1、2022-8-17第11章基因工程新技术第第11章基因工程新技术章基因工程新技术第11章基因工程新技术1.Red 和和 RecET 重组系统及其应用重组系统及其应用2.位点特异性重组系统及其应用位点特异性重组系统及其应用3.基因打靶基因打靶4.基因抑制技术基因抑制技术第11章基因工程新技术n早在早在1990s,研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源重组系统，仅需要重组系统，仅需要2040bp长的同源区即可发生重组。可以方长的同源区即可发生重组。可以方便的利用便的利用 PCR产物进行基因打靶或替换。产物进行基因打靶或替换。n细菌的同源重组频率较低，且
2、需要较长的同源区段细菌的同源重组频率较低，且需要较长的同源区段.1.Red 和和 RecET 重组系统及其应用重组系统及其应用E.coli 自身的同源重组系统主要包括：自身的同源重组系统主要包括：RecBCD,RecE,RecF系统，其重组效率均较低，且对同源区要求为：系统，其重组效率均较低，且对同源区要求为：12 kb。最主要的重组系统最主要的重组系统RecBCD在在 dsDNA 同源区为同源区为 50100 kb(通过接合转移和转导通过接合转移和转导)，才能高效重组。经修饰过的，才能高效重组。经修饰过的RecBCD及及 RecA 系统能在系统能在 Chi 位点位点 (crossover h
3、otspot instigator,GCTGGTGG)高效重组，同源区段长度一般不低高效重组，同源区段长度一般不低于于5kb，重组需要，重组需要DNA片段两端有同向的片段两端有同向的CHI位点。如果人位点。如果人工构建这样的片段，工构建这样的片段，其重组几率为其重组几率为10-5第11章基因工程新技术 1998年左右，随着对年左右，随着对噬菌体重组系统的深入研究，发现该重噬菌体重组系统的深入研究，发现该重组系统可以在组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极中实现高效同源重组，且同源区长度要求极低：约低：约40bp。后来，在。后来，在Rac噬菌体中发现类似的重组系统。随着噬
4、菌体中发现类似的重组系统。随着该技术的应用，出现了一个新的术语：该技术的应用，出现了一个新的术语：Recombineering(recombination-mediated genetic engineering)is a genetic and molecular biology technique based on homologous recombination systems in E.coli and other bacteria mediated by phage proteins,either RecE/T from Rac prophage or Red alpha/beta/
5、gamma from bacteriophage lambda第11章基因工程新技术Red/ET recombination systems are highlighted by their ability to cross PCR-generated substrates bearing small regions of homology to the target gene (4050 bp)into bacterial chromosomes,allowing bacterial geneticists to performPCR-mediated gene replacement第11
6、章基因工程新技术(1)Red 系统系统 及及 rac 噬菌体的噬菌体的 RecET系统的原理系统的原理Red 系统包括系统包括3个基因个基因:exo,bet 和和 gam exo 基因编码基因编码 核酸外切酶，其活性形式是一种环状三聚物分子核酸外切酶，其活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链通道的一端可容纳双链DNA 分子分子,另一端另一端只可容纳单链只可容纳单链DNA。Exo 蛋白可结合在双链蛋白可结合在双链DNA 的末端的末端,从从DNA 双链的双链的5端向端向3端降解端降解DNA,产生产生3突出端。突出端。(RecE)Beta 蛋白是一种
7、退火蛋白蛋白是一种退火蛋白,自发地形成环状结构自发地形成环状结构(1218 subunits per ring),紧紧地结合在单链紧紧地结合在单链DNA3突出端突出端,防止防止DNA 被单链核酸被单链核酸酶降解酶降解,同时介导互补单链同时介导互补单链DNA 的退火的退火,双链双链DNA退火完成退火完成后后,Beta 蛋白从蛋白从DNA 双链上解离下来。双链上解离下来。Beta 蛋白在蛋白在Red 同源重组同源重组过程中起着决定性的作过程中起着决定性的作(RecT)Gam 蛋白可与蛋白可与RecBCD 结合结合,抑制其核酸外切酶活性，防止对外抑制其核酸外切酶活性，防止对外源源DNA 的降解的降解
8、。宿主菌用。宿主菌用recBCD缺陷株有利于该系统的高效重缺陷株有利于该系统的高效重组。组。Red 系统的重组效率约比系统的重组效率约比 RecET系统高系统高3倍。倍。第11章基因工程新技术第11章基因工程新技术(2)主要应用主要应用需要辅助质粒，上面带有诱导表达的重组系统。为避免本底需要辅助质粒，上面带有诱导表达的重组系统。为避免本底表达对细胞的影响（毒性、诱变等效应），辅助质粒多为温表达对细胞的影响（毒性、诱变等效应），辅助质粒多为温敏性质粒，可在高温下被消除。敏性质粒，可在高温下被消除。PCR产物扩增产物扩增诱导培养含诱导培养含pKD46大肠杆菌大肠杆菌转化转化PCR片段，培养片段，培
9、养2h后涂布抗性平板，高温培养后涂布抗性平板，高温培养I 基因敲除及基因敲除及markerfree操作（需结合位点特异性重组技术）操作（需结合位点特异性重组技术）第11章基因工程新技术II 结合反向筛选进行基因替换结合反向筛选进行基因替换正向筛选：含有标记基因的克隆在筛选平板上长出，不含标记基因则死亡。正向筛选：含有标记基因的克隆在筛选平板上长出，不含标记基因则死亡。反向筛选：也称为负筛选，含有标记基因的克隆死亡，不含标记基因的克反向筛选：也称为负筛选，含有标记基因的克隆死亡，不含标记基因的克隆正常生长隆正常生长catsacBgene Agene A MutantcatsacBcatsacBg
10、ene A MutantStep 1Step 2例：例：cat正筛选标记，正筛选标记，sacB负筛选标记负筛选标记chloramphenicolMediumsucrose重叠延伸PCR基因基因敲除敲除第11章基因工程新技术catsacBgene Agene AcatsacBcatsacB gene AStep 1Step 2Gene inversion（small fragment)第11章基因工程新技术III 介导单链介导单链DAN重组，进行基因修饰重组，进行基因修饰n如果向细胞中导入如果向细胞中导入 ssDNA(DNA oligo),则不需要则不需要Exo蛋白就能蛋白就能够与同源区退火，实
11、际上，够与同源区退火，实际上，Bet单独作用可以单独作用可以 使使70-base ssDNA oligo(SSO)与染色体的同源区退火互补而发生重组，与染色体的同源区退火互补而发生重组，其频率约其频率约 2 105/108,比比dsDNA 略高。略高。n 如果存在如果存在 Gam蛋白，则重组效率可提高蛋白，则重组效率可提高(5-fold）.4060 bp 单链的重组效率下降单链的重组效率下降 5倍。另外，和滞后链重组的效率高于前倍。另外，和滞后链重组的效率高于前导链。导链。n由于由于 不能插入标记基因，使得其只能应用于具有明显表型特不能插入标记基因，使得其只能应用于具有明显表型特征的基因修饰。
12、征的基因修饰。改进：改进：MMR(specifcally remove the oligo-directed base change)系统缺陷株中，重组效系统缺陷株中，重组效率会提高率会提高2个数量级，可高达个数量级，可高达25%！这意味着！这意味着不再需要标记基因，可以进行数个碱基的替换、不再需要标记基因，可以进行数个碱基的替换、插入或缺失。插入或缺失。mutS:Methyl-directed Mismatch Repair第11章基因工程新技术重大改进：重大改进：MAGE技术（技术（Multiplex Automated Genome Engineering）1.多种多种ssDNA并行并行
13、重组，同时进行多重组，同时进行多位点修饰。位点修饰。2.多轮循环重组，多轮循环重组，提高多位点修饰的提高多位点修饰的几率几率3.适于高通量的随适于高通量的随机优化机优化缺点：对于多位点缺点：对于多位点随机优化，需要高随机优化，需要高通量筛选技术，或通量筛选技术，或具有明显的表型特具有明显的表型特征征 只能进行短序列只能进行短序列的修饰（如的修饰（如RBS位位点）点）第11章基因工程新技术Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolutionNature 460,894-898 第11章基因工程新技术
14、markermarker2IV 染色体大片段复制染色体大片段复制 复制染色体上的基因：复制染色体上的基因：加入加入PCR产物，引物设计时上游引物与目标基因下产物，引物设计时上游引物与目标基因下游序列同源，下游引物与目标基因上游序列同源，第一次重组造成染色体游序列同源，下游引物与目标基因上游序列同源，第一次重组造成染色体断裂，第二次重组一条染色体修复，并造成目标基因多一个拷贝。断裂，第二次重组一条染色体修复，并造成目标基因多一个拷贝。引物设计时加入同向排列的特异性位点，可弹出引物设计时加入同向排列的特异性位点，可弹出MARKER 应用该技术可复制长达应用该技术可复制长达1Mbp的序列。的序列。第
15、11章基因工程新技术2.位点特异性重组系统及其应用位点特异性重组系统及其应用n位点特异性重组位点特异性重组 重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列,供重组蛋白识别。供重组蛋白识别。n位点特异性重组与同源重组的区别位点特异性重组与同源重组的区别 重组位点限制：重组位点限制：有有 同源序列的长短：短同源序列的长短：短 重组酶的专一性：有重组酶的专一性：有 重组效率：重组效率：高达高达100%n常见的位点特异性重组系统常见的位点特异性重组系统 噬菌体系统：噬菌体编码整合酶（integrase，Int 重组酶，不可逆）、来自E.coli的整合作用宿主因
16、子（IHF，integration host factor）、切除酶（excisionase）P1噬菌体系统噬菌体系统:Cre重组酶（可逆）重组酶（可逆）2 m质粒系统：质粒系统：FLP重组酶（可逆）重组酶（可逆）链霉菌噬菌体 C31系统 （不可逆）均可广泛应用于真核细胞中均可广泛应用于真核细胞中第11章基因工程新技术两边为两边为13bp13bp反向重复序列，中间位反向重复序列，中间位8bp8bp非对称核心序列非对称核心序列第11章基因工程新技术（1）重组机理重组机理u如果一个如果一个DNA分子上分子上两个特异位点之间发两个特异位点之间发生重组，其后果有两生重组，其后果有两种可能性：种可能性：
17、两个位点两个位点之间的片段或丢失，之间的片段或丢失，或被颠倒或被颠倒u生物能够利用这种重生物能够利用这种重组倒置来控制基因的组倒置来控制基因的表达因为表达因为DNA的一正的一正一倒两种排列法可以一倒两种排列法可以相应地表达两种不同相应地表达两种不同的蛋白质，细胞就可的蛋白质，细胞就可根据需要作出选择。根据需要作出选择。CreCre重组酶催化位点：重组酶催化位点：loxPloxP位点位点loxPloxPloxPloxP第11章基因工程新技术u当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以发生位点特异性整合，但必须解决整合的稳定性问题发生位点特异性整合
18、，但必须解决整合的稳定性问题loxp 位点的点突变位点的点突变Cre酶无法有效识别酶无法有效识别降低基因丢失几率降低基因丢失几率：突变点：突变点第11章基因工程新技术loxp 位点的点突变位点的点突变Cre酶无法有效识别酶无法有效识别实现稳定的基因颠倒实现稳定的基因颠倒：突变点：突变点或者采用类似于或者采用类似于red系统的策略，重组酶基因在温敏性辅助质粒上诱导表达系统的策略，重组酶基因在温敏性辅助质粒上诱导表达第11章基因工程新技术（2）主要应用）主要应用 I 利用位点特异性重组控制转入基因的表达利用位点特异性重组控制转入基因的表达将一个序列置于目标基因与其启动子之间（如转录终止单元将一个序
19、列置于目标基因与其启动子之间（如转录终止单元loxP序列）序列）阻遏基因的表达阻遏基因的表达将将cre基因置于诱导启动子控制之下，控制基因置于诱导启动子控制之下，控制Cre 重组酶的表达，从而控制重组酶的表达，从而控制目标基因的表达目标基因的表达loxPloxP第11章基因工程新技术II 条件缺失突变体的构建条件缺失突变体的构建u在目标基因的两侧引入特异性重组位点在目标基因的两侧引入特异性重组位点u将将cre基因置于诱导启动子或具有组织特异性的启动子控基因置于诱导启动子或具有组织特异性的启动子控制之下，在某种条件下使制之下，在某种条件下使Cre 重组酶表达，从而缺失目标重组酶表达，从而缺失目标
20、基因基因 优点：同源重组造成优点：同源重组造成“完全的完全的”基因敲除，而同源重组和位点特异性基因敲除，而同源重组和位点特异性重组结合后可以对基因敲除进行时间和空间上的控制，例如重组结合后可以对基因敲除进行时间和空间上的控制，例如 可以研可以研究致死型基因在特殊发育阶段的效应、研究基因是否在某种组织中表究致死型基因在特殊发育阶段的效应、研究基因是否在某种组织中表达。达。u要避免要避免Cre 重组酶的背景活性重组酶的背景活性第11章基因工程新技术III 利用位点特异性重组进行染色体工程利用位点特异性重组进行染色体工程markermarkermarker1marker2 FRT/loxP FRT/
21、loxP FRT/loxP FRT/loxP FRT/loxP FRT/loxP 位点特异性重组位点特异性重组大肠杆菌中采用该方式一次性大肠杆菌中采用该方式一次性删除删除117-165-kbp片段，效率片段，效率100%Marker free操作，但不属于无痕操作，但不属于无痕操作，每次重组留下一个疤痕，操作，每次重组留下一个疤痕，造成极性效应，多影响下游基因造成极性效应，多影响下游基因表达。多个疤痕对后续操作也有表达。多个疤痕对后续操作也有不利影响不利影响第11章基因工程新技术例：植物中染色体大片段的缺失例：植物中染色体大片段的缺失gusA：编码编码-葡葡(萄萄)糖糖苷酸酶，报告基因苷酸酶，
22、报告基因 Ds:植物转座子植物转座子 第11章基因工程新技术 染色体大片段颠倒：染色体大片段颠倒：两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞的两个位点之间序列颠倒。的两个位点之间序列颠倒。FRT/loxP FRT/loxP marker1marker2marker1marker2基因融合基因融合tag sequenceloxP/FRT sequencegene AC terminal sequence(no translation stop signal)markergene Amarkermolecular cloning free 第11章
23、基因工程新技术A single chromosomal FRT site becomes the substrate for recombination with FRT-containing replication-deficient plasmids that carries lacZ and lacY,designed in such a way to create either a transcriptional or translational fusion to the promoter of interest.第11章基因工程新技术3.3.基因打靶及无痕操作技术基因打靶及无痕操作
24、技术基因打靶：基因打靶：利用外源利用外源DNADNA与染色体与染色体DNADNA的同源性进行同源重组，的同源性进行同源重组，从而定点修饰改造染色体从而定点修饰改造染色体DNADNA的一类技术。的一类技术。（1）主要方法主要方法 单交换同源重组单交换同源重组 双交换同源重组双交换同源重组 二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）其它无痕操纵技术其它无痕操纵技术第11章基因工程新技术I 单交换同源重组法单交换同源重组法 利用整合性质粒上与染色体利用整合性质粒上与染色体DNA同源的区段进行同源重组，通过整同源的区段进行同源重组，通过整合性质粒插入染色体来达到对染色
25、体合性质粒插入染色体来达到对染色体DNA的复制、失活、启动子替换等的复制、失活、启动子替换等目的。目的。原理图：原理图：启动子启动子+完整完整orfA:复制复制orfA的的5端或中间区域：失活端或中间区域：失活orfA的的3端区域：对基因端区域：对基因A表表达无影响，在染色体上多了一达无影响，在染色体上多了一个不完整的个不完整的orfA拷贝（缺拷贝（缺5端）端）诱导启动子诱导启动子+5端：实现端：实现A基因基因的启动子替换、构建条件敲除的启动子替换、构建条件敲除株株第11章基因工程新技术构建整合质粒：原启动子构建整合质粒：原启动子+orfA5端与报告基因的融合片段（转录融合、端与报告基因的融合
26、片段（转录融合、翻译融合均可）翻译融合均可）可以通过报告基因研究原启动子的表达规律，即基因可以通过报告基因研究原启动子的表达规律，即基因A的表达规律的表达规律第11章基因工程新技术p对于高效短同源重组系统，可用两端有短同源区的对于高效短同源重组系统，可用两端有短同源区的PCR产产物直接进行基因打靶（见物直接进行基因打靶（见 red系统），省去克隆步骤。系统），省去克隆步骤。p对于长同源区重组系统，无法通过对于长同源区重组系统，无法通过PCR引物引入同源区，引物引入同源区，需要经过多次克隆构建基因打靶质粒，然后转化质粒进行需要经过多次克隆构建基因打靶质粒，然后转化质粒进行基因打靶基因打靶 II
27、双交换同源重组双交换同源重组Marker2Marker2可实现基因敲除可实现基因敲除(B)及基因的异位整合表及基因的异位整合表达达(A)orfB第11章基因工程新技术白喉毒素白喉毒素A基因（基因（DTPA)的负筛选作用：的负筛选作用：A亚基抑制蛋白合成，不需加筛亚基抑制蛋白合成，不需加筛选药物，从而避免真核细胞的非同源重组整合选药物，从而避免真核细胞的非同源重组整合neo基因的正筛选作用，对氨基糖苷类抗生素基因的正筛选作用，对氨基糖苷类抗生素G418的抗性的抗性单纯疱疹病毒胸苷激酶单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)基因的负筛选作用，基因的负筛选作用，将丙氧鸟苷或将丙氧鸟苷或非非阿尿苷（阿尿苷
28、（FIAU）变为毒性物质，在含）变为毒性物质，在含丙氧鸟苷或丙氧鸟苷或FIAUFIAU培养基中筛选培养基中筛选基因寻靶质粒基因寻靶质粒Cre表达质粒表达质粒突变基因突变基因动物基因打靶过程：动物基因打靶过程：P319 图图14.1，若不需弹出筛选标记见图，若不需弹出筛选标记见图14.2第11章基因工程新技术III 二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）通过重叠延伸通过重叠延伸PCR技术连接片技术连接片段段A和和C，缺失，缺失B片段（数十片段（数十数百数百个密码子序列），个密码子序列），得到的得到的AC片段的片段的编码产物缺失了部编码产物缺失了部分氨基酸。分
29、氨基酸。如果将该如果将该AC片段片段替代染色体上替代染色体上ABC片段，即可片段，即可实现基因打靶，而实现基因打靶，而且是无痕操作，没且是无痕操作，没有任何多余的核苷有任何多余的核苷酸残留的染色体上。酸残留的染色体上。第11章基因工程新技术uppcatABCMCSblaACSingle crossoverGrowth on MSM medium containing 20?M 5FUC region recombinationA region recombinationABCACWild typeMarkerless B konckoutStep 3第11章基因工程新技术也可利用二次单交换同源
30、重组进行等位基因置换也可利用二次单交换同源重组进行等位基因置换 第11章基因工程新技术第11章基因工程新技术IV IV 其它无痕操作技术其它无痕操作技术Using this method,Kolisnychenko et al.deleted 0.37 Mb of E.coli DNA consisting of cryptic prophages,transposons,damaged genes and genes of unknown function.This strain MDS12 resulted in a 8.3%reduction of genome contentSceI+
31、recA 重组系重组系统：统：设计设计PCR产物（含产物（含酶切位点酶切位点 red同源同源重组重组诱导诱导SceI表达表达recA重组修复重组修复第11章基因工程新技术4.基因抑制技术基因抑制技术4.1 核酸水平的基因抑制核酸水平的基因抑制 （1）反义核酸技术）反义核酸技术 （2）共抑制）共抑制 （3）RNA干涉干涉 （4）核酶构件）核酶构件 第11章基因工程新技术（1）反义核酸技术）反义核酸技术正义链正义链反义链反义链 反义技术：反义技术：根据碱基互补原理，表达天然的或人工合成的与根据碱基互补原理，表达天然的或人工合成的与特定基因互补的反义核酸（特定基因互补的反义核酸（RNA或或DNA)片
32、段，在胞内形成片段，在胞内形成双链体，从而对特定基因的表达进行抑制或封闭的技术。双链体，从而对特定基因的表达进行抑制或封闭的技术。反义核酸是细胞中（主要在原核细胞中）天然存在的一反义核酸是细胞中（主要在原核细胞中）天然存在的一种调节分子，可以调节基因的转录、种调节分子，可以调节基因的转录、mRNA剪切或修饰、蛋剪切或修饰、蛋白质的翻译过程。白质的翻译过程。4.1 核酸水平的基因抑制核酸水平的基因抑制5335+-第11章基因工程新技术构建反义基因表达载体，转化入反义基因，持续稳定地抑制构建反义基因表达载体，转化入反义基因，持续稳定地抑制基因表达。或者直接将反义核酸片段导入细胞，对基因表达基因表达
33、。或者直接将反义核酸片段导入细胞，对基因表达进行短期干扰。进行短期干扰。根据作用方式不同可将反义核酸技术分为根据作用方式不同可将反义核酸技术分为3类：类：反义反义DNA技术：合成的反义寡脱氧核苷酸被摄入靶细胞并技术：合成的反义寡脱氧核苷酸被摄入靶细胞并与靶与靶mRNA结合，干扰结合，干扰mRNA的转录或阻断蛋白翻译；的转录或阻断蛋白翻译；反义反义RNA技术：将反义寡脱氧核苷酸序列连接到载体技术：将反义寡脱氧核苷酸序列连接到载体(病病毒、质粒上毒、质粒上)导入靶细胞，载入的寡核苷酸转录出反义导入靶细胞，载入的寡核苷酸转录出反义RNA，与靶与靶mRNA交联，封闭交联，封闭mRNA蛋白翻译过程；（最
34、主要的一蛋白翻译过程；（最主要的一类）类）核酶技术：核酶是一类具有酶特性的核酶技术：核酶是一类具有酶特性的RNA分子，通过催化分子，通过催化靶位点靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达分子，从而阻断基因的表达第11章基因工程新技术反义反义RNA的抑制效果与的抑制效果与RNA二级结构有重要关系。在原核细二级结构有重要关系。在原核细胞中，反义胞中，反义RNA以针对以针对SD序列效果最好，而在真核细胞中以序列效果最好，而在真核细胞中以5 端非编码区为标靶最有效。端非编码区为标靶最有效。主要作用机理有以下几种：主要作用机理
35、有以下几种：mRNA5端非翻译区，包括端非翻译区，包括sD序列或核糖体结合位点序列或核糖体结合位点(RBS)；mRNA5端编码区，主要是起始密码端编码区，主要是起始密码AUG区域；区域；mRNA5末端帽子形成位点区域末端帽子形成位点区域,阻止阻止mRNA的成熟及其向胞浆中的转运。的成熟及其向胞浆中的转运。前体前体mRNA外显子与内含子结合部位外显子与内含子结合部位,干扰剪切和拼接干扰剪切和拼接.mRNA polyA形成位点区域，形成位点区域，阻止阻止mRNAmRNA的成熟，降低稳定性的成熟，降低稳定性 与其靶与其靶mRNA结合形成杂交链，容易使结合形成杂交链，容易使RNaseH等核酸酶降解等核
36、酸酶降解mRNA第11章基因工程新技术 反义反义RNA技术的特点技术的特点特异性强特异性强操作简便，靶操作简便，靶mRNA范围广范围广安全性较好安全性较好抑制基因表达的效率不稳定抑制基因表达的效率不稳定稳定性方面的改进：稳定性方面的改进：对于直接导入细胞的反义核酸，可以使用氨基磷酸核苷酸、硫代磷对于直接导入细胞的反义核酸，可以使用氨基磷酸核苷酸、硫代磷酸核苷酸等经过化学修饰的底物进行合成，可以更好的抵抗核酸酶酸核苷酸等经过化学修饰的底物进行合成，可以更好的抵抗核酸酶的破坏。另外需要增加核酸进入细胞的能力，例如用脂质体包裹、的破坏。另外需要增加核酸进入细胞的能力，例如用脂质体包裹、与多聚赖氨酸等
37、连接与多聚赖氨酸等连接对于体内表达，可在反义对于体内表达，可在反义DNA片段的片段的5端、端、3端加上多余的序列，形端加上多余的序列，形成成5端、端、3端的发卡结构，抵御核酸酶降解。端的发卡结构，抵御核酸酶降解。第11章基因工程新技术（2）共抑制）共抑制n在宿主中导入单个或多个基因拷贝后引起转入的基因表达受在宿主中导入单个或多个基因拷贝后引起转入的基因表达受到抑制，若转入基因在染色体上有同源基因，还可同时抑制到抑制，若转入基因在染色体上有同源基因，还可同时抑制染色体上同源基因的表达染色体上同源基因的表达n该现象首先在植物中发现，其机制非常复杂，可能和转录中该现象首先在植物中发现，其机制非常复杂
38、，可能和转录中及转录后的基因沉默有关，及转录后的基因沉默有关，是植物抵抗外来核酸入侵（如病是植物抵抗外来核酸入侵（如病毒）的一种反应毒）的一种反应 1990年，年，Napoli等等为了加深牵牛花的颜色，转入了多拷贝的牵牛花色素为了加深牵牛花的颜色，转入了多拷贝的牵牛花色素合成基因（编码查儿酮合成酶合成基因（编码查儿酮合成酶,可催生红色素），但在部分牵牛花中发现可催生红色素），但在部分牵牛花中发现颜色没有变深，反而变浅，甚至部分花朵为纯白色。颜色没有变深，反而变浅，甚至部分花朵为纯白色。n转基因沉默可以发生在染色体上、转录和转录后三种不同的转基因沉默可以发生在染色体上、转录和转录后三种不同的层次
39、上。发生在染色体上的转基因沉默叫做层次上。发生在染色体上的转基因沉默叫做位置效应位置效应，发生，发生在在RNA转录水平上的转基因沉默叫做转录水平上的转基因沉默叫做转录失活转录失活(transcriptional inactivation)，而发生在转录后水平的转基因，而发生在转录后水平的转基因沉默的主要形式是沉默的主要形式是转录后共抑制转录后共抑制(post-transcriptional cosunpression)，共抑制对真核细胞的基因表达是一个障碍。，共抑制对真核细胞的基因表达是一个障碍。第11章基因工程新技术n位置效应：转入基因（可以是单拷贝）在寄主染色体基因位置效应：转入基因（可以
40、是单拷贝）在寄主染色体基因组上的插入部位及其周围的核苷酸组成，对入转基因表达组上的插入部位及其周围的核苷酸组成，对入转基因表达活性的影响。活性的影响。转录活跃的常染色质区转录活跃的常染色质区 重复序列区、异染色质区、病毒附近等重复序列区、异染色质区、病毒附近等 甲基化强烈、染色体浓缩，引起转基因的沉默甲基化强烈、染色体浓缩，引起转基因的沉默n转录水平的基因沉默：主要是由于启动子区发生甲基化或转录水平的基因沉默：主要是由于启动子区发生甲基化或是导入的基因发生异染色质化所造成的，二者都和转入基是导入的基因发生异染色质化所造成的，二者都和转入基因重复序列有密切关系因重复序列有密切关系 外源基因如果以
41、多拷贝的形式整合到染色体外源基因如果以多拷贝的形式整合到染色体DNA的同一位点上，则的同一位点上，则不能进行转录，故而称为转录失活，且拷贝数越多，基因沉默现象也不能进行转录，故而称为转录失活，且拷贝数越多，基因沉默现象也就越严重。就越严重。n转录后水平的基因沉默：主要是转录后共抑制转录后水平的基因沉默：主要是转录后共抑制(post-transcriptional cosuppression)现象。现象。转录后水平基因沉默的特点是，外源基因能够转录成转录后水平基因沉默的特点是，外源基因能够转录成mRNA但不能积但不能积累，累，mRNA一经合成就被降解或被相应的反义一经合成就被降解或被相应的反义R
42、NA或蛋白质封闭，从或蛋白质封闭，从而失去合成蛋白质的功能（机理同而失去合成蛋白质的功能（机理同RNAi类似）。同时具有类似）。同时具有扩散性。扩散性。第11章基因工程新技术依赖于同源性的基因沉默依赖于同源性的基因沉默转基因小鼠中带有多个拷贝的转基因小鼠中带有多个拷贝的-球蛋白基因，随着位点特异性重组的发球蛋白基因，随着位点特异性重组的发生，基因拷贝数降低，而小鼠体内生，基因拷贝数降低，而小鼠体内-球蛋白基因含量增加，同时随着拷球蛋白基因含量增加，同时随着拷贝数的减少，该位点处的甲基化程度也降低。贝数的减少，该位点处的甲基化程度也降低。-球蛋白基因球蛋白基因第11章基因工程新技术uRNA干扰干
43、扰(RNA interference，RNAi)是由双链是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基引发的转录后基因静默机制因静默机制.uRNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制转座子活动、调控基因表达的监控机制.目前已成功目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究研究u随着研究的不断深入，随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具而同时作为功能
44、基因组研究领域中的有力工具（3）RNAi第11章基因工程新技术 1995年，年，1995年年Guo和和Kemphues用反义用反义RNA技术阻断秀丽技术阻断秀丽新小杆线虫新小杆线虫,发现注射正义发现注射正义RNA（sense RNA）和反义）和反义RNA均能均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果基因的表达，该结果不能使用反义不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。技术的理论做出合理解释。直到直到1998年，年，Fire等证实等证实Guo等发现的正义等发现的正义RNA抑制同源基抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的因表达的现象是由于
45、体外转录制备的RNA中中污染污染了微量了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为而引发，并将这一现象命名为RNAi。此后此后dsRNA介导的介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）、共抑制（）、共抑制（cosuppression）及）及RNA介导的介导的病毒抗性、真菌的抑制（病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于
46、）现象均属于RNAi在不同物在不同物种的表现形式。种的表现形式。2006年，年，Fire 和和Mello 因为发现因为发现RNAi的机理而获得诺贝尔的机理而获得诺贝尔生理医学奖生理医学奖第11章基因工程新技术 （1）当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随）当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些常产生一些dsRNA。（2）宿主细胞对这些）宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的迅即产生反应，其胞质中的核核酸内切酶酸内切酶Dicer将将dsRNA切割成多个具有特
47、定长度和结构的切割成多个具有特定长度和结构的小片段双链小片段双链RNA（大约（大约2123 bp），即），即siRNA。（3）siRNA在细胞内在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶再与体内一些酶(包括内切酶、包括内切酶、外切酶、解旋酶等外切酶、解旋酶等)结合形成结合形成RNA诱导的诱导的沉默复合物沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RNAi的作用机理的作用机理第11章基因工程新技术（4）RISC与外源性基因表达的与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异
48、的同源区进行特异性结合，性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。的降解反应。（5）siRNA不仅能引导不仅能引导RISC切割同源单链切割同源单链mRNA，而且可，而且可作为引物与靶作为引物与靶RNA结合并在结合并在RNA聚合酶聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的作用下合成更多新的d
49、sRNA，新，新合成的合成的dsRNA再由再由Dicer切割产生大量的次级切割产生大量的次级siRNA，从而，从而使使RNAi的作用进一步放大，最终将靶的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。完全降解。第11章基因工程新技术应用：构建发卡应用：构建发卡RNA干扰构件或两端都有启动子的小基因片段干扰构件或两端都有启动子的小基因片段来实现基因失活来实现基因失活第11章基因工程新技术RNAi干扰现象的重要特征干扰现象的重要特征uRNAi是转录后水平的基因沉默机制；是转录后水平的基因沉默机制；uRNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源
50、基因的的mRNA；uRNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子分子(数量远远少于内源数量远远少于内源mRNA的数量的数量)就能就能完全抑制完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；方式进行的；uRNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;udsRNA不
