1、解磷微生物研究进展郑琨第1页，共29页。n苏北盐碱滩涂土壤概况n解磷微生物的种类与分布n解磷微生物的分离筛选n解磷机制n解磷能力的测定n技术路线探讨第2页，共29页。一 苏北盐碱滩涂土壤概况 江苏沿海滩涂资源总面积约65.24104 平方公里，由潮上带(25.98104平方公里)、潮间带(26.57104平方公里)及辐射沙脊群的出露沙洲(12.69104平方公里)组成。江苏海岸由砂质海岸、基岩海岸、和淤泥质海岸组成，以粉沙淤泥质海岸为主，占全省海岸线长度的90.5第3页，共29页。江苏海岸带地势开阔，土壤类型单调，海堤以外主要分布滨海盐土类，堤内老垦区分布潮土类。潮间带的土壤为滨海盐土(海堤外
2、至零米线的地区)，分为潮滩盐土、草甸海滨盐土和沼泽海滨盐土三个亚类。一般来说，从潮滩盐土到沼泽海滨盐土，土壤呈现含盐量逐渐降低，有机质含量逐渐升高的趋势。第4页，共29页。开发利用沿海滩涂土壤是我国农业生产中十分迫切和重要的任务。随着耐盐作物育成和耐盐经济植物发现，这些植物的营养状况将成为今后解决的问题。盐碱土壤的另一特点是可溶性有效磷含量低，绝大部分以难溶性磷酸盐形式存在。而且盐碱土壤一般无机盐丰富，有机质严重缺乏，土壤板结，不宜施无机肥。我国每年1/3的磷肥需要进口，复合肥料和微生物肥料使用率不到30%（发达国家达到50%）。土壤中的解磷微生物，可将土壤中难溶磷酸盐转化为植物易吸收的可溶性
3、磷，这为改善盐土植物营养状况提供了出路。第5页，共29页。二 解磷微生物的种类与分布 解磷微生物(Phosphate-solubilizing microoganism，PSM)是一类能够将植物难以吸收的磷转化为可利用状态的微生物，这类解磷微生物除了可以活化土壤中难溶性的磷外，还可以通过影响植物根系分泌物的种类和数量，以增加植物根系对周围K,Ca,Mg,Fe,Zn等营养元素的吸收，使植物能够适应盐碱缺磷的环境。第6页，共29页。人们在20世纪初开始注意到微生物与土壤磷之间的关系。Sackett(1908)发现一些难溶性的复合物施入土壤中，可以被作为磷源而应用，他们从土壤中筛选出50株细菌，其中
4、36株在平板上形成了肉眼可见的溶磷圈。1948年Gerretsen发现植物施入不溶性的磷肥，经接种土壤微生物后，促进了植株的生长，增加磷的吸收。他分离出了这些微生物，发现这些微生物可帮助磷矿粉的溶解。从此许多科学家致力于解磷菌的研究，相继报道了许多微生物具有解磷作用。第7页，共29页。解磷微生物(PSM)包括细菌、真菌和放线菌。目前报道的解磷细菌解磷细菌主要有芽胞杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄杆菌属(Flavobac
5、terium)、肠细菌属 (Enterbacter)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆菌属(Chromobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、节细菌属(Arthrobacter)、硫氧化硫功菌(Thiobacillus thivoxidans)和多硫杆菌属(Thiobacillus)等。解磷真菌解磷真菌主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)。而解磷放线菌解磷放线菌则绝大部分为链霉菌属(Streptomyces)。第8页，共29页。按分
6、解底物可以将解磷微生物分为两类：一类是能够分解无机磷化合物的称为无机磷微生物无机磷微生物(包括假单孢菌属的一些种，无色杆菌属的一些种，黄杆菌属的一些种以及氧化硫硫杆菌);一类是具有分解有机磷化合物能力的称为有机磷有机磷微生物微生物（包括芽孢杆菌属的一些种，变形菌属的一种，沙雷氏菌属的一些种）。但由于解磷微生物解磷机理复杂，相当一部分的解磷既能分泌有机酸溶解无机磷盐，又能分泌磷酸酶物质分解有机磷（包括节杆菌属的一些种、链霉菌属的一些种），因而很难准确区分无机磷和有机磷微生物。第9页，共29页。解磷微生物的分布表现出明显的根际效根际效应应，主要表现在：根际土壤中的数量明显高于非根际土壤。解磷菌表现
7、出的强根际效应可能与根圈磷素营养亏缺诱导有关，但由于根圈微生物的群落结构受根系分泌物及根脱落物的影响，导致不同植物根圈微生物的组成差别很大，这种作用也影响解磷菌的群落组成。第10页，共29页。同时，不同的植被类型和不同的生态环境中，土壤解磷微生物的数量，种类及菌群结构也不同。林启美(2000)等调查农田、林地、草地和菜地等4种不同土壤生态环境中解磷菌数量和种群结构时，发现前3种土壤中的有机磷细菌只有菜地土壤的110，但农田土壤中解磷细菌的总数所占比例并不低。耕地土壤有机解磷菌主要是芽孢杆菌属，林地和菜地则主要是假单胞杆菌属；无机磷细菌种类比较少。第11页，共29页。三 解磷微生物的分离筛选 目
8、前，分离解磷微生物的方法一般是根据在以磷酸三钙为唯一磷源的平板上产生透明圈来确定。例如真菌无机磷培养基：蔗糖2g、葡萄糖2 g、NH4Cl 1.5g、KCl 0.3g、MgSO4.7H2O 0.4g、NaCl 0.2g、磷酸钙20g，蒸馏水1000 mL，pH7.0。如果筛选耐盐解磷菌株，则需要根据实地盐浓度在培养基中添加NaCl。第12页，共29页。解磷微生物的筛选就是在分离出的具有解磷能力的所有菌株中筛选出具有最强解磷能力的菌株。一般来说要以该解磷微生物将要应用的实际环境作为筛选实验的条件，即在与应环境相同的温度，pH值，盐度等条件下培养解磷微生物，以解磷能力最强（一般以培养基中有效磷含量
9、最高为标准）的菌株作为最优选择。第13页，共29页。四 解磷机制解磷微生物溶解难溶性磷化物的机制可归结为以下几类:(1)通过生命代谢活动产生有机酸(细菌一般分泌乳酸、氨基酸、草酸、延胡索酸和柠檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙二酸和乳酸等)，这些酸一方面直接溶解土壤中难溶性磷酸盐，另一方面则是通过鳌合作用释放出土壤磷素。(2)由NH4+同化作用放出质子降低pH值，引起磷酸盐溶解。(3)通过呼吸作用放出C02，降低环境pH值，从而引起磷酸盐的溶解。(4)磷细菌释放H2S，与磷酸铁进行化学反应产生硫酸亚铁和可溶性磷酸盐。(5)腐解植物残体而产生胡敏酸和富里酸。这两种酸能与复合磷酸盐中的钙、铁鳌合，从而释
10、放出磷酸根。它们也能与铁、铝及磷酸盐形成稳定的可溶性复合物，这些复合物可以被植物吸收利用。(6)微生物对钙离子的吸收，使磷酸根离子进入土壤溶液。(7)生物矿化作用。即通过分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶等物质，将磷酸脂等有机磷降解。第14页，共29页。五 解磷能力的测定 解磷能力是表征解磷微生物作用的重要指标，可采用定性法和定量法两种方法测定。定性法定性法一般指的是平板溶磷圈法;平板溶菌圈法:将溶磷菌株在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体平板培养基上培养，测定周围菌落产生透明圈的大小。无机磷平板一般采用磷酸钙盐固磷酸钙盐固体培养基体培养基，接种菌株培养数天后，以磷酸钙盐平板上菌落周围出现透明圈的视为有解
11、无机磷能力的菌株。有机磷平板一般采用卵黄平板培养基卵黄平板培养基，以卵黄平板上菌落周围出现混浊圈的视为有解有机磷能力(卵磷脂被水解形成脂肪和磷酸)。第15页，共29页。溶磷圈直径（D）和菌落生长直径(d)的比值(D/d)是表征解磷菌相对解磷能力的一个指标。第16页，共29页。定量法定量法包括液体培养法、土培法、砂培法和同位素示踪法。液体培养法:将含解磷微生物和不溶性磷化物(如Ca3(P04)2)的培养液和对照(不含解磷微生物)培养一定时间后，测定培养液中可溶性磷的含量。但在液体培养法中如何将溶磷菌分解的无机磷浸提出来并加以测定，不同的研究者采用的方法不同，总的可分为:培养液过滤法，离心取上清液
12、法，熏蒸、消煮法等。对处理后的培养液中磷含量一般都采用钼蓝比色法钼蓝比色法测定，其原理是利用一定的酸度条件下，加钼酸铵于含磷的溶液中，溶液中的正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸。H3PO4+12H2MoO4=H3PMo12O40+12H2O 在适宜试剂浓度下，加入适当的还原剂(如抗坏血酸)，使磷钼酸中的一部分Mo6+离子被还原为Mo5+，生成一种叫做“钼蓝”的物质，当将含不溶性无机磷的培养液经钼磷试剂处理后，培养液发生显色反应，通过比色法间接求出培养液中水溶性磷的含量。第17页，共29页。土培(或砂培)法:一般是通过接种解磷菌株到培养植物的土壤(或砂土)中，以不接种解磷菌的植株为对照，通过测定土壤
13、浸提液中有效磷的含量来评定解磷菌株的解磷能力。砂培法通常也结合同位素示踪法使用。同位素示踪法:在含标记有32P的不溶性磷化合物(有机磷或无机磷)的培养基内接种供试菌株，使菌体在培养过程中吸收32P，再用含32P的菌体(以含32P的不接种菌株培养基为对照)培育植物幼苗，测定该植株由标记的菌体内吸入的32P量比对照样处理的增加量，即为该菌体的解磷量。第18页，共29页。六 技术路线探讨苏北盐碱滩涂土壤解磷微生物的分离筛选高效解磷菌的鉴定高效解磷菌的鉴定高效解磷菌最佳培养条件高效解磷菌最佳培养条件高效解磷菌剂高效解磷菌剂第19页，共29页。分子鉴定分子鉴定 传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，即
14、通过培养后观察菌落形态和个体显微特征，将菌种鉴定到纲、门、科、属、种。然而真菌的形态特征复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不稳定或意见分歧。在真菌的现代分类学中引入了分子生物学技术鉴定方法，可以使菌种的鉴定在以形态特征和生理生化特征为基础的鉴定上更加准确、可靠。第20页，共29页。目前用于未知菌分类鉴定的核酸序列分析最常选用的目的片段是rDNA。真菌基因组中编码核糖体的基因包括4种，28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。间隔区是位于核糖体大小
15、亚基基因之间的核苷酸序列。位于28S rDNA的3 端与18S rDNA的5 端之间的序列称为核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)，ITS1位于18S rDNA和58S rDNA之间，ITS2位于5.8S rDNA和28S rDNA之间(见图1)第21页，共29页。第22页，共29页。rDNA是核基因组中的序列，受到细胞核中保护机制的保护，同时具有多变区和保守区，利用其保守区可以研究高级分类阶元关系，而利用多变区则也可研究种和种下关系。如核糖体DNA中18S，5.8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区I
16、TS1和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。(技术路线)第23页，共29页。发酵条件优化发酵条件优化 发酵条件优化一般分为两步：第一步确定各个培养因子的最佳种类，第二部确定各个最佳因子的最佳水平。第一步一般采用分别确定各因子最佳种类的方法。例如，在其他培养条件相同的情况下，选用同一水平的不同碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，糖蜜，小麦麸皮等）培养微生物，根据结果（如菌体鲜重，解磷能力等）选择出最佳碳源。第24页，共29页。第二步一般采用正交实验的方法。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多
17、因素多水多因素多水平平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。第25页，共29页。雅致放射毛霉液体深层培养条件及发酵培养基的优化研究（王丽英 王谦）第26页，共29页。第27页，共29页。微生物肥料 微生物肥料又称为菌剂或菌肥，是农业生产中使用的肥料制品中的一种，是以微生物生命活动导致农作物得到特定的肥料效应而促进其生长和产量的一类制品。已报道的我国解磷细菌肥料有用巨大芽孢杆菌为菌种生产的制品，还有一些在研究中证实有溶磷作用的细菌，但尚未在生产中应用，如一些假单胞菌，芽孢杆菌等。菌剂剂型从成品性状看，主要有固体和液体两种，液体的有发酵液直接装瓶的和矿油封面两种。固体菌剂有用草炭载体的粉剂和颗粒剂，有用蛭石作为吸附剂的，还有用发酵液浓缩后冷冻干燥的制品。第28页，共29页。谢谢！第29页，共29页。
