1、抗体药物抗体药物张忠山第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改进鼠源性单克隆抗体的改进 改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道，见书中表4-4，给出了改造后的单抗的类型和特性。一、人一、人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 制备方法：提取杂交瘤细胞系的mRNA，经过逆转录成cDNA，并以其为模板，采用特异引物，用PCR方法分别扩增VL和VH基因，再分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，将VL基因克隆到人Ig的CL基
2、因表达载体上，将VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表达载体上，再将人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，转染后用含霉酚酸进行筛选，形成集落的细胞即为共转染细胞，所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠IgG1或IgG2b，则可有效地加强多肽的ADCC效应与免疫调理作用。二、改形抗体二、改形抗体 如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消
3、除免疫原性。这种改形抗体（reshaping antibody）又称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）。书中表4-5给出几种改形抗体及其潜在的临床应用。三、小分子抗体三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的1/80-1/3。也就是说，保留了CDR区，而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型：（1）Fab抗体，由完整的轻链和重链（VH和CH1）所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（single chain antibody SCA 或sing
4、le chain FV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。四、双功能抗体四、双功能抗体 双功能抗体就是双特异性抗体（biospecific antibody,BsAb）。它是一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法 2、生物学
5、方法（杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的 杂种-杂交瘤细胞。3、基因工程方法 采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性（SCFV)2。五、抗体融合蛋白五、抗体融合蛋白 抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新特性，称之为抗体融合蛋白。类型有：（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（4）受体-FV型融合蛋白。（5）酶-抗体型融合蛋白。其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶
6、-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。构建抗体融合蛋白的原则是：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。噬菌体抗体库技术的原理，简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克
7、隆扩增。第四节第四节 抗体工程抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获得目的基因 2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。4、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程。二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库
8、抗体文库1011库容，能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。VH和VL随机重组增加抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术 3、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库中，VH 和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，因此产生的抗体必然都是高亲和力的。三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗体的表达 1、原核细胞表达：融合表达、分泌型表达 2、真核细胞表达 3、转基因植物表达 4、转基因动物表达 融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融
9、合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。第五节第五节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂一一、血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂（1 1）鉴定病原菌用的抗体试剂）
10、鉴定病原菌用的抗体试剂A、常用诊断血清的品种和用途B、诊断血清的制备步骤a、制备细菌抗原：细菌接种-培养-收集菌苔-制成菌液。b、免疫动物和制备抗体血清：动物：家兔、马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-7次，每次间隔3-4d，末次注射后6-8d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应（2 2）乙型肝炎病毒表面抗原（）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）的反向被）的反向被动血凝诊断试剂动血凝诊断试剂 A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有
11、HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。反向间接凝集反应 B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠-获得抗HBs血清-硫酸铵盐析/柱层析-取其IgG-在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：RPHA法 在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，许血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。（3 3）妊娠诊断试剂）妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕。（4 4）抗）抗ABOABO血型系统血清血型系统血清 凝集原附着在红细
12、胞表面，是一种抗原。凝集素存在于血浆（或血清）中，是抗同名凝集原的抗体。同名的凝集原和凝集素相遇（如凝集原A和抗A凝集素）会发生红细胞凝集。红细胞上只有凝集原A的为A型血，其血清中有抗B凝集素；红细胞上只有凝集原B的为B型血，其血清中有抗A的凝集素；红细胞上A、B两种凝集原都有的为AB型血，其血清中无抗A、抗B凝集素；红细胞上A、B两种凝集原皆无者为O型，其血清中抗A、抗B凝集素皆有。具有凝集原A的红细胞可被抗A凝集素凝集；抗B凝集素可使含凝集原B的红细胞发生凝集。输血检测输血检测 将供血者的红细胞与受血者的血清（主侧主侧）及受血者的红细胞与供血者的血清（次次侧侧），分别做配血试验，观察有无凝
13、集反应。主侧出现凝集反应，为配血不合，不能输血，主侧无凝集反应，次侧出现凝集反应，为配血基本相合，在紧急情况下才可输血，但要特别慎重，不可输得太快、太多，并不可输得太快、太多，并密切观察有无输血反应密切观察有无输血反应。防止出现新生儿溶血症新生儿溶血症，O型血的妇女型血的妇女与A型、B型或AB型的男子结婚后，怀孕后所得的胎儿可分A型、B型、AB型。胎儿由父亲遗传而获得血型抗原为母亲所缺少，这中抗原通过胎盘进入母体，刺激母体产生刺激母体产生相应的免疫抗体，相应的免疫抗体，抗体又进入胎儿体内，抗原抗体相结合使胎儿细胞凝集破坏胎儿细胞凝集破坏，发生溶血，可出现流产和死胎。母胎血型不合的新生儿可出现早
14、发性黄疸早发性黄疸，发生心力衰竭或黄疸后遗症，抢救不及时，则造成脑性瘫痪、呆傻甚至死亡。二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规方法难以观察或检测的反应得以显现，因而大幅度提高抗原抗体反应的敏感性，用于对微量抗原物质进行定性或定量检测，结合显微镜或电子显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除用于临床诊断外，还能为探讨发病机制提供有力的研究手段。免疫标记技术有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫技术。1 1、荧光抗体诊断试剂、荧光抗体诊断试剂 荧光色素如异硫氰酸荧光素（FITC）
15、等标记抗体球蛋白，即成为荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成为可发光的可视物，从而达到诊断或定位的目的。（1）荧光抗体的制备 （2）免疫荧光测定法有直接和间接两种方法。2、免疫酶抗体诊断试剂 免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，本法分为免疫酶染色和酶免疫测定两种类型。（1）免疫酶染色法用抗体诊断试剂：常用的酶为HRP，其底物为二氨基联苯胺（DAB），两者作用可生成棕褐色沉淀物质，使抗原呈色。（2）酶免疫测定用抗体诊断试剂：重点掌握酶免疫法的基本概念。比如ELISA方法（夹心法、间接法）。（3）放射免疫用抗体诊断试剂 把同位素分析的高灵
16、敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。常用的标记抗体试剂：HBsAg、HBeAg、HAV抗原、AFP、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂。第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物 以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有20多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，受试病人超过数千例。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅30%。目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应用阶段。障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应。常用的抗癌药物常用的抗癌药物：氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM)、丝裂霉素(mitomycin,MMC)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、新抑癌蛋白(neocarzinostatin,NCS)、正定霉素(doxorubicin,DOX)等。
