1、第十六章药物分析教研室概 述1-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4高分子杂质检查5在低微浓度下即可对某些生物在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称制作用的化学物质的总称抗生素（抗生素（antibiotics）来源 生物合成（发酵）生物合成（发酵）化学合成或半合成化学合成或半合成特点 化学纯度较低化学纯度较低-同系物、异构体及降解物多同系物、异构体及降解物多 活性组分易发生变异活性组分易发生变异-微生物菌株或者发酵条件的改变都会微生物菌株或者发酵条件的改变都会导致产品质量发生变化导致产品质量发生变化 稳定性差稳定性差-活性中
2、心往往是活泼基团，不稳定活性中心往往是活泼基团，不稳定按化学结构和性质分类按化学结构和性质分类-内酰胺类内酰胺类（-lactam）含有）含有-内酰胺类结构的抗生素，内酰胺类结构的抗生素，如青霉素、头孢菌素、碳青霉素烯类等等；如青霉素、头孢菌素、碳青霉素烯类等等；四环素类：四环素类：含有四并苯的木考核，如四环素、土霉素、含有四并苯的木考核，如四环素、土霉素、金霉素等；金霉素等；氨基糖苷类：氨基糖苷类：结构中含有氨基糖苷和氨基环醇，如链霉结构中含有氨基糖苷和氨基环醇，如链霉素、庆大霉素等素、庆大霉素等 大环内酯类：大环内酯类：含有大环内酯作为配糖体，如红霉素，螺含有大环内酯作为配糖体，如红霉素，螺
3、旋霉素等；旋霉素等；多肽类：多肽类：抗菌肽，万古霉素、多粘菌素抗菌肽，万古霉素、多粘菌素B等；等；抗肿瘤类：丝裂霉素、平阳霉素等；抗肿瘤类：丝裂霉素、平阳霉素等；其他类其他类按照生物来源分类按照生物来源分类 细菌产生细菌产生的抗生素的抗生素 如多粘菌素和杆菌肽。如多粘菌素和杆菌肽。真菌产生真菌产生的抗生素的抗生素 如青霉素及头孢菌素，现在多用其半合成如青霉素及头孢菌素，现在多用其半合成产物。产物。放线菌产生放线菌产生的抗生素的抗生素 放线菌是生产抗生素的主要来源。其中放线菌是生产抗生素的主要来源。其中链霉菌和小单孢菌产生的抗生素最多。常见的抗生素包括链链霉菌和小单孢菌产生的抗生素最多。常见的抗
4、生素包括链霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、两性霉素霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、两性霉素B等。等。抗菌药物的作用机制抗菌药物的作用机制 根据对病原菌的作用根据对病原菌的作用靶位，将抗生素的作用机制分为四类靶位，将抗生素的作用机制分为四类 抑制细菌细胞壁合成抑制细菌细胞壁合成 影响胞浆膜通透性（多粘菌素）影响胞浆膜通透性（多粘菌素）抑制蛋白质合成（大环内酯类、氨基糖甙类）抑制蛋白质合成（大环内酯类、氨基糖甙类）抑制核酸代谢：叶酸代谢；核酸合成（喹诺酮、磺胺类）抑制核酸代谢：叶酸代谢；核酸合成（喹诺酮、磺胺类）喹诺酮类喹诺酮类林可霉素类林可霉素类氨基糖苷类氨基糖苷类酮康唑酮康唑环丝氨酸环丝氨酸利
5、福平利福平红霉素红霉素制霉菌素制霉菌素杆菌肽杆菌肽甲氧苄胺嘧啶甲氧苄胺嘧啶四环素类四环素类两性霉素两性霉素B万古霉素万古霉素磺胺药磺胺药氯霉素氯霉素多粘菌素类多粘菌素类-内酰胺类内酰胺类核酸合成核酸合成细胞蛋白合成细胞蛋白合成细胞膜渗透性细胞膜渗透性细胞壁细胞壁耐药分类耐药分类(一一)固有耐药（固有耐药（intrinsic resistance）固有耐药性指细菌对某些抗菌药物的天然不敏感。固有耐药性细固有耐药性指细菌对某些抗菌药物的天然不敏感。固有耐药性细菌称为天然耐药性细菌，其耐药基因来自亲代，由细菌染色体基菌称为天然耐药性细菌，其耐药基因来自亲代，由细菌染色体基因决定而代代相传的耐药性，存
6、在于其染色体上，具有种属特异因决定而代代相传的耐药性，存在于其染色体上，具有种属特异性。如肠道杆菌对青霉素的耐药，固有耐药性始终如一并可预测。性。如肠道杆菌对青霉素的耐药，固有耐药性始终如一并可预测。（二）获得耐药（二）获得耐药（acquired resistance）在原先对药物敏感的细菌群体中出现了对抗菌药物的耐药性，这是在原先对药物敏感的细菌群体中出现了对抗菌药物的耐药性，这是获得耐药性与固有耐药性的重要区别。获得耐药性与固有耐药性的重要区别。产品稳定性差产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒后疗效下降、失效或增加毒副作用副作用发酵过程不易控
7、制易受污染发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂生产工艺复杂发酵液中杂质发酵液中杂质 无机盐、脂肪、各种蛋白质、无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、各种降解产物、色素、热原、毒性物质毒性物质 抗生素质量分析抗生素质量分析生物学法、物理化学法生物学法、物理化学法 鉴别：鉴别：理化方法理化方法(主要方法主要方法)、微生物法、微生物法官能团的显色反应，如：官能团的显色反应，如：-内酰胺环的羟肟酸铁反应；内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。色谱法：色谱法：HPLCH
8、PLC和和TLCTLC法，采用标准品对照品对照法；法，采用标准品对照品对照法；生物学法：比较抑菌能力，现已少用。生物学法：比较抑菌能力，现已少用。检查：检查：影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分或者干燥失重等或者干燥失重等控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等；与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等菌内毒素、降压物质、无菌等含量/效价
9、测定：微生物法：与临床疗效吻合与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高准确度与专属性较高,且操作简便；但且操作简便；但与临床疗效有偏差与临床疗效有偏差NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）6-aminopenicillanic acid简称简称6-APA青霉素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCO7-aminocephalosporanic acid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻唑环氢化噻嗪环氢化
10、噻嗪环CONSOHNCOOHCH3CH3CH2 青霉素青霉素(苄青霉素苄青霉素)(penicillins)CHCOHNNH2NSCH3CH3COOHO氨苄西林氨苄西林CHCOHNNH2HONSCH3CH3COOHO阿莫西林阿莫西林CHCOHNNH2CH3NOSCOOH头孢氨苄头孢氨苄CH3NOSCOOHCHCOHNNH2头孢拉定头孢拉定CH3NOSCOOHCHCOHNNH2HO头孢羟氨苄头孢羟氨苄SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa头孢噻吩钠头孢噻吩钠一、结构与性质一、结构与性质1.酸性（羧基）酸性（羧基）pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，酸性较强。碱金属盐水溶
11、性好，有机碱盐难溶于水。有机碱盐难溶于水。2.手性手性C（旋光性）（旋光性）NSO1234567NOS123456783.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm4.内酰胺环内酰胺环(四元环张力+酰胺键)干燥条件较稳定，溶液不稳定干燥条件较稳定，溶液不稳定失失效效降降解解青青霉霉素素类类酸酸、碱碱、青青霉霉素素酶酶某些氧化剂、金属离子、温度某些氧化剂、金属离子、温度失失效效降降解解头头孢孢菌菌素素类类酸酸、碱碱、胺胺类类内内酰酰胺胺酶酶 二、鉴别试验二、鉴别试验(一一)色谱法色谱法HPLC(tR)TLC(Rf)(二)光谱法IR UVNMRNH2CONSOHNCOOHCH3C
12、H3HOCH2(三)呈色反应1 1）羟肟酸铁反应）羟肟酸铁反应内酰胺环内酰胺环内酰胺类NH2OHHClNaOH羟肟酸 Fe3+H+显色（红、棕、褐）2 2）类似肽键（）类似肽键（-CONH-CONH-）a.a.茚三酮反应茚三酮反应-氨基氨基 CNH2H+OOHOHOCOHONCOO+C O2+3H2Ob.b.双缩脲反应双缩脲反应内酰胺类内酰胺类 碱性酒石酸铜紫色2OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH3 3）其他呈色反应）其他呈色反应橙橙黄黄色色重重氮氮苯苯磺磺酸酸 OHHC56（偶合）呈暗黄色氨苄西林水浴加热甲
13、醛硫酸水湿润-青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)各种盐的反应焰色反应K+、Na+(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定分子排阻色谱分子排阻色谱凝胶色谱分子筛机制凝胶色谱分子筛机制 主成分自身对照法主成分自身对照法 面积归一化法面积归一化法 限量法限量法 自身对照外标法自身对照外标法OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOOHOOHCH2OOHOOHCH2OOCH3OHOHOOOCH2OHHOOOOHOHOOH2COOOOOHHOH2COOH2COHHOOCH2OOOH2COOHHOOOOOHOOHCH2OOCH2OHHOOOOOC
14、H2OHHOOOOCH2OHHOOOOH2COHHOOOOCH2OHHOOOOOOHOHOH2COOH2COHOCH2OHHOOOH2COCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHCH2CH2HCOHHCOHCH2CH2CH2HCOH 萄聚糖凝胶萄聚糖凝胶立体网状结构图立体网状结构图三、杂质检查三、杂质检查2.有关物质与异构体有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液
15、。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)青霉素钠青霉素钠(钾钾)的吸光度检查：的吸光度检查：本品加水制成每本品加水制成每1mL含有含有1.80mg的溶液，照的溶液，照UV-Vis法，在法，在2
16、80nm波长处测定吸光度，不得大于波长处测定吸光度，不得大于0.10；在；在264nm波长处有最大吸收，吸光度应为波长处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88.该法该法264nm处吸收值用来控制青霉素钠处吸收值用来控制青霉素钠(钾钾)的含量，的含量，280nm处吸收值用来控制杂质的含量。处吸收值用来控制杂质的含量。3.UV4.有机溶剂：用GC法或者HPLC法5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)四、含量测定四、含量测定u 碘量法u 汞量法u 酸碱滴定法u 羟肟酸比色法u HPLC法阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶
17、为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5 测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按
18、外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。碱性环己多元醇碱性环己多元醇+氨基糖氨基糖苷苷链霉素链霉素(Streptomycin)巴龙霉素巴龙霉素(paromomycin)OCH2OHHOOHNH2OOHNH2H2NOOHOOOR2OHHOH2NCH2OHR1D-D-葡萄糖胺脱氧链霉胺葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺巴龙胺D核糖巴龙霉糖核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺巴龙二糖胺庆大霉素庆大霉素(Gentamycin)一、结构与性质一、结构与性质1 1）溶解度（氨基、羟基）：水溶性）溶解度（氨基、羟基）：水溶性2 2）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，）碱性（氨基）：临床应用
19、其硫酸盐；溶于水，但不溶于有机溶剂；但不溶于有机溶剂；3 3）旋光性（糖）：多个手性碳）旋光性（糖）：多个手性碳4 4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床使用时对床使用时对pHpH值有很高的要求；值有很高的要求；5 5）紫外吸收光谱）紫外吸收光谱1.1.茚三酮反应茚三酮反应羟基胺类羟基胺类,-,-氨基酸氨基酸蓝蓝紫紫色色庆庆大大霉霉素素链链霉霉素素茚茚三三酮酮二、鉴别反应二、鉴别反应2.Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构OHOH2CCHOOHOHOH2CCHOHOH红紫色羟甲基糠醛(含含六碳糖六碳糖结构氨基糖结构氨基糖苷类酸性水解产物苷类酸性
20、水解产物)OHOH2CCHOoOH2CCHoo蓝紫色3.N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）甲甲基基葡葡萄萄糖糖胺胺庆庆大大霉霉素素链链霉霉素素水水解解 N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色4.麦芽酚反应链霉糖特有反应紫红色麦芽酚链霉糖链霉素分子重排3OHFeH+NH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2O NaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红紫红麦芽酚麦芽酚5.坂口反应链霉胍特有反应橙橙红红羟羟基基喹喹啉啉链链霉霉胍胍链链霉霉素素次次溴溴酸酸钠钠 8OH（或或-萘酚萘酚）NH
21、 CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应6.硫酸盐反应7.色谱法：TLC和HPLC法8.光谱法：IR、UV三、杂质检查三、杂质检查1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)3.庆大霉素C组分的测定四、含量测定四、含量测定微生物检定法微生物检定法平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用；制作用；管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较管碟法：利用抗生素在琼
22、脂培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，测定供试品效价；和供试品抑菌程度，测定供试品效价；-该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、多组分抗生素，首选该法测效价。复杂、多
23、组分抗生素，首选该法测效价。-该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。HPLC法法有紫外吸收有紫外吸收紫外、荧光检测器紫外、荧光检测器无紫外吸收无紫外吸收衍生化；衍生化；电化学检测器或蒸发光散射法电化学检测器或蒸发光散射法2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1ABCD123456789101112一、结构与性质一、结构与性质1）两性：）两性：-OH酸性酸性 N(CH3)2碱性碱性 Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物；形成红色配合物；Al3+形成黄色配合物形成黄色配合物；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮多价
24、阳离子与酚二酮荧光荧光 l 与酸、碱均可成盐；l 临床多用盐酸盐；l 强酸或强碱中溶解度 2）旋光性）旋光性3）与金属离子络合）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基酚羟基、烯醇基)4）UV和荧光和荧光 弱酸性（弱酸性（pH2-6）A环环C-4异构化异构化 差向四环素差向四环素酸性（酸性（pH 2）C环脱水环脱水 脱水四环素脱水四环素碱性碱性 C环开环，形成内酯环开环，形成内酯 异四环素异四环素5）不稳定性A.A.差向异构化差向异构化差差向向金金霉霉素素差差向向四四环环素素金金霉霉素素四四环环素素 4462pH蓝色荧光淡黄黑OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCONH2N(CH3)2HOHAAp
25、H2.06.02CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）B.B.酸性酸性脱水脱水降解降解脱水金霉素脱水金霉素脱水四环素脱水四环素金霉素金霉素四环素四环素 2pHmax=445nmmax=435nmROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBCC.C.碱性碱性脱水脱水降解降解)(无活性无活性异四环素异四环素四环素四环素 OHROHCH3OHROOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHROOOHCONH2NHOHOCH3OOH-二、鉴别试验二、鉴别试验1、HPLC2、TLC(正相分配薄层色谱
26、正相分配薄层色谱)薄层板中加入薄层板中加入EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象克服痕量金属造成的拖尾现象3、IR4、UV：最大吸收波长和制定浓度下的吸光度；：最大吸收波长和制定浓度下的吸光度；5、显色法、显色法浓硫酸浓硫酸三氯化铁三氯化铁三、杂质检查三、杂质检查1.1.有关物质有关物质HPLC2.2.杂质吸光度杂质吸光度UV)()39.036.0(380差向四环素控制ETCAnm EATCATC5.0Anm430、控制)(12.0Anm530注射用异四环素控制 生产过程贮存过程使用不当高分子杂质内源性(药物自身聚合物)外源性(蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物)发酵过程控制重点1.1.基本结构基
27、本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应侧链参于反应头孢菌素族与母核有关的N型聚合反应侧链参与反应的L型聚合反应2.2.特点特点（1 1）生产工艺中产生杂质）生产工艺中产生杂质 发酵中产生发酵中产生（2 2）降解）降解（3 3）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。（4 4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）喷雾干燥）3.3.杂质控制方法杂质控制方法反相高效液相、离子交换色谱和反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱凝胶色谱。葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶SephadexCSephadexC1010自身对照外标法本章小结本章小结 抗生素的定义、特点及分类抗生素的定义、特点及分类-内酰胺类结构、性质、呈色反应内酰胺类结构、性质、呈色反应 氨基糖苷类代表药、结构、性质、鉴别试验氨基糖苷类代表药、结构、性质、鉴别试验 四环素类结构、性质（不稳定性）四环素类结构、性质（不稳定性）高分子杂质定义、来源、分类高分子杂质定义、来源、分类
