1、现代色谱分离技术现代色谱分离技术中国海洋大学医药学院中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室海洋药物教育部重点实验室李国强李国强 For 博兴京博控股股份有限公司博兴京博控股股份有限公司2011-12-20主要内容主要内容薄层色谱（薄层色谱（TLC）柱色谱（柱色谱（CC）2 高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）3 一一 薄薄 层层 色色 谱谱引引 言言 薄层色谱薄层色谱(Thin Layer Chromato-graphy)，又称，又称薄层层析薄层层析，常用，常用TLC表示。表示。将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相，使被
2、分离的物质展开。固定相：固定相：吸附剂。流动相：流动相：展开剂。分离原理：分离原理：吸附与解吸附。薄层板v固定相：固定相：硅胶为使用最广泛的薄层材料。除此之外还有氧化铝、硅藻土等。v常用薄层硅胶的特征：硅胶商品名硅胶商品名称称黏合剂黏合剂荧光添加剂荧光添加剂应用应用硅胶硅胶H H无无无无薄层色谱，柱色谱薄层色谱，柱色谱硅胶硅胶G G有有无无薄层色谱，柱色谱薄层色谱，柱色谱硅胶硅胶GFGF254254有有有有在在254nm紫外灯下看荧光紫外灯下看荧光薄层板的制备方法湿法：平铺法和涂铺法。制备薄层色谱制备薄层色谱 定性薄层色谱定性薄层色谱 使使用用目目的的薄层色谱分类（一）定性薄层色谱（一）定性薄
3、层色谱点点 样样展展 开开定位与显色定位与显色 1 点样v 样品溶解：样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶剂，最好选用与展开剂极性相似的溶剂。v 点样工具：点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。v 点样量：点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度等因素有关，若因样品溶液太稀，可重复点样。v 点样位置：点样位置：距底边约1-2cm的起始线上，点与点的距离为0.5-1cm。v 点样方式：点样方式：定性分析-点状点样。（直径3-5mm的圆点）制备薄层-条状点样。2 展开u石油醚石油醚u环己烷环己烷u四氯化碳四氯化碳u苯苯u氯仿氯仿u乙醚乙醚u乙酸乙酯乙酸乙酯u丙酮丙酮u乙醇乙醇u
4、甲醇甲醇u水水u乙酸乙酸极极性性增增强强 展开剂选用原则展开剂选用原则1 对所需组分有良好的溶解性（相似相溶）。对所需组分有良好的溶解性（相似相溶）。2 可使成分间分开。可使成分间分开。3 待测组分待测组分Rf在在0.20.8之间。之间。常用常用展开剂体系展开剂体系一元：一元：石油醚，甲醇石油醚，甲醇 等。等。二元：二元：石油醚：丙酮石油醚：丙酮，石油醚：乙酸乙酯，石油醚：乙酸乙酯，氯仿：甲醇氯仿：甲醇 等。等。三元：三元：氯仿：甲醇：水氯仿：甲醇：水 等。等。应注意：应注意：a 展开剂不淹没样点。b 薄层板呈倾斜状。C 展开过程应在密闭容器中进行。d 展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快标出
5、展开剂前沿位置，以便计算Rf值。2 展开l 展开后将溶剂吹干。展开后将溶剂吹干。l 常见的定位方法：常见的定位方法：3 定位与显色光学检出法光学检出法254nm，365nm（使用方便，被检测物不易被破（使用方便，被检测物不易被破坏）坏）蒸气检出法蒸气检出法展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充满碘蒸气的密闭展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充满碘蒸气的密闭容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。试剂检出法试剂检出法利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反应利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反应通用显色剂：通用显色剂：10%硫酸乙
6、醇、茴香醛、香草醛。硫酸乙醇、茴香醛、香草醛。(二二)制备薄层色谱（制备薄层色谱（PTLC）特点：特点：1 较分析薄层样品液的浓度大。2 板较大，较厚（吸附剂用量多）3 点样多点成直线。用于制备的薄层色谱。用于制备的薄层色谱。样品的检测v 有色物质有色物质直接观察斑点。直接观察斑点。v 荧光物质荧光物质紫外灯下观察。紫外灯下观察。v 如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。样品的收集v切割：切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。v回
7、收：回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用极性尽可能低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常用。TLCTLC的特点的特点v方法简便易行方法简便易行,价格低廉；价格低廉；v分析快速；分析快速；v检出灵敏度高；检出灵敏度高；v分离能力强；分离能力强；v检测手段多样化；检测手段多样化；v应用广泛；应用广泛；二二 柱柱 色色 谱谱柱色谱柱色谱硅胶柱色谱硅胶柱色谱凝胶柱色谱凝胶柱色谱 ODS ODS柱色谱柱色谱大孔树脂柱色谱大孔树脂柱色谱(一)硅胶柱色谱 1 原理原理：根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组分以不同的速率向下移动，吸附弱
8、的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现化合物的分离。1 1 吸附剂的选择吸附剂的选择硅胶硅胶G G 100200 100200目（拌样用）目（拌样用）200300200300目（上柱用）目（上柱用）硅胶硅胶H H 2 2 准备工作：准备工作：2 2 色谱柱的选择色谱柱的选择下端有活塞的玻璃柱下端有活塞的玻璃柱 柱子大小视分离样品的量柱子大小视分离样品的量而定而定3 3 洗脱剂的选择洗脱剂的选择 洗脱剂多一般由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，通洗脱剂多一般由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，通过不同的配比调节溶剂系统的极性，较复杂成分常用
9、梯度洗脱。过不同的配比调节溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。初始洗脱剂配比的选择：薄层试验，使待分离组分的初始洗脱剂配比的选择：薄层试验，使待分离组分的RfRf值介值介于于0.10.20.10.2之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。3 3 操作步骤操作步骤加样洗脱检测合并装柱装柱 将色谱柱洗净、干燥，底部塞一小块脱脂棉。将色谱柱洗净、干燥，底部塞一小块脱脂棉。（1 1）干装法：）干装法：将硅胶通过小漏斗倒入柱内，应不间断将硅胶通过小漏斗倒入柱内，应不间断地形成一细流慢慢加入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱地形成一细流慢慢加入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱
10、柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，从上端倒柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，从上端倒入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。（2 2）湿装法：）湿装法：将硅胶加入适量最初使用的洗脱剂，超将硅胶加入适量最初使用的洗脱剂，超声搅拌，调成混悬液，打开柱子下端活塞，徐徐将混悬液声搅拌，调成混悬液，打开柱子下端活塞，徐徐将混悬液倒入柱子，使洗脱剂慢慢流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下倒入柱子，使洗脱剂慢慢流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下端。待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉端。待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉降不再变动。
11、注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气泡降不再变动。注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气泡压入硅胶中，而且要压入硅胶中，而且要始终保持吸附剂上端有溶剂，切勿流始终保持吸附剂上端有溶剂，切勿流干干。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上面保持有面保持有1cm1cm高液面为止，关上活塞。高液面为止，关上活塞。装柱装柱洗脱洗脱检测检测合并合并加样加样3 3 操作步骤操作步骤多采用干法加样（拌样法）：多采用干法加样（拌样法）：将样品用尽将样品用尽量少的易挥发溶剂溶解，加入样品约量少的易挥发溶剂溶解，加入样品约5 5倍量倍量的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶
12、剂，或在旋的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并在柱顶放一块圆形滤纸。在柱顶放一块圆形滤纸。装柱装柱加样加样洗脱洗脱检测检测合并合并3 3 操作步骤操作步骤将通过将通过TLCTLC选择好的洗脱剂加入选择好的洗脱剂加入分液漏斗或者加液球中，使之不分液漏斗或者加液球中，使之不断缓慢加于样品之上，注意始终断缓慢加于样品之上，注意始终保持洗脱剂液面在硅胶之上，切保持洗脱剂液面在硅胶之上，切勿流干。勿流干。打开色谱柱下端活塞，控制流速，打开色谱柱下端活塞，控制流速
13、，等份收集洗脱液，也可用自动收等份收集洗脱液，也可用自动收集器收集。集器收集。通过上端加压或者下端减压可以通过上端加压或者下端减压可以提高洗脱速度，但是可能会降低提高洗脱速度，但是可能会降低塔板数影响分离效果。塔板数影响分离效果。装柱装柱加样加样洗脱洗脱检测检测合并合并3 3 操作步骤操作步骤每份洗脱液采用薄层色谱法检查。每份洗脱液采用薄层色谱法检查。装柱装柱加样加样洗脱洗脱检测检测合并合并3 3 操作步骤操作步骤成分相同（斑点相同）的洗成分相同（斑点相同）的洗脱液合并，回收溶剂。脱液合并，回收溶剂。1 2 3 4 5 6 7小极性的组分先被洗脱下来小极性的组分先被洗脱下来大极性组分后被洗脱下
14、来大极性组分后被洗脱下来（二）凝胶柱层析（二）凝胶柱层析1 原理2 凝胶层析中常用的凝胶琼琼脂糖凝脂糖凝胶胶聚丙聚丙烯酰胺烯酰胺凝凝胶胶葡聚糖凝葡聚糖凝胶胶（Sephadex）3 凝胶柱的使用 溶溶 胀胀 装装 柱柱上上 样样洗洗 脱脱羟丙基葡聚糖凝胶（羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20Sephadex LH-20）为干粉，装柱前量）为干粉，装柱前量好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重，好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重，称重后足量称重后足量用有机溶剂（常用氯仿：甲醇用有机溶剂（常用氯仿：甲醇=1=1：1 1）溶胀。）溶胀。将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好将层析
15、柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降。闭下口，使凝胶完全沉降。湿法上样：湿法上样：打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液，打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多
16、余溶液，使液面与凝胶表面相平齐。使液面与凝胶表面相平齐。将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（层（35cm35cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。控制流速，过快或过慢影响分离效果。控制流速，过快或过慢影响分离效果。流出液分步收集，分析、合并。流出液分步收集，分析、合并。1 1 原理：原理：大孔树脂为新
17、型非离子型分子聚合物吸附剂，白色球形颗粒，每个颗粒都是由许多彼此间存在孔穴的微观小球组成，称之为“大孔”。（三）大孔树脂柱色谱（三）大孔树脂柱色谱 大孔树脂色谱是以大孔树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解析条件以分离、提纯某一或某一类化合物的色谱。可分为极性、中极性、非极性三大类，根据分离物质极性的大小，通过所选择的与之相适应的大孔树脂的选择性吸附而达到分离目的。2 2 特点特点v理化性质稳定。理化性质稳定。v分离性质优良。分离性质优良。v溶剂用量小。溶剂用量小。v可重复使用。可重复使用。v对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮对天然产物化学成分如皂苷、
18、生物碱、黄酮及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用，及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用，对色素吸附作用较强。对色素吸附作用较强。3 操作步骤预处理预处理上样上样洗脱洗脱再生再生乙醇浸泡乙醇浸泡24h，充分溶胀，充分溶胀湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等量蒸馏水无白色浑浊量蒸馏水无白色浑浊 蒸馏水洗至无醇味且水液澄清。蒸馏水洗至无醇味且水液澄清。将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀、
19、滤过处理、的预先沉淀、滤过处理、PH调节，使部分杂质在处理过程中调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。一般先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进行洗脱，并控制洗一般先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进行洗脱，并控制洗脱液的用量与流速，使提取液由上而下通过树脂柱。收集、合脱液的用量与流速，使提取液由上而下通过树脂柱。收集、合并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空干燥，得精制并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空干燥，得精制产品。产品。95%乙醇洗脱至无色，再用乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再盐酸浸泡，用水洗
20、至中性，再用用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。浸泡，再用水洗至中性。(四)ODS反相柱层析1 1填料填料:ODS(octadecyl bonded silica),十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质键合的键合的C18C18填料填料,ODS适用于分离中等适用于分离中等偏大的化合物。偏大的化合物。与与HPLCHPLC不同，开放式不同，开放式ODSODS是将是将ODSODS装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵加压。加压。2 操作步骤将将ODS用甲醇浸用甲醇浸泡，具体装柱方法泡，具体装柱方法与硅胶柱相同。与硅胶柱相同。用甲醇装柱完成用甲醇装柱
21、完成后，置换成起始流后，置换成起始流动相系统。动相系统。装柱装柱上样上样洗脱洗脱湿法：用起始流湿法：用起始流动相溶解样品装柱动相溶解样品装柱。干法：对于一些干法：对于一些溶解性较差的样品溶解性较差的样品，用挥发性溶剂拌，用挥发性溶剂拌入入ODS中，挥干中，挥干溶剂。溶剂。常用梯度洗脱：常用梯度洗脱：10%甲醇甲醇/水水 30%甲醇甲醇/水水 50%甲醇甲醇/水水 70%甲醇甲醇/水水 90%甲醇甲醇/水水 100%甲醇。甲醇。根据样品情况细分根据样品情况细分调整。调整。三三 高效液相色谱高效液相色谱引引 言言 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，流动相改为
22、高压输送，采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分离分析方法。该法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称为高效液相色谱法。高效液相色谱法。（一）（一）HPLCHPLC工作原理工作原理检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次收集起来，制成纯品，供进一步化学定性和结构鉴定。收集起来，制成纯品，供进一步化学定性和结构鉴定。液相色谱柱分类正相柱：以硅胶为填料。或者硅胶表面键合-CN,-NH2等官能团。反相柱：以硅胶为基质，在其表面键合碳十八（ODS）、碳八、碳四等官能团的非极性填料。制备型制备型HPLCHPLC 分析型分析型HPLCHP
23、LC（二）（二）HPLCHPLC分类分类使使用用目目的的 分析型分析型HPLCHPLC制备型制备型HPLCHPLC分析分析HPLCHPLC制备制备HPLCHPLC色谱柱 柱内径15mm柱内径110mm（或更大）进样量仅够检测用即可尽可能加大进样量目的获得样品组成信息，研究大部分或全部样品组分纯品的制备，只对一种或几种样品组分感兴趣。检测DAD全波长检测，以保证色谱峰分离度分析HPLC确定条件后VWD单波长检测即可分析分析HPLCHPLC与制备与制备HPLCHPLC比较比较（三）（三）HPLCHPLC的使用的使用初步初步纯化纯化优化优化 色谱条件色谱条件（分析（分析HPLC）制备制备(制备制备H
24、PLC)未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有大量可能在填料表面大量可能在填料表面不可逆吸附不可逆吸附的组分的组分，直，直接进样，可导致昂贵的接进样，可导致昂贵的填料很快失效填料很快失效。此外，大量的此外，大量的杂质杂质降低对目标产物的分离度，降低对目标产物的分离度，因此限制了进样量和生产效率。因此限制了进样量和生产效率。因此，因此，HPLCHPLC前利用前利用薄层色谱、柱色谱等薄层色谱、柱色谱等进行进行初步纯化很有必要。初步纯化很有必要。常用流动相：常用流动相：甲醇：水甲醇：水(酸水酸水)乙腈：水（酸水）乙腈：水（酸水）常用色谱柱：常用色谱柱：C18，C
25、8 半制备柱半制备柱 波长：波长：全波长分析，确定最优制备波长。全波长分析，确定最优制备波长。目标：通过改变流动相的配比，在尽量短的时目标：通过改变流动相的配比，在尽量短的时 间内，间内，使目的组分的分离度达到使目的组分的分离度达到1.51.5。按用分析按用分析HPLCHPLC确定的色谱条件，确定的色谱条件，逐渐增大进样量，通过监测检逐渐增大进样量，通过监测检测谱图，依次收集洗提液，制测谱图，依次收集洗提液，制成纯品。成纯品。min051015202530mAU05001000150020002500 DAD1 A,Sig=254,10 Ref=360,10(ZHY11051001.D)DAD
26、1 B,Sig=230,10 Ref=360,10(ZHY11051001.D)DAD1 C,Sig=210,10 Ref=360,10(ZHY11051001.D)DAD1 D,Sig=320,10 Ref=360,10(ZHY11051001.D)DAD1 E,Sig=280,10 Ref=360,10(ZHY11051001.D)min0510152025mAU0100200300400500600 DAD1 A,Sig=254,10 Ref=360,10(ZHY11051004.D)DAD1 B,Sig=230,10 Ref=360,10(ZHY11051004.D)DAD1 C,Si
27、g=210,10 Ref=360,10(ZHY11051004.D)DAD1 D,Sig=320,10 Ref=360,10(ZHY11051004.D)DAD1 E,Sig=280,10 Ref=360,10(ZHY11051004.D)min020406080100120140160180mAU-200-1000100200300400500 DAD1 A,Sig=254,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 B,Sig=230,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 C,Sig=210,10 Ref=360,100(ZHY1106
28、0309.D)DAD1 D,Sig=280,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 E,Sig=320,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)YMC C18100%甲醇80%甲醇60%甲醇min020406080100120140160180mAU-200-1000100200300400500 DAD1 A,Sig=254,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 B,Sig=230,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 C,Sig=210,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 D,Sig=280,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)DAD1 E,Sig=320,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)min020406080100120140160180mAU-200-1000100200300400500 DAD1 A,Sig=254,10 Ref=360,100(ZHY11060309.D)
