真菌诊治进展课件.ppt

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1、真菌感染的非培养诊断进展真菌感染的非培养诊断进展北京大学第一医院皮肤科北京大学第一医院皮肤科北京大学真菌和真菌病研究中心北京大学真菌和真菌病研究中心李若瑜李若瑜2008年年2月月27日日真菌感染的流行现状真菌感染的流行现状AIDS插管等侵袭性插管等侵袭性治疗治疗肿瘤和免疫肿瘤和免疫抑制治疗抑制治疗骨髓和实体骨髓和实体器官移植器官移植广谱抗生素广谱抗生素治疗治疗 真菌感染不断增加的原因真菌感染不断增加的原因 高危人群的增多高危人群的增多条件致病菌条件致病菌机会来了!机会来了!+600%+300%+300%Martin et al,NEJM 2003;348:1546脓毒血症的脓毒血症的发病率发病

2、率Edmond et al.Clin.Infect.Dis.(1999).29:239-244Edmond et al.Clin.Infect.Dis.(1999).29:239-244念珠菌血行感染发病率和死亡率高念珠菌血行感染发病率和死亡率高195019601970198019902000IAASP侵袭性曲霉病的发病率也在增加侵袭性曲霉病的发病率也在增加Kontoyiannis et al.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002,21:161-172Warnock.JAC,1998,41(suppl D):95-10578 79 80 81 82 83 8

3、4 85 86 87 88 89 90 91 9202468Aspergillus spp.Candida spp.All otherPrevalence at Autopsy%Groll et al,J Infect 1996;33:23-32.经尸检证实的侵袭性真菌感染经尸检证实的侵袭性真菌感染54.84%12.9%3.23%9.68%19.35%西南医院尸解资料,西南医院尸解资料,(1971-2000),郝飞教授提供,郝飞教授提供MucorCandidaAll others 日益严重的问题日益严重的问题Andriole VT.1999;44:151-162;Groll AH et al.

4、1998;44:343-500;Denning DW.1998;26:781-805;Andriole VT.1998;18:19-36;Lin S-J et al.2001;32:358-366;Paterson DL,Singh N.1999;78:123-138.非白念珠菌的增多非白念珠菌的增多.非白念珠菌非白念珠菌(46.8%)白念珠菌白念珠菌 (53.2%)Edmond et al.Clin Infect Dis 1999;29:239-44.934例念珠菌血症例念珠菌血症132C.glabrata42.3%C.parapsilosis21.1%C.tropicalis26.1%Ed

5、mond et al.Clin Infect Dis 1999;29:239-44.美国血源性念珠菌感染种类分布美国血源性念珠菌感染种类分布(1998-2000)Other1.12%C.lusitaneae1.02%C.krusei2.04%C.tropicalis12.23%C.parapsilosis13.25%C.glabrata24.46%C.albicans45.87%.我国念珠菌种类的变化我国念珠菌种类的变化 菌名菌名株数株数S SSDDSDDR%R%白念珠菌白念珠菌3883338833 98.4 98.40.70.70.80.8近平滑念珠菌近平滑念珠菌 2628 2628 93.

6、893.84.44.41.8 1.8 热带念珠菌热带念珠菌 2990 2990 92.592.54.94.92.62.6葡萄芽念珠菌葡萄芽念珠菌 27427493.493.43.33.33.33.3新型隐球菌新型隐球菌 68868889.189.14.84.86.16.1念珠菌属念珠菌属2583258381.281.210.710.78.18.1季也蒙念珠菌季也蒙念珠菌 36536578.678.612.912.98.58.5其它念珠菌其它念珠菌1158115875.375.311.311.313.413.4光滑念珠菌光滑念珠菌5611561165.565.520.120.114.414.4克

7、柔念珠菌克柔念珠菌12061206 17.717.731.131.150.750.7常见酵母菌对氟康唑的敏感性常见酵母菌对氟康唑的敏感性临床常见的条件性真菌感染临床常见的条件性真菌感染 念珠菌病念珠菌病:最常见,最常见,占血源感染的第占血源感染的第4 4位。位。曲霉菌病曲霉菌病:常见于血液系统恶性肿瘤病人,常见于血液系统恶性肿瘤病人,器官移植常见合并症。器官移植常见合并症。隐球菌病隐球菌病:在艾滋病人发病率为在艾滋病人发病率为10-20%10-20%。接合菌病(毛霉病)接合菌病(毛霉病):多见于重症糖尿多见于重症糖尿病和烧伤病人。病和烧伤病人。临床有增多趋势的条件性真菌临床有增多趋势的条件性真

8、菌 非白念念珠菌感染非白念念珠菌感染 毛孢子菌感染毛孢子菌感染 地霉感染地霉感染 镰刀菌感染镰刀菌感染 枝顶孢霉感染枝顶孢霉感染 暗色真菌感染暗色真菌感染 马尔尼菲青霉马尔尼菲青霉PCR PCR,GM试验试验1-3-D-glucan,G试验试验 PCR非培养诊断检测方法非培养诊断检测方法 G试验检测试验检测b-b-1,3 D-葡聚糖葡聚糖 ELISA法检测曲霉半乳甘露聚糖抗原法检测曲霉半乳甘露聚糖抗原 乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原 ELISA法检测念珠菌抗原法检测念珠菌抗原 PCR_真菌通用引物、种属特异性引物真菌通用引物、种属特异性引物 1,3-D-gluca

9、n(葡聚糖)(葡聚糖)真菌细胞壁成份,占真菌细胞壁成份,占50%以上以上 其他微生物、动物及人的细胞不含该成份其他微生物、动物及人的细胞不含该成份 主要用于念珠菌和曲霉菌感染诊断主要用于念珠菌和曲霉菌感染诊断b1,6glucansb1,3PPL bilayerchitinergosterolb1,3 glucansynthasemannoproteins 方法:方法:G试验试验-葡聚糖可特异性激活鲎(葡聚糖可特异性激活鲎(Limulus)变)变形细胞裂解物中的形细胞裂解物中的G因子,引起裂解物因子,引起裂解物凝固,故称凝固,故称G试验。试验。-b-b-1,3-D-1,3-D-葡聚糖检测方法葡聚

10、糖检测方法 两种试剂盒两种试剂盒 金山川公司金山川公司G试剂试剂-1,3-D-葡聚糖葡聚糖 不仅可检测念珠菌感染不仅可检测念珠菌感染 曲霉、镰刀菌曲霉、镰刀菌 和很多霉菌均和很多霉菌均存在存在-1,3葡葡聚糖聚糖(Miyazaki,J Clin Micro 33:3115,95)隐球菌细胞壁为隐球菌细胞壁为alpha-葡聚糖葡聚糖,故为阴性故为阴性 阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感染染,不能确定种类不能确定种类Clin Infect Dis 2004;39:199-205侵袭性真菌感染中葡聚糖检测侵袭性真菌感染中葡聚糖检测AML,MDSReceiving ant

11、ifungal prophylaxis11010010001000010000000.511.522.53Serum(1 3)-b-D-glucan (pg/mL)110102103104105PatientsNormalsCut off60 pg/mlClin Infect Dis 2004;39:199-205.3030with candidemiacontrol subjects侵袭性真菌感染的葡聚糖检测侵袭性真菌感染的葡聚糖检测假阳性原因假阳性原因*内毒素:内毒素:NaOH预处理预处理*抗肿瘤药:香菇糖、裂殖菌多糖抗肿瘤药:香菇糖、裂殖菌多糖*免疫治疗:白蛋白、球蛋白免疫治疗:白蛋白、

12、球蛋白*血液透析中使用硝酸纤维素制品血液透析中使用硝酸纤维素制品*术中使用棉制品、海绵等术中使用棉制品、海绵等*血红蛋白血红蛋白假阴性原因假阴性原因体液中存在葡聚糖酶使体液中存在葡聚糖酶使BDG降解。降解。(1)成人急性髓内白血病,慢性淋巴细胞白血病,成人急性髓内白血病,慢性淋巴细胞白血病,急性淋巴细胞白血病,骨髓发育不良综合症,急性淋巴细胞白血病,骨髓发育不良综合症,非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤。(2)疑有内源性真菌内眼炎的患者疑有内源性真菌内眼炎的患者(3)术后病重患者术后病重患者(4)中暑患者中暑患者(5)农民肺农民肺应用对象:应用对象:检测位于曲霉细胞壁上的检测位于曲霉细胞壁上的 g

13、alactomannan,(GM)3.Detection avidin-enzyme+substrate2.Detecting Ab anti-galactomannan biotin conjugatedAg blood,urine,BAL1.Capture antibody monoclonal anti-galactomannan Specificity=90%sensitivity=75%酶联免疫吸附法(酶联免疫吸附法(Platelia Aspergillus-EIAPlatelia Aspergillus-EIA)(PA-EIA Platelia Aspergillus,Bio-(P

14、A-EIA Platelia Aspergillus,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)Rad,Marnes-la-Coquette,France)欧洲已流行近十年,在美国欧洲已流行近十年,在美国0303年刚被批准。年刚被批准。B B 乳胶凝集试验(乳胶凝集试验(Latex agglutinationLatex agglutination)(LA Pastorex Aspergillus,Bio-Rad,(LA Pastorex Aspergillus,Bio-Rad,Marnes-la-Coquette,France)Marnes-la-Coquette,F

15、rance)GMGM抗原的检测抗原的检测曲霉的曲霉的GMGM 抗原检测抗原检测乳胶凝集试验(乳胶凝集试验(Pastorex)(15ng/ml)酶连免疫吸附试验(酶连免疫吸附试验(Platelia)(1ng/ml)灵敏度(灵敏度(%)特异度(特异度(%)LA25-7090-100ELISA50-9080-90结果判读:结果判读:GM试验注意事项试验注意事项PlateliaGM不同不同Cutoffs值的敏感性和特异性值的敏感性和特异性Marr KA et al,J Infect Dis 2004;190:641-9假阳性假阳性:Vale rio R et al,Mycopathologia(200

16、7)163:191202其它其它GMGM可能出现阳性的真菌可能出现阳性的真菌假阴性:假阴性:应应 用用治疗与GM检测值的关系5.7483.0781.580.95601234567治疗前治疗1年后治疗2年后治愈后GMGM抗原抗原ELISA检测应用检测应用(王,等。临床皮肤科杂志,王,等。临床皮肤科杂志,2006。曲霉曲霉 GM 抗原系列监测抗原系列监测n=362 高危粒细胞缺乏病人高危粒细胞缺乏病人Sandwich ELISA 2 times weekly,11.7%阳性阳性n=30 proven IAn=9 probable IAn=264 with no IA敏感性敏感性89.7%特异性特异

17、性98.1%阳性预测值阳性预测值PPV 87.5%阴性预测值阴性预测值NPV 98.4%Maertens J et al,Blood 2001;97:1604-10曲霉感染检测的影响因素曲霉感染检测的影响因素半乳甘露聚糖在半乳甘露聚糖在血中存在时间短,血中存在时间短,建议:建议:高危人群每周至少高危人群每周至少检测检测2次,动态观察次,动态观察 结合影象学、培养结合影象学、培养结果综合分析诊断结果综合分析诊断假阴性假阴性假阳性假阳性标本:标本:全血全血 血清血清 活检组织活检组织 BAL CSF不同方法:不同方法:DNA 提取提取 PCR 设计设计 产物检测产物检测PCRPCR技术用于诊断技术

18、用于诊断PCR PCR 检测和鉴定检测和鉴定多引物多引物多样本制备多样本制备高敏感度高敏感度:1-100 cells/mlpan-fungal PCR敏感度:敏感度:100%(多个标本多个标本)与治疗一致与治疗一致J Clin Microbiol 1997;35:1353-60SPEEDPCR过筛试验诊断过筛试验诊断IA 每周监测每周监测2次次通用引物通用引物;确定采用巢式和实时定量确定采用巢式和实时定量;敏感性敏感性100%,特异性特异性65%;早于临床症状早于临床症状2天天,早于确诊早于确诊9天天;动态观察持续阴性可排除动态观察持续阴性可排除;Dr.Maschmeyer G.in 2nd

19、Trends in Medical Mycology,23-26 October 2005,Berlin,Germany.DNA 扩增扩增种种/属特异性序列属特异性序列 HSP 90 羊毛固醇脱甲基酶羊毛固醇脱甲基酶 几丁质合成酶几丁质合成酶 天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶 actin 高度保守序列高度保守序列 18S rRNA gene 28S rRNA gene 线粒体线粒体单拷贝单拷贝巢氏巢氏PCR多拷贝多拷贝 genesNested PCR in Animal Models余进,等。中华检验医学杂志,余进,等。中华检验医学杂志,2003种特异引物巢式种特异引物巢式 PCR扩增烟曲霉扩增烟

20、曲霉rRNA基因基因动物模型中巢式动物模型中巢式PCR方法检测的灵敏度方法检测的灵敏度动物模型动物模型(只数)(只数)巢式巢式血培养阳性结果血培养阳性结果(百分比)(百分比)侵袭性肺烟曲霉感侵袭性肺烟曲霉感染小鼠(染小鼠(29)23(79.3%)2(6.9%)烟曲霉血症小鼠烟曲霉血症小鼠(25)19(76%)7(28%)总计(总计(54)42(77.8%)9(16.7%)余进,等。中华检验医学杂志,余进,等。中华检验医学杂志,2003完成全基因序列测定的病原真菌完成全基因序列测定的病原真菌 白念珠菌等致病性念珠菌白念珠菌等致病性念珠菌 新生隐球菌新生隐球菌 粗球孢子菌粗球孢子菌 烟曲霉、烟曲霉

21、、构巢曲霉等数种曲霉构巢曲霉等数种曲霉 组织胞浆菌组织胞浆菌 卡氏肺孢子菌卡氏肺孢子菌突破方向突破方向 对基因组序列和功能的了解,找出特异处对基因组序列和功能的了解,找出特异处 改进目前方法,提高敏感性改进目前方法,提高敏感性 Real-time PCR 多重多重PCR 芯片技术芯片技术 其它特异抗原其它特异抗原DNA 微阵列微阵列 芯片、探针芯片、探针:Candida spp.Aspergillus spp.临床标本临床标本:10-20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis:75.6%DNA microarray:87.9%Zhu et al.AAA.San Francisco,9-12th September 2004真菌非培养诊断小结真菌非培养诊断小结 在诊断侵袭性真菌感染有一定价值,尤其早在诊断侵袭性真菌感染有一定价值,尤其早期诊断和疗效监测期诊断和疗效监测 理想的检测方法尚少理想的检测方法尚少 隐球菌乳胶凝集隐球菌乳胶凝集 曲霉曲霉GM G试验试验 PCR方法有待标准化方法有待标准化 多次取材重要多次取材重要 结合临床表现、真菌学等传统方法和影象学结合临床表现、真菌学等传统方法和影象学真菌病诊断真菌病诊断联系方式联系方式:,6551122-3056谢谢大家谢谢大家!

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