1、第三章 生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离第1页，共57页。第一节 生物材料的预处理第二节 细胞破碎第三节 液-固分离第2页，共57页。生物活性物质的存在特点（1）生物材料组成非常复杂，有些化合物在生物材料中含量极微，分离操作步骤多，不易获得高收率。（2）生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂，生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（3）操作过程中受到影响因素多第一节 生物材料的预处理第3页，共57页。一、预处理的目的和要求一、预处理的目的和要求生物材料中的生化组成数量大、种类多，目的物与杂质的理化性质十分接近，分离纯化较困难 目的改变
2、料液的流变特性，以及除去对后面纯化有影响的杂质 要求防止目的物的失活第4页，共57页。根据生物活性物质存在方式与特点 胞外：由细胞产生再释放出来的 无活性的酶原需活化：先活化再提取 先提取再活化二、确定预处理方法的依据 胞内：需先破碎细胞后提取 膜上的需先溶解下来第5页，共57页。2.后续操作的要求 一般要求：澄清、pH、一定的浓度 不同后续操作有不同的要求离子交换-高价无机离子、澄清度等严格控制溶剂萃取-蛋白质含量较低，防乳化第6页，共57页。3.目的物稳定性不稳定的：要防失活青霉素-pH4.8-5.2，低温蛋白类-高级结构稳定的：可采用较剧烈的变性和处理条件，沉淀杂质蛋白第7页，共57页。
3、三、动物材料的预处理绞肉机绞碎匀浆和组织捣碎第8页，共57页。四、细胞培养液的预处理为什么需要预处理？可溶性粘胶状物质：杂蛋白、不溶性多糖等粘度增加、影响提取操作粘度增加、影响提取操作无机盐在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。第9页，共57页。（1）加入凝聚剂凝聚作用：指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。1.细胞及蛋白质的处理第10页，共57页。胶体粒子稳定的原因：带同种电荷静电排斥作用表面水化作用，形成水化层无机盐促凝聚作用：加入相反电性电解质，中
4、和胶体表面电荷，降低了双电层的排斥力无机盐在水中的水化作用，破坏了胶粒水化层第11页，共57页。影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。通常培养液中细胞或菌体带负电荷，常采用高价阳离子促其凝固。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+常用的凝聚剂有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。第12页，共57页。（2）加入絮凝剂絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基团多絮凝作用：当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多
5、链节分别吸附在不同的颗粒的表面上，形成架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤。第13页，共57页。影响因素：分子量：大，效果好；过大，溶解度用量：低浓度增加用量有助架桥，浓度过高吸附饱和失去架桥作用，降低了效果。pH：影响功能团电离度，电离度，链伸展，效果操作条件：搅拌：初期，快好；后期，会破坏絮凝团第14页，共57页。（3）变性作用 天然蛋白质分子受到某些物理因素（如热、紫外线照射、高压和表面张力等）、化学因素（如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等）影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。用途：杂蛋白质变性沉淀析出方法：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂、
6、重金属盐或表面活性剂第15页，共57页。（4）吸附方法：加入吸附剂：活性碳除热原 加入反应剂：相互作用形成沉淀吸附蛋白质 四环素发酵液：黄血盐+硫酸锌 亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(CN)62的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液：氯化钙+磷酸盐 磷酸钙盐沉淀（吸附、助滤）第16页，共57页。（5）等电沉淀 常与其他方法合用（6）加各种沉淀剂沉淀 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀第17页，共57页。2.多糖的去除酶：转化为单糖如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）形成沉淀 第18页，共57页。Ca2+草酸、草酸、草酸
7、钠草酸钠形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）（注意回收草酸）Mg2+三聚磷酸钠三聚磷酸钠(Na5P3P10)形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物 Fe2+黄血盐黄血盐(K4Fe(CN)6)普鲁士蓝沉淀普鲁士蓝沉淀Ca2，Mg2，Fe3等（1）离子交换法（2）沉淀法3.高价金属离子的去除第19页，共57页。微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜 动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。第二节 细胞破碎 第20页，共57页。一、机械法 1、匀浆法 2、珠磨法 3、超声波三、化
8、学法1.化学试剂2.制成丙酮粉二、物理法1.干燥2.冻融3.渗透压冲击四、生物法1.酶解法2.自溶第21页，共57页。一、机械法1 高压匀浆法q定义利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程q工作原理：液液剪切力、压力差等q特点：z适用对象广z工业化、实验室中应用z细胞完全破碎第22页，共57页。1.高压匀浆器原理：进入高压室的细胞悬浮液被强迫通过一个狭窄的小孔，产生液相剪切力引起细胞破碎。第23页，共57页。易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易含有包含体的基因工程菌（因包含体坚
9、硬，易损伤匀浆阀）损伤匀浆阀）不宜采用高压匀浆法的微生物：不宜采用高压匀浆法的微生物：第24页，共57页。2 高速珠磨法q定义利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程q工作原理：固固剪切力、液固剪切力等q特点：适用对象较广工业化、实验室中应用细胞完全破碎需冷却第25页，共57页。2.高速珠磨机原理：玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，研磨作用，细胞破碎。第26页，共57页。WSK卧式高效全能珠磨机第27页，共57页。ZM系列系列卧式密闭珠卧式密闭珠(砂砂)磨机磨机第28页，共57页。3 超声波法q定义利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
10、q工作原理：空穴现象q特点：v适用对象一般v主要于实验室中应用v细胞完全破碎v需冷却，噪音第29页，共57页。3.超声波振荡器原理：利用超声波的空穴作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。第30页，共57页。影响因素：超声波的声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、pH、菌体的浓度和种类。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20左右。超声波破碎法在实验室和小规模生产中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到05，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。第31页，共57页。二、物理法1.干燥法 原理：干燥后，细胞膜渗透
11、性变化，部分菌体自溶，溶剂抽提得胞内物质。分类分类:空气干燥，空气干燥，真空干燥，喷雾干燥，冷冻干燥真空干燥，喷雾干燥，冷冻干燥 气流干燥气流干燥主要适用于酵母菌主要适用于酵母菌，一般在一般在2530的气的气流中吹干；流中吹干；真空干燥真空干燥多用于细菌多用于细菌；冷冻干燥；冷冻干燥适用于较适用于较不稳定的物质不稳定的物质。第32页，共57页。2.反复冻融法将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。原理：细胞膜疏水键结构破裂，增加细胞亲水性冰晶粒使细胞破裂适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻
12、融过程中可能引起某些蛋白质变性。次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。第33页，共57页。3.渗透压冲击法原理：细胞在浓盐中平衡，再投入水中膨胀破裂。第34页，共57页。第35页，共57页。三、化学法1.加入化学试剂采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。碱：溶解除细胞壁外大部分组分，改变pH，改变蛋白质的电荷性质有机溶剂：溶解细胞膜上脂质，破坏细胞，但易引起变性表面活性剂：改变膜的通透性，细胞溶解胞内异淀粉酶：0.1%SDS，30振荡30h第36页，共57页。2.丙酮粉保存+破碎脱水脱脂，细胞结构松散方法：组织或匀浆悬浮0.01mol/Lp
13、H6.5的磷酸缓冲溶液中，0 一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15 丙酮内，10min后离心过滤取其沉淀，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥得。第37页，共57页。四、生物法1.酶解法：机理：利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键第38页，共57页。常常用用的的溶溶酶酶G+溶菌酶溶菌酶G-溶菌酶、溶菌酶、EDTA放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶霉菌霉菌 几丁质酶、几丁质酶、植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物细胞壁溶解酶是几种酶的复合物-加入酶：溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等第39页，共57页。酶解法的优点发生酶解的条件温和发
14、生酶解的条件温和能选择性地释放产物能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等后步分离等但酶水解价格高，故小规模应用较广但酶水解价格高，故小规模应用较广 第40页，共57页。2.自溶：u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。以达到细胞自溶的目的。u微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。酵母细胞：4550，12-24h第41页，共57页。1.规模及成本大规模：高压匀浆、珠磨实验室规模：超声波振荡2.目的物的稳定性
15、干燥法、有机溶剂对活性影响大保护性措施3.破碎效果和产物释放率动物细胞：渗透压冲击、冻融法微生物细胞：结合酶法高释放率又不能使细胞碎片太小适宜的操作适宜的操作条件应从条件应从高高的产物释放的产物释放率率、低的能低的能耗耗和和便于后步便于后步提取提取这三方面这三方面权衡。权衡。五、选择破碎方法的依据第42页，共57页。机械法与非机械法破碎的比较机械法与非机械法破碎的比较项目机械法非机械法机理机理切碎细胞溶解局部壁膜内含物释放内含物释放全部部分（有选择）碎片大小碎片大小细小较大粘度粘度高低设备设备专用无应用范围应用范围工业化、实验实验研究第43页，共57页。第三节第三节 液固分离液固分离 n过滤
16、定义在一定的压力差下，将固液悬浮液通过一多孔性介质而实现固液分离的过程原理筛分过滤类型常规过滤、错流过滤常规过滤：料液流动方向和过滤介质垂直错流过滤：滤液给过滤介质表面一个平行的大流 量冲刷，多用薄而多孔的膜优点：收率高，质量好，减少处理步骤第44页，共57页。错流过滤：料液与过滤介质表面平行的大流量冲刷过滤收率高过滤收率高滤液质量好滤液质量好减少处理步骤减少处理步骤第45页，共57页。2.过滤设备板框过滤机第46页，共57页。真空鼓式过滤机第47页，共57页。3.过滤介质和助滤剂（1）过滤介质滤布或膜耐酸碱、高温、化学试剂、抗拉性能好、有一定的机械强度和孔隙度等第48页，共57页。（2）助滤
17、剂要求为惰性物质、无毒、有一定细度及硬度，成本低廉。加入方法：预铺法：预铺在过滤机上 混合法：与发酵液一起加入 生成法：反应中生成沉淀 新生霉素发酵液：常用有：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素等第49页，共57页。二二.离心分离离心分离 定义在离心场作用下，料液中固体依据其与介质密度的不同达到固液分离的过程原理密度差类型沉降式、过滤式离心设备管式、套筒式、碟式、篮式等 优点：速度快，效率高，卫生条件好，占地面积 小，能自动化连续化操作，适合大规模分离过程第50页，共57页。第51页，共57页。Tubular bowl第52页，共57页。第53页，共57页。三、影响液固分离的因素微生物种类发酵液的黏度
18、其他：pH，温度，加热时间，助滤剂第54页，共57页。思考题1.凝聚作用和絮凝作用的原理各是什么？2.常用的细胞破碎方法有哪些？3.固液分离方法有哪些？第55页，共57页。细胞破碎方法目的目的：使胞内产物获得最大程度的释放方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例机机械械法法匀浆法匀浆法细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中适中适中动物组织及动动物组织及动物细胞物细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中便宜便宜超声波法超声波法用超声波的空穴作用使用超声波的空穴作用使细胞破碎细胞破碎适中适中昂贵昂贵细胞悬浮液小细胞悬浮液小规模处理规模处理高速匀浆法高速匀浆法使细胞通过的小
19、孔，使使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎细胞受到剪切力而破碎剧烈剧烈适中适中细胞悬浮液大细胞悬浮液大规模处理规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃或铁珠捣碎细胞被玻璃或铁珠捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液和细胞悬浮液和植物细胞大规植物细胞大规模处理模处理第56页，共57页。方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例物理法物理法生物法生物法化学法化学法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和便宜便宜血红细胞的破血红细胞的破坏坏干燥法干燥法细胞膜渗透性变化细胞膜渗透性变化剧烈剧烈低低冻融法冻融法胞内冰晶引起细胞破裂胞内冰晶引起细胞破裂温和温和低低酶消化法酶消化法细胞壁被消化，使细胞破碎细胞壁被消化，使细胞破碎温和温和昂贵昂贵组织自溶组织自溶法法组织中的酶改变破坏细胞结组织中的酶改变破坏细胞结构构温和温和低低增溶法增溶法表面活性剂溶解细胞壁表面活性剂溶解细胞壁温和温和适中适中胆盐作用于大胆盐作用于大肠杆菌肠杆菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细胞壁并使之有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳失稳适中适中便宜便宜甲苯破碎酵母甲苯破碎酵母细胞细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使细胞壁融解碱的皂化作用使细胞壁融解剧烈剧烈便宜便宜制丙酮粉制丙酮粉丙酮脱水破坏结合键丙酮脱水破坏结合键温和温和高高第57页，共57页。
