1、第十三章第十三章 生物制品分析概生物制品分析概论论 第1页，共102页。第一节 概 述药物的三大类药物的三大类:中药生物制品其中包括基因工程药物药物工程生物技术生化药物生物药物化学药物)()(第2页，共102页。生化药物生化药物:一般系指以下三种途径获得的药物：其一，从一般系指以下三种途径获得的药物：其一，从 动物、植物及微生物分离纯化；其二、生物动物、植物及微生物分离纯化；其二、生物 化学半合成；其三，现代生物技术制取。该类化学半合成；其三，现代生物技术制取。该类 药物药物主要包括主要包括：生命基本物质及其衍生物、降：生命基本物质及其衍生物、降 解物、大分子结构修饰物等。解物、大分子结构修饰
2、物等。例：例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、核苷酸和氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、核苷酸和脂等。脂等。第3页，共102页。续定义基因工程药物基因工程药物:在在确定确定了对某种疾病具有预防和治疗作用了对某种疾病具有预防和治疗作用 的的蛋白质蛋白质的基础上的基础上,分离、纯化或人工合分离、纯化或人工合 成成控制该蛋白质合成的控制该蛋白质合成的基因基因，并利用重组，并利用重组 DNADNA技术进行改造，最后将该基因导入可技术进行改造，最后将该基因导入可 以大量生产的以大量生产的受体细胞中受体细胞中进行进行繁殖或表达繁殖或表达 ，从而大规模生产出具有预防和治疗疾病，从而大规模生产出具有
3、预防和治疗疾病 作用的药用蛋白质。作用的药用蛋白质。第4页，共102页。药物类药物药物类核酸及其降解物和衍生脂质物多糖类酶与辅酶类药物类药物氨基酸、多肽与蛋白质生化药化（一）生化药物的种类（一）生化药物的种类第5页，共102页。种类（续）v氨基酸及其衍生物类药物氨基酸及其衍生物类药物1 1、单氨基酸、单氨基酸例如：亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、例如：亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天门丝氨酸、色氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、苏氨酸等等。冬氨酸、精氨酸、苏氨酸等等。2 2、氨基酸衍生物、氨基
4、酸衍生物例如：例如：N-N-乙酰上乙酰上-L-L-半胱氨酸、半胱氨酸、L-L-半胱氨酸乙酯盐酸盐、半胱氨酸乙酯盐酸盐、S S氨基甲酰半胱氨酸、氨基甲酰半胱氨酸、S-S-甲基半胱氨酸等等。甲基半胱氨酸等等。3 3、复合氨基酸注射液、复合氨基酸注射液例如：例如：3S3S、6S6S、9S9S、11S11S、13S13S、14S14S、15S15S、17S17S、18S18S复合复合氨基酸注射液。氨基酸注射液。S S代表氨基酸的种类。代表氨基酸的种类。第6页，共102页。种类（续）1 1、垂体多肽：、垂体多肽：例如：例如：促胃液素促胃液素(5(5肽肽)、催产素、催产素(9(9肽肽)等。等。2、消化道多
5、肽：、消化道多肽：例如：胃泌素例如：胃泌素(14(14肽，肽，1717肽和肽和3434肽三种肽三种)3 3、下丘脑多肽：下丘脑多肽：例：促甲状腺素释放激素例：促甲状腺素释放激素(3(3肽肽)。4 4、脑多肽：脑多肽：例：新啡肽例：新啡肽(25(25肽肽)，-内啡肽内啡肽(3l(3l肽肽)等。等。5 5、激肽类：激肽类：例：血管紧张肽例：血管紧张肽I(10I(10肽肽)、(8(8肽肽)、(7(7肽肽 )等活性肽。等活性肽。6、其它肽类：、其它肽类：例：谷胱甘肽例：谷胱甘肽(3(3肽肽)、1 1胸腺素胸腺素(28(28肽肽)。第7页，共102页。种类（续）1、蛋白激素类药物：、蛋白激素类药物：例如
6、：胰岛素、生长激素例如：胰岛素、生长激素 、催产素。、催产素。2、天然蛋白质类药物：、天然蛋白质类药物：例如：血清白蛋白、干例如：血清白蛋白、干 扰素。扰素。3 3、蛋白质类药物制剂：、蛋白质类药物制剂：例如：明胶海绵、氧化例如：明胶海绵、氧化 聚明胶。聚明胶。第8页，共102页。种类（续）1、助消化酶类：、助消化酶类：例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。2、蛋白水解酶类：、蛋白水解酶类：例：溶菌酶、胰例：溶菌酶、胰DNADNA酶、胶原蛋白酶。酶、胶原蛋白酶。3、凝血酶及抗栓酶：、凝血酶及抗栓酶：例：牛凝血酶、纤溶酶、尿激酶。例：牛凝血酶、纤溶酶、尿激酶。4、抗肿瘤酶：
7、、抗肿瘤酶：例：例：L-L-天门冬酰胺酶、组氨酸酶、精氨酸天门冬酰胺酶、组氨酸酶、精氨酸 酶。酶。5、其它酶类：、其它酶类：例：超氧化物歧化酶例：超氧化物歧化酶(SOD)(SOD)、RNARNA酶、酶、DNADNA酶酶 、青霉素酶。、青霉素酶。6、辅酶类药物：、辅酶类药物：辅酶对酶的催化反应起着促进作用。辅酶对酶的催化反应起着促进作用。例：辅酶例：辅酶、辅酶、辅酶、辅酶、辅酶A A、辅酶、辅酶Q10Q10、黄素单核苷酸。、黄素单核苷酸。第9页，共102页。种类（续）该类药物来源广泛，以黏多糖为主，其该类药物来源广泛，以黏多糖为主，其特点特点为：为：（1）、由糖苷键将单糖连接而成多糖。）、由糖苷
8、键将单糖连接而成多糖。（2）、因单糖结构糖苷键位置不同，使多糖种类繁多，）、因单糖结构糖苷键位置不同，使多糖种类繁多，药理功能各异。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿药理功能各异。如抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿 瘤、增强免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。瘤、增强免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。例如：例如：肝素、硫酸软骨素肝素、硫酸软骨素A和和C、刺参多糖、银耳多糖、刺参多糖、银耳多糖、人胎盘脂多糖、壳聚多糖。人胎盘脂多糖、壳聚多糖。第10页，共102页。种类（续）1、磷脂：、磷脂：如脑磷脂、卵磷脂。如脑磷脂、卵磷脂。2、降血脂：、降血脂：如天然亚油酸、亚麻酸、多价不饱和脂肪酸如天然亚油酸、亚麻酸
9、、多价不饱和脂肪酸 （PUFA）、前列腺素）、前列腺素PGE1、PGE2、PGF2a、PGI2。3、胆酸：、胆酸：如去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸。如去氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸。4、固醇：、固醇：如胆固醇、麦角固醇、如胆固醇、麦角固醇、-谷固醇。谷固醇。5、卟啉：卟啉：如血红素、胆红素、原卟啉。如血红素、胆红素、原卟啉。第11页，共102页。种类（续）v核酸及其降解物和衍生物类药物核酸及其降解物和衍生物类药物1、核酸：、核酸：例如，从小牛胸腺或鱼精中提取的例如，从小牛胸腺或鱼精中提取的DNA可用于可用于 治疗精神迟缓、虚弱和抗辐射。治疗精神迟缓、虚弱和抗辐射。2、多聚核苷酸：、多聚核苷
10、酸：例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干扰素例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干扰素 的诱导剂，用于抗病毒、抗肿瘤。的诱导剂，用于抗病毒、抗肿瘤。3、核苷、核苷酸及其衍生物：、核苷、核苷酸及其衍生物：例，例，ATP、cAMP、CDP-胆胆 碱、碱、AMP、肌苷等。也可将它们进行化学修饰、肌苷等。也可将它们进行化学修饰 后用于治疗肿瘤和病毒感染。治疗肿瘤的如后用于治疗肿瘤和病毒感染。治疗肿瘤的如6-巯巯 基嘌呤、基嘌呤、2-脱氧核苷。抗病毒的如，环胞苷、脱氧核苷。抗病毒的如，环胞苷、5-碘苷。碘苷。第12页，共102页。（二）、基因工程类药物的种类（二）、基因工程类药物的种类促红细胞生成素集落刺激因子人
11、白细胞介素人干扰素细胞因子类药物基因治疗药物单克隆抗体如酶类及凝血因子类药物人生长激素人胰岛素子人生长激素释放抑制因物激素类及神经递质类药基因工程药物）、:(第13页，共102页。1、共同特点：、共同特点：均来自生物体均来自生物体,是生物体的基本生化成分是生物体的基本生化成分,具有生物活性或生理功能具有生物活性或生理功能,对疾病对疾病具有针对性强、毒副作用小、易于人体吸收。具有针对性强、毒副作用小、易于人体吸收。2 2、分子量大且不是定值、分子量大且不是定值 小部分药物（如：氨基酸、辅酶）属化学结构明确的小分子化合物，小部分药物（如：氨基酸、辅酶）属化学结构明确的小分子化合物，大部分为大分子的
12、物质大部分为大分子的物质(如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等)，其分子量一，其分子量一般几千至几十万。对大分子的生化药物而言，即使组分相同，往往由于分般几千至几十万。对大分子的生化药物而言，即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性。所以，生化药物常需进行分子量的测定。子量不同而产生不同的生理活性。所以，生化药物常需进行分子量的测定。第14页，共102页。3 3结构确证难结构确证难 由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、红外、紫由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用元素分析、红外、紫外、核磁、质谱等方法加以证实，往往还要用生化法
13、如氨基酸序列等法加以证外、核磁、质谱等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实。实。4 4、全过程质量控制、全过程质量控制 该类药物对热、酸、碱、重金属等均较敏感，往往需要对原料药、生产过程和产品进该类药物对热、酸、碱、重金属等均较敏感，往往需要对原料药、生产过程和产品进行全过程质量控制，且要求比其它药物更为严格。行全过程质量控制，且要求比其它药物更为严格。5 5需检查生物活性需检查生物活性 在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。在制备多肽或蛋白质类药物时，有时因工艺条件的变化，导致蛋白质失活。因此，对这些生化药物，除了用通常采用的理化法检验外。尚需用
14、生物检定法因此，对这些生化药物，除了用通常采用的理化法检验外。尚需用生物检定法进行检定，以证实其生物活性。进行检定，以证实其生物活性。第15页，共102页。6 6需做安全性检查需做安全性检查由于生化药物的性质特殊。生产工艺复杂，易引入特殊杂质。故生化药物常需做安由于生化药物的性质特殊。生产工艺复杂，易引入特殊杂质。故生化药物常需做安全性检查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。全性检查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。7 7需做效价测定需做效价测定 该类药物多数可通过含量测定，以表明其主药的含量。但对酶类药物需该类药物多数可通过含量测定，以表明其主药的含量。但对酶类药物需进行效价测定或
15、酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。第16页，共102页。第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法 一、鉴别试验一、鉴别试验 真伪鉴别方法 化学药物:化学方法、物理学方法生化药物与基因工程药物:化学方法、物理学方法、生 物学方法。且需要标准品或 对照品进行对照实验。第17页，共102页。理化理化鉴别鉴别1、化学鉴别法化学鉴别法 利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。或沉淀进行鉴别。例如，溶菌酶的鉴别采用呈色法：溶茵酶分子中的四个例如，溶菌酶的鉴
16、别采用呈色法：溶茵酶分子中的四个肽键上的氮原子能与铜离子肽键上的氮原子能与铜离子(Cu(Cu2+2+)络合，生成有颜色的络合，生成有颜色的络合物，肽键越多，产生的颜色越深。络合物，肽键越多，产生的颜色越深。第18页，共102页。理化理化鉴别鉴别(续续)2、紫外分光光度法紫外分光光度法 由于很多生物大分子均有共轭系统由于很多生物大分子均有共轭系统,可产生特征可见紫可产生特征可见紫外吸收，使较多药物能够用紫外分光光度法的特征吸收进行外吸收，使较多药物能够用紫外分光光度法的特征吸收进行鉴别。鉴别。例如，例如，0.0lmol/L0.0lmol/L的三磷酸腺苷二钠的盐酸水溶液在的三磷酸腺苷二钠的盐酸水溶
17、液在257nm257nm的波长处有最大吸收。用的波长处有最大吸收。用A A250250nm/Anm/A260nm260nm的值的值0.17-0.17-0.270.27进行鉴别。进行鉴别。第19页，共102页。理化理化鉴别鉴别(续续)3、高效液相色谱法高效液相色谱法 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。谱的一致性进行鉴别。例如，例如，重组人生长激素的鉴别：重组人生长激素的鉴别：1 1）供试品与对照品的主峰保留时间一致。）供试品与对照品的主峰保留时间一致。2 2）供试品与对照品的肽图谱保持一致性。）供试品与对照品的肽图
18、谱保持一致性。第20页，共102页。生化生化鉴别鉴别1、酶法酶法 由于酶催化化学反应的高度专一性，利用特定的酶仅能由于酶催化化学反应的高度专一性，利用特定的酶仅能催化特定的化学反应，可以有效地鉴别该药物。催化特定的化学反应，可以有效地鉴别该药物。例如，例如，尿激酶尿激酶是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激是专属性较强的蛋白水解酶，根据尿激 酶能酶能激活激活牛纤维蛋白溶酶原牛纤维蛋白溶酶原而具有相同作用的而具有相同作用的 链激酶链激酶不能激活不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，牛纤维蛋白溶酶原而加以区别，并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作并用直接观察溶解纤维蛋白作用的气泡上升法作 为判断指
19、标。为判断指标。第21页，共102页。生化生化鉴别鉴别(续续)2、电泳法电泳法 基于生物大分子分子量的较大差异和荷电的差异，在电基于生物大分子分子量的较大差异和荷电的差异，在电泳法中具有不同的迁移距离，从而鉴别生化药物。泳法中具有不同的迁移距离，从而鉴别生化药物。例如，例如，肝素肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由的鉴别采用糖凝胶电泳法：肝素是由D-D-硫硫 酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘 多糖，其水溶液带强负电荷，于多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板琼脂凝胶板上，上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素在电场作用下，向正极方向移动，与
20、肝素国家标国家标 准品对照准品对照，其移动位置应对应。，其移动位置应对应。第22页，共102页。生化生化鉴别鉴别(续续)3、样品脱盐后用等电点聚焦法测定样品脱盐后用等电点聚焦法测定 基因工程药物往往有多个等电点，利用等电点基因工程药物往往有多个等电点，利用等电点聚焦聚焦从而从而形成多个区带，基于该区带的一致性鉴别药物。形成多个区带，基于该区带的一致性鉴别药物。（三）（三）生物鉴别法生物鉴别法 利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。例如，用家兔惊厥试验来鉴别胰岛素，它是通过胰岛素的降血糖作用进行鉴别的。当剂量过大，血糖降低至一定水平(约30)，家兔即发生惊厥，迅速静注50葡
21、萄糖注射液，补充血糖、惊厥停止，说明惊厥是胰岛素所致低血糖而引起的。第23页，共102页。生物药物鉴别应该注意以下三点：生物药物鉴别应该注意以下三点：（1 1）药物的取样药物的取样：由于生物药物多数为大分子药物，有的：由于生物药物多数为大分子药物，有的化学结构不明确，有的分子量不是定值，使质量控制较为困化学结构不明确，有的分子量不是定值，使质量控制较为困难。在大量的样品中取少量供试品进行分析，应考虑取样的难。在大量的样品中取少量供试品进行分析，应考虑取样的科学性、真实性和代表性，其基本原则是科学性、真实性和代表性，其基本原则是均匀、合理均匀、合理。（2 2）鉴别结果评价鉴别结果评价：由于生化药
22、物的复杂性和不确定性，：由于生化药物的复杂性和不确定性，通常鉴别不是由一项试验完成，而是采用一组试验项目通常鉴别不是由一项试验完成，而是采用一组试验项目综合综合评价评价一种药物。一种药物。（3 3）目前仍存在相当一部分生化药物）目前仍存在相当一部分生化药物没有没有找到有效的找到有效的鉴别鉴别方法方法。第24页，共102页。杂质检查杂质检查1、一般杂质检查一般杂质检查 生化药物的一般杂质检查项目包括氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度或溶液的颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。其检查的原理及方法与化学药物中的一般杂质检查相同。第25页，共102页。杂质检查（续）2 2特殊
23、杂质检查特殊杂质检查 特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂特殊杂质主要是指从生产工艺中引入或原料中带入的杂质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制质。许多生化药物是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药物中易残存一些杂质或其他成分。得，药物中易残存一些杂质或其他成分。例如，胰蛋白酶是从动物胰中提取制得的一种蛋白水 解酶，在制备过程中，易带入杂质糜蛋白酶，根据 糜蛋白酶的特性可以选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯为 底物作糜蛋白酶的限度检查。第26页，共102页。安全性检查安全性检查（一）（一）、热原检查和细菌内毒素检查、热原检查和细菌内毒素检查 详见第十二章药物制剂分析（P
24、302-303）（二）、（二）、异常毒性试验异常毒性试验 异常毒性试验异常毒性试验是用一定剂量的药物按指定的操作方法和是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点反应的判断以试验动物死亡与否为终点。第27页，共102页。安全性检查（续）中国药典规定的异常毒性试验，实际上是一个限度试验。在此剂量条件下，一般供试品不应使试验动物中毒致死；如果出现试验动物急性中毒而死亡，则反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平，因此，本试验又称异常毒性检查法。试验动物试验
25、动物：小白鼠小白鼠。试验方法试验方法：尾静脉注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口：尾静脉注射法、皮下注射法、腹腔注射法及口 服给药法服给药法。第28页，共102页。安全性检查（续）例如，玻璃酸酶的异常毒性检查方法如：取体重17 22g的健康小白鼠5只，分别由皮下注射每1ml中含玻 璃酸酶10000单位的氯化钠注射液0.25ml，48h内不得 发生皮下组织坏死或死亡如有一只小白鼠发生组织 坏死或死亡，应按上述方法复试，全部小白鼠在48h 内不得有组织坏死或死亡现象。第29页，共102页。安全性检查（续）(三三)、过敏试验、过敏试验 过敏试验是检查检查异性蛋白异性蛋白的试验的试验。试验动物试验动物：
26、豚鼠豚鼠。试验方法试验方法：皮肤过敏试验、腹腔注射试验：皮肤过敏试验、腹腔注射试验。原因原因：药物中夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人药物中夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人 多种过敏反应（如，皮肤红斑、血压下降、休克和多种过敏反应（如，皮肤红斑、血压下降、休克和 死亡等）。因此，死亡等）。因此，有可能存在异性蛋白的药物、应有可能存在异性蛋白的药物、应 作过敏试验作过敏试验。第30页，共102页。安全性检查（续）例如，蛋白制剂细胞色素C在制备中可能掺入杂蛋白，中国药典规定该溶液及注射液应做过敏试验。方法：取本品适量，加灭菌注射用水稀释成每lml中含细胞色素C 7.5mg的溶液，作为致敏
27、液与供试品溶液。另取体重为250350g的健康豚鼠6只，连续3次隔日腹腔注射致敏液0.5ml，2周后，再自股(耳)静脉注射供试品溶液lml，注射后15min内，均不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽三声等现象中的两种或两种以上者，或有抽搐、虚脱或死亡等现象之一者，应判为阳性。第31页，共102页。安全性检查（续）(四四)、降压物质检查法、降压物质检查法 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。试验动物试验动物：猫猫(或狗或狗)。试验方法试验方法：血压法检查药物中所含的降压物质：血压法检查药物中所含的降压物质 。v杂质的来源
28、:在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织内存在的组胺及部分氨甚酸脱羧形成的组胺、酪胺等胺类物质，均为这类杂质的来源。第32页，共102页。安全性检查（续）(五五)、无菌试验、无菌试验 无菌试验是检查药品及敷料是否染有活菌是否染有活菌的一种方法，是药典中较重要的检查项目之一。v原因:由于许多生化药物是在无茵条件下制备的，且不能高温灭菌。因此，无菌检查就更有必要。中国药典中几乎所有的注射用药均做无菌检查。第33页，共102页。安全性检查（续）无菌试验的基本步骤无菌试验的基本步骤a)、制备培养基：为细菌生长、繁殖提供所必需的营 养物质碳源、氮源、维生素、矿物质等。b)、选择对照用菌液
29、：供对照试验用。c)、具体检查：如接种、培养等操作。d)、结果判断：得出阴性或阳性的结论。第34页，共102页。安全性检查（续）(六六)、基因工程药物中可能杂质与污染物检查、基因工程药物中可能杂质与污染物检查 v可能杂质:残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突 变体、蛋白质裂解物等。v主要污染物:微生物、热原、病毒等。v主要检查项目:1）外源性DNA 2）宿主细胞蛋白质 3）细菌内毒素 4）其它有关杂质第35页，共102页。安全性检查（续）(七七)、致突变试验、致突变试验 致突变试验致突变试验一般包括一般包括：微生物回复突变试验、哺乳动：微生物回复突变试验、哺乳动 物培养细胞染色体畸变试
30、验、啮齿动物微核试物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试 验、微生物电极法的致突变试验。验、微生物电极法的致突变试验。(八八)、生殖毒性试验、生殖毒性试验 生殖毒性试验生殖毒性试验一般包括一般包括：一般生殖毒性试验、致畸敏感：一般生殖毒性试验、致畸敏感 期毒性试验、围生期毒性试验。期毒性试验、围生期毒性试验。第36页，共102页。含量（效价）测定含量（效价）测定 含量表示方法含量表示方法：通常有以下两种方法 1）百分含量表示。适用于结构明确的小分子药物或经 水解后变成小分子的药物。2）生物效价或酶活力单位表示。适用于酶类、蛋白质 类等药物。第37页，共102页。第三节 常用定量分析方法与应用
31、常用定量分析方法与应用 v定量分析方法定量分析方法 生化药物和基因工程药物常用的定量分析方法包括以下四类：）、（）、（）灌注色谱高效毛细管色谱高效液相色谱法色谱法比色法荧光法紫外光度法光谱分析法电化学分析法滴定法理化法 化学分析法（重量法、）、1第38页，共102页。定量分析方法（续）)(),(2以酶为分析对象酶活力测定法外的其它物质除酶以分析对象为反应体系中试剂以酶为分析工具或分析酶分析法酶法）3）生物检定法：以药物对生物体的作用效果为依据，从而测定效价或活性。第39页，共102页。定量分析方法（续）)():(),(4形成区带溶液中组分无支持介质高效毛细管电泳组分形成区带纸如惰性支持介质区带
32、电泳溶液中组分形成界面无支持介质自由界面电泳电泳法、，）、第40页，共102页。理化分析法理化分析法（一）（一）、化学分析法、化学分析法基本原理：基于分析组分的化学、物理性质，将其溶解、挥发或转化为易于与体系分离的纯物质，再对其进行质量测定，从而获得所分析样品中被测组分的含量。1 1、重量法重量法第41页，共102页。理化分析法（续）常用方法：。，。，b。，a。，从而称重测定组分进行分离分转化为沉淀利用化学反应将被测组沉淀法间接挥发将其转化为挥发性物质直接挥发利用被测组分的挥发性挥发法蒸去溶剂进行测定再分用溶剂提取样品中的组提取法)第42页，共102页。理化分析法（续）2、滴定法滴定法 常用方
33、法：酸碱滴定法、氧化还原滴定法、络合滴定法。基本原理：若样品中被测组分与标准滴定液能够定量地、快速地发生化学反应，且该反应具有较强的选择性和适当的终点指示方法，我们将可以利用该滴定反应测定相应的化学组分。第43页，共102页。理化分析法（续）(二二)、电化学分析法、电化学分析法 常用方法：离子选择性电极分析法、化学生物传感器分析法、极谱分析法、微电流电位法。基本原理：当表面涂有敏感物质的电极与被测药物接触时,将发生电化学反应产生具有一定特征的电信号。电化学分析将利用该电信号与药物浓度成比例的关系进行药物定量分析。第44页，共102页。理化分析法（续）(三三)、光谱分析法、光谱分析法 1、比色法
34、 样品中被测组分在可见紫外光区没有明显的特征吸收，但它能够与显色剂发生显色反应，生成在可见光区具有明显特征吸收的有色物质。基于该特征吸收的强弱，从而定量测定样品中的被测组分。2、紫外分光光度法 若样品中被测组分或被测组分转化后的产物在紫外光区具有明显的特征吸收，基于该吸收分析测定被测组分。第45页，共102页。理化分析法（续）比色法与紫外分光光度法的比较：实际上，它们均是相同一类分析方法相同一类分析方法。通常比色法要进行衍生化，产生在可见光区有明显吸收的有色物质，而紫外光谱法通常不需要衍生化，若衍生化，也只是产生在紫外光区有明显吸收的物质。第46页，共102页。理化分析法（续）比色法测定红色产
35、物色用对二甲氨基苯甲醛显与乙酰丙酮反应盐酸水解硫酸软骨素nm、；、525321例如：粘多糖硫酸软骨素的比色法测定、蛋白质和糜蛋白 酶的分光光度法测定分光光度法测定特征吸收蛋白质nm280分光光度法测定产物酪氨酸乙酯乙酰底物糜蛋白酶nmLN237第47页，共102页。理化分析法（续）3、荧光分光光度法 具有共轭大环的分子均能产生特征荧光光谱，利用荧光强度与浓度的比例关系对生物大分子进行定量分析。由于很多生物大分子均有荧光吸收，因此荧光分光光度法是该类物质非常重要的一种定量分析方法。第48页，共102页。理化分析法（续）(四四)、色谱分析法、色谱分析法 1、高效液相色谱（High Performa
36、nce Liquid Chromato-graphy i.e.HPLC）v 在生化药物分析中，常用的HPLC有三种：a）反相高效液相色谱（reversed phase HPLC i.e.RP-HPLC）b)高效离子交换色谱(High Performance Ion Exchange Chromatography i.e.HPIEC)c)高效凝胶过滤色谱(High Performance Gel Filtration Chromatography i.e.HPGFC).第49页，共102页。理化分析法（续）(1)、反相高效液相色谱（RP-HPLC）特 点 可以总结为以下5个方面:a）固定相：柱填
37、料为C4、C8和C18烷基硅烷键合相。这些直链饱和烷烃是通过共价结合到硅胶载体上。最常用的为C18烷基键合相，即ODS。b）流动相:为极性二元或三元组合溶剂，常用的为甲醇水，乙腈水，或甲醇、乙腈分别与缓冲液构成的多元组合溶剂。第50页，共102页。理化分析法（续）c）样品中极性大的组分先洗脱出柱，极性小的组分后流出色谱柱。d）键合固定相不易被极性流动相洗脱，同时，由于固定相的非极性和强的化学惰性，使样品易于洗脱，保持了色谱柱的可逆性和长寿命。e)易于程序化改变流动相的组分浓度，即梯度洗脱法，从而分析组分性质相差较大的复杂体系。第51页，共102页。理化分析法（续）示例：基因工程药物生白能的含量
38、测定 固定相：ODS120T 流动相：A液：三氟乙酸水（0.1%）B液：三氟乙酸水溶液（1%）乙腈（90：10）缓冲液:pH=7.0的磷酸缓冲液洗脱方式:梯度洗脱，其程序为：时间(min)A浓度(%)0642050.722032停止49.3100B浓度(%)36第52页，共102页。理化分析法（续）定量方法：外标法、其外标物为对照品。tR=21.236min 为主成分生白能；tR =13.639min 为添加剂人血白蛋白。第53页，共102页。理化分析法（续）(2)、高效离子交换色谱（HPIEC）基本原理 离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团和可交换离子基团，当流动相
39、带着已电离化的组分通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，在流动过程中不断发生可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。特 点 可以归纳为以下4个方面:a）可在所有的PH值范围内使用。对于广泛选择各种缓冲液洗脱体系更为有利。第54页，共102页。理化分析法（续）b)填料的使用寿命长，易于可逆再生。有效防止了污染柱的性能下降或报废。c)很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性较为有利。基于此原因，离子色谱广泛应用于分离或分析可离解的生物化合物，如氨基酸、多肽、核酸、核苷和各种碱基以及蛋白质。d)流动相多为水溶液。在以水为流动相的离子交换色谱中，组分的保留值和分离度主要
40、通过控制流动相的PH值和离子强度来调节。组分的分离是采用盐浓度增大的梯度洗脱方法。第55页，共102页。理化分析法（续）(3)、高效凝胶过滤色谱（HPGFC）基本原理 固定相为多孔性凝胶，流动相为缓冲水溶液。被分离的样品组分分子依据其大小（或分子量）不同渗入凝胶孔的深度不同，洗脱的难易程度也不同，从而按组分的分子大小（或分子量）分布而分离测定。特 点 a）组分的保留时间分布由组分分子大小分布决定。体积越小的组分分子，渗入凝胶孔越深，洗脱越困难，因此，大分子优先于小分子被洗脱。第56页，共102页。理化分析法（续）b）流动相为固定比例的缓冲水溶液。有时加入少量的能与水互溶的有机改性剂或表面活性剂
41、。c）活性蛋白质可以回收。d）HPGFC广泛应用于生物药物大分子的分子量分布测定。它是测定蛋白质分子量的一种重要方法。第57页，共102页。理化分析法（续）2、灌注色谱（Perfusion Chromatography）v基本原理 灌注色谱的分离介质为高度交联的具有大孔结构的高分子物质,它具有80150nm的大扩散孔和600800nm的贯穿孔。流动相流经介质时，存在两种方式：一种，在浅表面的大扩散孔中的扩散作用，另一种为直接通过内表面的贯穿孔而流动。由于贯穿孔的大孔径使后者为主要的分离方式。分子结构和大小的不同使其与内表面孔的相互作用存在差异，从而达到分离测定的目的。第58页，共102页。理化
42、分析法（续）特 点 a）分离柱内表面积大量增加,使柱容量增大、分辨率提高。b）流动相流速的增加对柱效的影响极小,因此生物大分子可以实现快速分离纯化与测定。c）由于柱效高、分离时间短和生物活性降低少，因此，灌注色谱主要用于基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化与分析。第59页，共102页。二、二、酶酶 法法 （1）分析原理是以酶催化某化学反应为基础，通过对酶促反应速度的测定或对生成物浓度的测定而检测相应物质含量。酶是具有专一性催化功能的蛋白质。利用酶的特性测定药物的含量，与其他分析方法相比有许多独特的特点，具体体现在以下六个方面：（2）测定方法具有很强的专一性，常用于复杂组分中结构和物理化学性质
43、比较相近的同类物质的分析鉴定。第60页，共102页。酶法（续）（3）样品一般不需要很复杂的预处理，操作简单。（4）样品和试剂用量少，测定快速准确、灵敏度高。（5）反应条件温和，一般不需要强酸强碱。（6）酶不易于保存，结构很不稳定，易于受外界条件的影响而发生结构改变或变性而引起酶失活。在实际分析中，影响酶应用的两个最显著的因素为“强的专属性”和“不稳定性”。第61页，共102页。酶法（续）（一）、酶活力测定法（一）、酶活力测定法1、基本概念、基本概念酶的活性单位(国际单位IU)在25下，以最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的pH值诸条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单
44、位。酶的比活性即定为一毫克酶的活性单位。酶活力（酶活性）酶活力是指酶催化某化学反应的能力，其表征指标为酶催化该化学反应的速度。而速度用单位时间内反应底物的减少或产物的增加量来确定。分析对象是作为药物的酶。分析对象是作为药物的酶。第62页，共102页。酶法（续）a）终点法：在适当条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间。b）反应速率法：该类方法是通过测定酶促反应的速率从而表征酶活力，有两种方法实现该速率的测定。其一、间断一定时间或连续测定反应指示量（如吸光度）的变化；其二、反应间隔一定时间，停止反应，测定底物减少或产物增加的量。酶活力测定的常用方法 第63页，共102页。酶法（续）2
45、 2、酶促反应的条件及影响因素、酶促反应的条件及影响因素 酶促反应的动力学，满足于Michaelie-Menten方程（米氏方程），其表达式为：其中，在一定底物浓度S时反应的速率；Km米氏常数；在底物饱和时的最大反应速率。基于该方程，可以确定酶促反应速率与底物浓度S之间的定量关系。SKSm第64页，共102页。酶法（续）条件选择的基本要求为：所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。即，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其它因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。由于酶的不稳定性，易于失活，因此，反应条件的选择就显得极其重要，主要的影响因素是底物、温度和PH值。第65页，
46、共102页。酶法（续）（1）、底物a）、底物的性质应在物理化学性质上与产物不同，以便于产物的测定。b）、底物的浓度应足够的高。将使酶反应的速度不受其影响。此时，反应速率仅与酶量成正比，从而由速率测定确定酶含量。一般选择S=100Km。c）、大多数酶具有相对专一性，在可被酶作用的各种底物中一般选择Km小的底物，这样可以减少酶的用量。基于酶促反应条件选择的基本要求，主要考虑的影响因素有以下几方面：第66页，共102页。酶法（续）（2）溶液PH 溶液PH对酶促反应将产生严重的影响，在测定时，不但要选择适宜的反应PH，而且要将反应维持在该PH值。其影响主要表现在以下几方面：a）它可能改变酶的活性中心的
47、解离状况，升高或降低酶的活性；b）可能破坏酶的结构与构象导致酶失效；c）可能作用于反应系统的其它组成成分，从而影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方向。第67页，共102页。酶法（续）（3）温度 酶反应对温度十分敏感，因为温度能直接影响化学反应速度本身，也能影响酶的稳定性，还可能影响酶的构象和酶的催化机制。一般而言，温度变化1，酶反应速度可能相差5左右。因此，实验中温度变动应控制在0.1以内。酶反应温度通常选用25、30或37。（4）、辅助因子 有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅酶物质。为了提高酶在反应系统中的稳定性，有些也需要某些相应的物质。第68页，共102页。酶法（续）（5）、空白和
48、对照实验 空白实验空白实验用于消除背景，噪音和其它一些未知影响因素对测定结果的影响。该实验可通过不加酶、或不加底物，或二者都加(但酶需预先经过失效处理)来实现。对照实验对照实验：在浓度与测定量之间无准确的关系，或计量关系易受条件影响时，通常用纯酶或标准酶制剂进行测定，从而确定浓度与测定量之间的计量关系。第69页，共102页。酶法（续）3 3、测定方法、测定方法 测定方法按取样和检测方式可分为取样测定法和连续测定法。（1）取样测定法 在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别，选用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时
49、间内酶促反应变化量的方法,即为取样测定法。第70页，共102页。酶法（续）a）加入酶的变性剂，使其酶失去专一性的催化活性。b）由于酶对温度极为敏感，往往可以采用加热使酶失活，从而停止反应。停止酶促反应的常用方法：c）基于酶促反应对溶液PH较敏感，若反应必须在适当的PH范围，否则反应将停止，且无其它副反应时，就可以采用改变PH的办法终止反应。第71页，共102页。酶法（续）例如，三氯醋酸是一种高效专一的蛋白质变性剂和沉淀剂，其缺点是在紫外光区有吸收.高氯酸没有上述缺点，并且用氢氧化钾中和、冷却后，KCIO4还可沉淀除去，但它不适于对酸和氧化剂敏感的测定对象。第72页，共102页。酶法（续）（2）
50、连续测定法 根据底物与产物在物理化学性质方面的差异，在反应过程中实时、在线测定底物或产物的变化量,即为连续测定法。特 点 a)准确性和测定效率均高于取样测定法。b)对检测技术和实验仪器均要求较高，既要求检测要快速，又要求准确性和灵敏度要高，有时甚至要时间分辨。c)实时在线检测是当今分析检测技术发展的方向，因此连续测定法为当前重要的检测技术。第73页，共102页。酶法（续）（3）检测方法 ）:(放射化学法电化学测定法如其它方法酶偶联测定法旋光度法荧光分光光度法可见分光光度法紫外常用方法，第74页，共102页。酶法（续）4 4、反应速度的测定与要求、反应速度的测定与要求 酶活力测定的目的，就是要通
