应的差异。
24、刺激反应的差异。皮肤刺激试验（皮肤刺激试验（Draize Draize 法）：法）：试验方法：试验方法：将受试物一次或多次涂敷于受试动物背部一侧皮肤上将受试物一次或多次涂敷于受试动物背部一侧皮肤上(0.5ml)(0.5ml)，涂敷持续时间，涂敷持续时间一般为一般为，以生理盐水处理另一侧，以生理盐水处理另一侧背部皮肤作自身对照。背部皮肤作自身对照。皮肤反应常为红斑或紫红色斑、水肿等，损伤严重时可皮肤反应常为红斑或紫红色斑、水肿等，损伤严重时可形成焦痂，一般按形成焦痂，一般按红斑红斑和和水肿水肿的严重程度评分，并与自身对的严重程度评分，并与自身对照比较，从而评价受试物对皮肤的刺激作用。照比较，从而
25、评价受试物对皮肤的刺激作用。一般为一般为1414天。天。1.1.皮肤的完整性（皮肤的完整性（皮肤受皮肤受）；）；2.2.固态受试物的物理状态与溶解度；固态受试物的物理状态与溶解度；3.3.受试动物年龄与性别；受试动物年龄与性别；4.4.实验人员主观因素（实验人员主观因素（存在判断差异存在判断差异）等。）等。受试物为强酸或强碱类腐蚀性物质（受试物为强酸或强碱类腐蚀性物质（pH2pH2或或11.511.5）受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LDLD5050小于小于200 200 mg/kgmg/kg体重；体重；急性经皮毒性试验中，受试物剂量达急性经皮毒性试验中，受试物
26、剂量达2000mg/kg2000mg/kg体体重仍未出现皮肤刺激性作用。重仍未出现皮肤刺激性作用。1.1.单层皮肤细胞培养模型单层皮肤细胞培养模型 （如：皮肤角质形成细胞、皮肤黑色素细胞、皮肤成（如：皮肤角质形成细胞、皮肤黑色素细胞、皮肤成纤维细胞等）纤维细胞等）2.2.表皮组织培养模型表皮组织培养模型 3.3.器官型人工皮肤模型器官型人工皮肤模型 Draize 法皮肤损伤程度评分表：法皮肤损伤程度评分表：三、皮肤变态反应试验三、皮肤变态反应试验 （skin sensitization）是皮肤对化学物产生的免疫源性皮肤反应，又称过敏是皮肤对化学物产生的免疫源性皮肤反应，又称过敏性接触性皮炎或皮
27、肤致敏反应。性接触性皮炎或皮肤致敏反应。在人身上有瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱等，在人身上有瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱等，在实验动物身上，通常只能见到在实验动物身上，通常只能见到皮肤红斑和水肿皮肤红斑和水肿等反应。等反应。确定重复接触化学物是否可引起变态反应确定重复接触化学物是否可引起变态反应及其反应程度。及其反应程度。豚鼠，每组动物豚鼠，每组动物10102020只。只。需做阳性对照和阴性对照，阴性对照动物需做阳性对照和阴性对照，阴性对照动物仅给予受试物激发接触。仅给予受试物激发接触。化学物在穿透皮肤的过程中，可作为半抗原与体内某些化学物在穿透皮肤的过程中，可作为半抗原与体内某些特定
28、的载体蛋白共价结合，形成完全抗原，诱导抗体形成，特定的载体蛋白共价结合，形成完全抗原，诱导抗体形成，产生免疫记忆，如再次接触较低浓度的相同或结构相似的化产生免疫记忆，如再次接触较低浓度的相同或结构相似的化学物，即能引发皮肤变态反应。学物，即能引发皮肤变态反应。局部封闭涂皮法（局部封闭涂皮法（Buehler Test）（）（）豚鼠最大值试验（豚鼠最大值试验（guinea pig maximization test）局部淋巴结试验（局部淋巴结试验（local lymph node assay，LLNA）记录皮肤具有红斑和水肿记录皮肤具有红斑和水肿（过敏反应）（过敏反应）的动物数。的动物数。（二步法
29、（二步法）实验前将受试动物背部实验前将受试动物背部去毛区去毛区3cm3cm3cm3cm，将，将受试物受试物0.10.10.2ml0.2ml涂在涂在2cm2cm2cm2cm滤纸上，将其敷贴在去毛滤纸上，将其敷贴在去毛区，用两层纱布，一层油纸或不透水塑料膜覆盖，再以无区，用两层纱布，一层油纸或不透水塑料膜覆盖，再以无刺激胶布固定，持续刺激胶布固定，持续6h6h后去除敷贴及受试物。第后去除敷贴及受试物。第7 7天天和第和第1414天以同样方法重复一次。天以同样方法重复一次。实验前将受试动物背部实验前将受试动物背部去毛区去毛区2cm2cm2cm2cm。末。末次致敏后次致敏后14142828天，将天，将
30、0.10.10.2ml0.2ml或低于致敏浓度的受试物或低于致敏浓度的受试物斑贴于右侧去毛区，覆盖方法同前，持续斑贴于右侧去毛区，覆盖方法同前，持续6h6h，去掉斑贴及，去掉斑贴及受试物后，每日观察至第受试物后，每日观察至第1212天。天。一、概述一、概述 重复多次接触化学物的毒性研究。重复多次接触化学物的毒性研究。根据持续时间分类（根据持续时间分类（按按OECDOECD）：）：短期毒性作用（亚急性）短期毒性作用（亚急性）亚慢性毒性作用亚慢性毒性作用 慢性毒性作用慢性毒性作用 第四节第四节 短期、亚慢性和慢性毒性作用短期、亚慢性和慢性毒性作用 1.1.观察长期接触受试物的毒效应谱、毒作用特征与
31、观察长期接触受试物的毒效应谱、毒作用特征与毒作用靶器官以及中毒表现（毒作用靶器官以及中毒表现（）等；）等；2.2.探索受试物的作用机制；探索受试物的作用机制；3.3.观察长期接触受试物所致毒作用的可逆性；观察长期接触受试物所致毒作用的可逆性；4.4.评价毒作用的剂量评价毒作用的剂量-反应（效应）关系，确定反应（效应）关系，确定、5.5.观察不同动物种属的毒性差异，为试验结果外推观察不同动物种属的毒性差异，为试验结果外推到人，确定安全系数提供依据。到人，确定安全系数提供依据。二、研究方法二、研究方法（一）短期重复毒性和亚慢性毒性试验（一）短期重复毒性和亚慢性毒性试验 （1 1）物种与品系）物种与
32、品系 啮齿类动物（啮齿类动物（）非啮齿类动物（非啮齿类动物（）（2 2）性别、年龄和动物数）性别、年龄和动物数 雌雄各半；大鼠年龄一般雌雄各半；大鼠年龄一般66周，体重周，体重50-10050-100克，每组克，每组动物动物2020只。犬用只。犬用4-64-6月龄月龄(9(9个月个月)，每组动物，每组动物88只。只。（3 3）动物等级与饲养条件）动物等级与饲养条件 清洁级及以上等级动物，屏障环境饲养，饲料、饮水、清洁级及以上等级动物，屏障环境饲养，饲料、饮水、垫料、气温、气湿、压力、光照等符合垫料、气温、气湿、压力、光照等符合GLPGLP要求。要求。应尽量与人实际接触相似的途径；染毒频率一般为
33、每应尽量与人实际接触相似的途径；染毒频率一般为每日日1 1次，连续给予（每周可给予次，连续给予（每周可给予5-65-6次）次）（1 1）经口染毒）经口染毒 灌胃法灌胃法-喂饲法喂饲法-5%5%吞咽胶囊法吞咽胶囊法-（2 2）呼吸道染毒）呼吸道染毒 每天染毒时间每天染毒时间2-62-6小时（小时（）（3 3）注射途径）注射途径 应注意无菌操作应注意无菌操作 染毒期限染毒期限：短期重复暴露：短期重复暴露-28-28天；亚慢性暴露天；亚慢性暴露-90-90天天 一般选择至少一般选择至少3 3个剂量组和个剂量组和1 1个阴性对照组（溶剂），个阴性对照组（溶剂），若要中期观察或实验结束后恢复期观察，对照
34、组与高剂量若要中期观察或实验结束后恢复期观察，对照组与高剂量组需设计组需设计“”。高剂量组动物应有明显中毒反应，但不引起死亡；高剂量组动物应有明显中毒反应，但不引起死亡；中剂量组动物出现轻度的中毒反应；中剂量组动物出现轻度的中毒反应；(相当于相当于LOAELLOAEL水平水平)低剂量组动物无毒性反应；低剂量组动物无毒性反应；（相当于（相当于NOAELNOAEL水平）水平）剂量组间距一般为剂量组间距一般为2-42-4倍。倍。以急性毒性试验中同一动物品系和同一染毒途径获得以急性毒性试验中同一动物品系和同一染毒途径获得的的LDLD5050为依据；为依据；如如2828天经口毒性试验可按天经口毒性试验可
35、按LDLD5050的的10-25%10-25%作为最高剂量，作为最高剂量，最低剂量应是人体预期实际摄入量最低剂量应是人体预期实际摄入量3 3倍以上。倍以上。对于求不出对于求不出LDLD5050的受试物，即毒性很低的受试物，如的受试物，即毒性很低的受试物，如药品、食品，可根据人体实际摄入量为依据。药品、食品，可根据人体实际摄入量为依据。大鼠可用人临床拟用剂量的大鼠可用人临床拟用剂量的1010、3030、100100倍，非倍，非啮齿类动物可用啮齿类动物可用5 5、1515、5050倍的剂量进行剂量设置；倍的剂量进行剂量设置；试验剂量应涵盖人体预期摄入量的试验剂量应涵盖人体预期摄入量的100100倍
36、，在不倍，在不影响营养摄食与营养平衡情况下，高剂量组可按最大给予量影响营养摄食与营养平衡情况下，高剂量组可按最大给予量设计。设计。应能观察到受试物的靶器官和敏感毒性指标。应能观察到受试物的靶器官和敏感毒性指标。一般观察指标（一般观察指标（）；）；体重、食物消耗量与饮水消耗量；体重、食物消耗量与饮水消耗量；眼部观察；眼部观察；血液学指标；血液学指标；血液生化指标；血液生化指标；尿常规指标；尿常规指标；体温与心电图检查；体温与心电图检查；病理学检查（大体解剖与组织病理学检查）；病理学检查（大体解剖与组织病理学检查）；特异性指标（效应标志物）。特异性指标（效应标志物）。2828天亚急性毒性试验：卫星
37、观察期天亚急性毒性试验：卫星观察期1414天；天；9090天亚慢性毒性试验：卫星观察期天亚慢性毒性试验：卫星观察期2828天；天；毒性可逆性；毒性可逆性；毒性持续性；毒性持续性；毒性迟发效应等；毒性迟发效应等；至少每天观察一次，详细记录中毒症状、体征、毒至少每天观察一次，详细记录中毒症状、体征、毒 效应性质、毒性持续时间、死亡等情况。效应性质、毒性持续时间、死亡等情况。（二）慢性毒性试验（二）慢性毒性试验 评价受试动物大部分生命期间给予受试物所发生慢性评价受试动物大部分生命期间给予受试物所发生慢性毒性效应，阐明其剂量毒性效应，阐明其剂量-反应关系和靶器官，确定慢性毒性反应关系和靶器官，确定慢性
38、毒性的的NOAELNOAEL和和LOAELLOAEL。根据根据“3R”3R”原则，慢性毒性试验与致癌试验合并。原则，慢性毒性试验与致癌试验合并。1.1.实验动物与染毒途径选择（实验动物与染毒途径选择（）2.2.染毒剂量与染毒期限染毒剂量与染毒期限 一般选择至少一般选择至少3 3个剂量组和个剂量组和1 1个阴性对照组（溶剂），个阴性对照组（溶剂），若要中期观察或实验结束后恢复期观察，对照组与高剂量若要中期观察或实验结束后恢复期观察，对照组与高剂量组需设计组需设计“”。剂量组距一般为。剂量组距一般为2-42-4倍，倍，1010倍。倍。染染毒期限一般至少毒期限一般至少1212个月个月。3.3.观察指
39、标选择（同亚慢性试验）观察指标选择（同亚慢性试验）（三）实验结果评价（三）实验结果评价 （短期、亚慢性与慢性毒性结果短期、亚慢性与慢性毒性结果）确定受试动物发生毒效应的确定受试动物发生毒效应的和和，求得求得。要与正常对照组比较，作统计学处理分析：要与正常对照组比较，作统计学处理分析：1.1.剂量剂量-效应（反应）关系趋势；效应（反应）关系趋势；2.2.实验效应重现性（实验效应重现性（）；）；3.3.相关指标变化分析；相关指标变化分析；4.4.毒性的性别差异；毒性的性别差异；5.5.持续效应趋势分析；持续效应趋势分析；6.6.效应差异大小；效应差异大小；7.7.实验室的历史对照分析（实验室的历史
40、对照分析（）1.1.最大无作用剂量最大无作用剂量(NOAEL)(NOAEL)人可能实际摄入量人可能实际摄入量100100倍，倍，表示毒性较强，应表示毒性较强，应放弃该化学物用于食品放弃该化学物用于食品；2.2.最大无作用剂量最大无作用剂量(NOAEL)(NOAEL)在人可能实际摄入量在人可能实际摄入量100-300100-300倍时，倍时，应进行慢性试验应进行慢性试验；3.3.最大无作用剂量最大无作用剂量(NOAEL)(NOAEL)人可能实际摄入量人可能实际摄入量300300倍时，倍时，不必进行慢性试验，即可进行安全性评价不必进行慢性试验，即可进行安全性评价。1.LOAEL1.LOAEL与与N
41、OAELNOAEL值越小，慢性中毒的危险性越大，制定值越小，慢性中毒的危险性越大，制定安全限值（卫生标准）应越严格（安全限值（卫生标准）应越严格（）。）。2.2.慢性吸入中毒危险指数慢性吸入中毒危险指数 （R Rchipchip=20=20毒物蒸汽饱和浓度毒物蒸汽饱和浓度/Lim/Limchch）R Rchipchip100 100 轻微危害轻微危害 100R100Rchipchip1000 1000 中等危害中等危害 1000R1000Rchipchip10000 10000 高度危害高度危害 R Rchipchip10000 10000 极高危害极高危害本章结束研究意义：研究意义：1.1.
42、求出蓄积系数求出蓄积系数(K)(K)，判断化学药物蓄积性大小；，判断化学药物蓄积性大小；2.2.为其他相关毒性试验的剂量设计提供依据。为其他相关毒性试验的剂量设计提供依据。基本方法：基本方法：1.1.理化检验法理化检验法 -（物质蓄积，物质蓄积，）2.2.生物效应法生物效应法 -（物质蓄积与功能蓄积）物质蓄积与功能蓄积）蓄积系数法蓄积系数法 是指多次染毒所产生的毒效应是指多次染毒所产生的毒效应(ED(ED5050(n)(n)或或LDLD5050(n)(n)与一次染毒所产生相同毒效应与一次染毒所产生相同毒效应(ED(ED5050(1)(1)或或LDLD5050(1)(1)的比值。的比值。公式公式
43、：K Kaccacc=ED=ED5050(n)(n)/ED/ED5050(1)(1)或或 求出蓄积系数求出蓄积系数K K值。根据值。根据K K值的大小判断化学物蓄积值的大小判断化学物蓄积作用的强弱，作用的强弱，。基本方法：基本方法：求出化学物求出化学物1 1次染毒的次染毒的LDLD5050(1)(1)值；值；对另一组动物对另一组动物，计算所用总剂量即，计算所用总剂量即；如果到如果到5050天死亡动物仍未达一半，停止试验（达天死亡动物仍未达一半，停止试验（达5 5个个LDLD5050(1)(1)剂量），这时可判断为剂量），这时可判断为作用。作用。基本方法：基本方法：求出化学物求出化学物1 1次染
44、毒的次染毒的值；值；测定另一组动物测定另一组动物LDLD5050(n)(n)；，第一周期每天剂量为，第一周期每天剂量为0.1 LDLD5050(1)(1)，直至受试动物死亡一半为止，计算总剂量即直至受试动物死亡一半为止，计算总剂量即 如果到如果到2828天，死亡动物仍未达一半，可停止试验，天，死亡动物仍未达一半，可停止试验，这时总剂量达这时总剂量达12.8LDLD5050(1)(1),可认为可认为性。性。剂量递增法剂量递增法(1.5(1.5倍倍)使用剂量表使用剂量表 接触天数接触天数 14 58 912 1316 1720 2124 2528 每日接触剂量每日接触剂量(LD50)0.1 0.1
45、5 0.22 0.34 0.50 0.75 1.12 4日接触总剂量日接触总剂量(LD50)0.4 0.6 0.88 1.36 2.00 3.00 4.48 累积接触总剂量累积接触总剂量(LD50)0.4 1.0 1.88 5.24 8.24 12.72如本周期受试动物死亡一半如本周期受试动物死亡一半 即即LDLD5050（n n）=3.24mg/kg=3.24mg/kg 我国我国农药农药蓄积性评定标准蓄积性评定标准 蓄积系数蓄积系数(K)蓄积毒性分级蓄积毒性分级 1 高度蓄积性高度蓄积性 1 明显蓄积性明显蓄积性 3 中等蓄积性中等蓄积性 5 轻度蓄积性轻度蓄积性 )1(50)(50LDLD
46、n蓄积系数结果评价结果评价 我国我国消毒剂消毒剂蓄积性评定标准蓄积性评定标准 蓄积系数蓄积系数(K)(K)蓄积毒性分级蓄积毒性分级 1 1 极强蓄积性极强蓄积性 1 1 强蓄积性强蓄积性 3 3 中等蓄积性中等蓄积性 5 5 弱蓄积性弱蓄积性 2020天蓄积总量天蓄积总量 实验组实验组 累积剂量累积剂量 1/20LD1/20LD5050（）LDLD5050 1/10LD 1/10LD5050 2 LD 2 LD5050 1/5LD 1/5LD5050 4 LD 4 LD5050 1/2LD 1/2LD50 50（）10 LD10 LD5050 对照组对照组 0 020d20d蓄积试验法蓄积试验
47、法 结果评价结果评价 2020天蓄积试验法评定标准天蓄积试验法评定标准 结果表述结果表述 蓄积毒性分级蓄积毒性分级停药后停药后7d7d，各剂量组各剂量组无死亡动物无死亡动物 未见蓄积性未见蓄积性高剂量组高剂量组有动物死亡，其他组无动物死亡有动物死亡，其他组无动物死亡 弱蓄积性弱蓄积性低剂量组低剂量组无动物死亡，其他组有动物死亡无动物死亡，其他组有动物死亡 中等蓄积性中等蓄积性各剂量组各剂量组有动物死亡，并呈剂量反应关系有动物死亡，并呈剂量反应关系 强蓄积性强蓄积性当累积剂量当累积剂量5 5个个LDLD5050，受试动物死亡仍未达一半时：，受试动物死亡仍未达一半时：1.1.说明蓄积性极低；说明蓄积性极低；2.2.提示机体对毒物产生提示机体对毒物产生耐受性耐受性。耐受性检验：耐受性检验：在蓄积性试验基础上，给予在蓄积性试验基础上，给予1 1个个LDLD5050打击剂量，此时受打击剂量，此时受试动物死亡仍未达一半时，可被认为试动物死亡仍未达一半时，可被认为。有时给予有时给予3 3个个LDLD5050打击剂量，此时受试动物死亡仍未达打击剂量，此时受试动物死亡仍未达一半时，可认为一半时，可认为。
