1、“夹层杯夹层杯”液基抗酸杆菌检测法液基抗酸杆菌检测法 湘雅医院检验科湘雅医院检验科 刘文恩刘文恩 Email:Email: 湖南省卫生厅推广计划湖南省卫生厅推广计划内内 容容 提提 要要结核病发病情况结核病发病情况1结核病的实验室诊断方法结核病的实验室诊断方法234夹层杯诊断技术夹层杯诊断技术应用夹层杯检验技术的意义应用夹层杯检验技术的意义5湘雅医院应用情况介绍湘雅医院应用情况介绍结核感染情况结核感染情况n全世界全世界1 13 3的人口感染或曾经感染过结核的人口感染或曾经感染过结核 n全球每年新发病例全球每年新发病例80080010001000万万,死亡超过死亡超过300300万。万。n我国属
2、结核病高发病率国家之一我国属结核病高发病率国家之一,患者数患者数仅次于印度，居世界第二位。仅次于印度，居世界第二位。n结核病仍然是世界卫生组织结核病仍然是世界卫生组织(WHO)(WHO)和我国和我国重点防治的重大传染性疾病。重点防治的重大传染性疾病。中国结核病感染特点中国结核病感染特点低递降率低递降率病例发病例发现率低现率低高感染率高感染率及患病及患病率率高耐药率高耐药率高死亡率高死亡率中国结核感中国结核感染的特点染的特点结核病的实验室诊断方法结核病的实验室诊断方法 细菌学检查是发现传染源的主要途径细菌学检查是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和治疗、和手段，是确定结核病诊断和治疗、
3、评价治疗效果的可靠标准。评价治疗效果的可靠标准。实验室诊断实验室诊断培养法培养法免疫学方法免疫学方法噬菌体法噬菌体法酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法分子生物学方法分子生物学方法液体培养系统（自动化）液体培养系统（自动化）涂片法涂片法最基本的检查方法最基本的检查方法噬菌体方法噬菌体方法 分枝杆菌的噬菌体在研究中应用已有多年的分枝杆菌的噬菌体在研究中应用已有多年的历史。近年来利用分枝杆菌噬菌体能特异性历史。近年来利用分枝杆菌噬菌体能特异性地感染分枝杆菌的特性地感染分枝杆菌的特性,开发成结核菌临床检测开发成结核菌临床检测试剂盒试剂盒,检测临床标本中是否含有结核菌活菌检测临床标本中是否含有结核菌活菌,且且
4、该技术快速、简便该技术快速、简便,将是否含有结核菌活菌的检将是否含有结核菌活菌的检出时间缩短为出时间缩短为4848h h。这是一项很有希望用于流行这是一项很有希望用于流行病学研究和实验室检测的细菌学新技术。病学研究和实验室检测的细菌学新技术。酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法 酶联免疫斑点法或称结核感染酶联免疫斑点法或称结核感染T T细胞斑点试细胞斑点试 验。是检测抗原刺激后产生细胞因子验。是检测抗原刺激后产生细胞因子主要指主要指-IFN IFN 的外周血单个核细胞数的外周血单个核细胞数,根据斑点的数量来确根据斑点的数量来确定细胞分泌细胞因子的情况定细胞分泌细胞因子的情况,从单细胞水平评价细从单细胞
5、水平评价细胞免疫功能胞免疫功能,从而判断结核分枝杆菌感染的情况。从而判断结核分枝杆菌感染的情况。液体培养系统液体培养系统 是将一种是将一种O O2 2敏感的荧光钌复合物加入分枝杆敏感的荧光钌复合物加入分枝杆菌生长指示管菌生长指示管(MGIT)(MGIT)液体培养基中作为生长指试液体培养基中作为生长指试剂剂,试管底部的荧光复合物与氧气结合时处于淬试管底部的荧光复合物与氧气结合时处于淬灭状态灭状态,结核菌生长时结核菌生长时,氧气逐渐减少氧气逐渐减少,荧光复荧光复合物就发出荧光而被检测到。自动化的合物就发出荧光而被检测到。自动化的MGIT MGIT 还还可加入临界浓度的抗结核药物进行药敏分析。该可加
6、入临界浓度的抗结核药物进行药敏分析。该方法操作简便，阳性标本检出时间平均为方法操作简便，阳性标本检出时间平均为9 9天。天。但价格昂贵。但价格昂贵。涂片法的优缺点涂片法的优缺点n包括：直接涂片法、厚涂法、离心包括：直接涂片法、厚涂法、离心浓缩集菌法、漂浮集菌法等浓缩集菌法、漂浮集菌法等n优点：简便易行优点：简便易行,成本低廉成本低廉,准确性准确性较高较高n缺点：阳性率低，效果不理想。缺点：阳性率低，效果不理想。夹层杯检测技术夹层杯检测技术 运用夹层杯技术，通过标本消化液运用夹层杯技术，通过标本消化液消化后，选择有效成分离心附着于透明消化后，选择有效成分离心附着于透明高分子薄片上，经过自动或手工
7、染色，高分子薄片上，经过自动或手工染色，将完成染色的薄片用取片针取出，人工将完成染色的薄片用取片针取出，人工或计算机辅助阅片。或计算机辅助阅片。检测原理检测原理检测流程示意检测流程示意图图主要设备及相关材料主要设备及相关材料 经过消化后的标本通过滤过式夹层杯经过消化后的标本通过滤过式夹层杯过滤，将抗酸杆菌阻拦在纳米硅介质微孔过滤，将抗酸杆菌阻拦在纳米硅介质微孔滤膜膜片上，直接染色。取出膜片置于滤膜膜片上，直接染色。取出膜片置于滴有光媒介液体的阅片夹中可以直接通滴有光媒介液体的阅片夹中可以直接通过普通显微镜进行观察。过普通显微镜进行观察。检测原理检测原理检测流程示意检测流程示意图图主要设备及相关
8、材料主要设备及相关材料夹层杯诊断技术的优点夹层杯诊断技术的优点阳性率阳性率高高背景背景清晰清晰，易于观察，易于观察易于易于标准化标准化检测速度检测速度快快生物安全性生物安全性好好夹层杯诊断夹层杯诊断技术的优点技术的优点阳性率高阳性率高 液基抗酸杆菌集菌制片技术在标本中液基抗酸杆菌集菌制片技术在标本中加入消化液加入消化液,有助于降解标本中的蛋白成有助于降解标本中的蛋白成分分,使标本中的结核菌分散出来，且所用使标本中的结核菌分散出来，且所用的标本量明显大于直接涂片法，故大大提的标本量明显大于直接涂片法，故大大提高了阳性率。高了阳性率。背景清晰，易于观察背景清晰，易于观察 由于蛋白分解由于蛋白分解,
9、避免蛋白成分的聚集避免蛋白成分的聚集,从而抗酸从而抗酸杆菌分布均匀杆菌分布均匀,而且染色后背景清晰而且染色后背景清晰,很容易观察到很容易观察到抗酸杆菌的存在。抗酸杆菌的存在。易于标准化易于标准化 夹层杯诊断技术整个实验过程均可执行标夹层杯诊断技术整个实验过程均可执行标准化准化:标本体积定量标本体积定量;标本收集保存条件可控制标本收集保存条件可控制;染色温度、时间可控制染色温度、时间可控制;夹层片的面积是固定夹层片的面积是固定的的,通过离心后细菌均匀沉积在夹层片上通过离心后细菌均匀沉积在夹层片上,油油镜每个视野的实际面积也是可以计算的。通过镜每个视野的实际面积也是可以计算的。通过计算机处理后计算
10、机处理后,可准确计算每毫升痰液中抗酸可准确计算每毫升痰液中抗酸杆菌量。杆菌量。检测速度快检测速度快液基结核菌集菌制片技术液基结核菌集菌制片技术,单台单台TQ-12TQ-12离心涂片机离心涂片机,单人每日可完成单人每日可完成100100例标例标本制片本制片,阅片。而滤过式夹层杯的检测阅片。而滤过式夹层杯的检测速度更快捷，十分钟就可检测速度更快捷，十分钟就可检测5 5份标本。份标本。生物安全性好生物安全性好 整个操作均在容器中进行，并且进行整个操作均在容器中进行，并且进行了灭活处理，安全性很高。标本经树胶封了灭活处理，安全性很高。标本经树胶封存于载玻片上存于载玻片上,显微镜无须与含菌面接触显微镜无
11、须与含菌面接触,检验人员降低了实验室感染风险。检验人员降低了实验室感染风险。应用夹层杯检验技术的意义应用夹层杯检验技术的意义解决结核杆菌痰检长期存在的技术问题解决结核杆菌痰检长期存在的技术问题1 1细胞学检验方法细胞学检验方法解决抗酸杆菌痰检长期解决抗酸杆菌痰检长期存在的技术问题存在的技术问题存在的存在的问题问题阳性率偏低阳性率偏低安全性安全性标准化标准化其它类型标本其它类型标本工作效率工作效率其它微生物其它微生物检验项目检验项目阳性率偏低问题阳性率偏低问题 痰标本抗酸杆菌检出率低，这是长期困扰痰标本抗酸杆菌检出率低，这是长期困扰检验科的难题，在各级医院都存在临床明确诊检验科的难题，在各级医院
12、都存在临床明确诊断而实验室查不到抗酸杆菌的情况，一些不理断而实验室查不到抗酸杆菌的情况，一些不理解情况的医师甚至会怀疑检验科的技术水平，解情况的医师甚至会怀疑检验科的技术水平，提高应用这项技术这个问题肯定会得到明显改提高应用这项技术这个问题肯定会得到明显改善。善。安全性问题安全性问题 实验室生物安全是检验科工作的重要实验室生物安全是检验科工作的重要环节，夹层杯法液基结核杆菌检验从技术环节，夹层杯法液基结核杆菌检验从技术角度解决了这个难题。首先采用完全密闭角度解决了这个难题。首先采用完全密闭的容器进行离心，避免了气溶胶的形成，的容器进行离心，避免了气溶胶的形成，再有通过强灭活消化液配合加温彻底杀
13、灭再有通过强灭活消化液配合加温彻底杀灭结核杆菌。结核杆菌。标准化问题标准化问题 传统的痰检方法要做到标准化从技术传统的痰检方法要做到标准化从技术角度很难实现，主要依靠经验进行工作，角度很难实现，主要依靠经验进行工作，夹层杯痰检技术的整个操作和流程可以通夹层杯痰检技术的整个操作和流程可以通过时间、温度、标本量等技术参数进行量过时间、温度、标本量等技术参数进行量化，因此这项技术很有希望成为结核杆菌化，因此这项技术很有希望成为结核杆菌痰检的标准方法。痰检的标准方法。提高了工作效率提高了工作效率 从操作上看，夹层杯法在时间和程从操作上看，夹层杯法在时间和程序上看好像复杂了很多，其实从整个抗序上看好像复
14、杂了很多，其实从整个抗酸杆菌检验角度看提高了工作效率。酸杆菌检验角度看提高了工作效率。首先标本可以批量操作，再有由于通过首先标本可以批量操作，再有由于通过强消化液和离心的处理后，细菌的高度强消化液和离心的处理后，细菌的高度集中可以大大节省阅片时间，一些老方集中可以大大节省阅片时间，一些老方法要用几分钟才能看到细菌的标本用本法要用几分钟才能看到细菌的标本用本法可能很短的时间就看到了。法可能很短的时间就看到了。其它标本结核杆菌检验问题其它标本结核杆菌检验问题 在临床上经常会遇到各种体液标本在临床上经常会遇到各种体液标本查找抗酸杆菌的情况，检验科工作人员查找抗酸杆菌的情况，检验科工作人员经常感到头痛
15、，因为费了很多周折往往经常感到头痛，因为费了很多周折往往找不到细菌，用夹层杯法集菌查找即快找不到细菌，用夹层杯法集菌查找即快捷又可以明显提高阳性率。捷又可以明显提高阳性率。其它微生物检验项目的开展其它微生物检验项目的开展 脑脊液新型隐球菌检查；脑脊液新型隐球菌检查；分泌物中淋病双球菌检查；分泌物中淋病双球菌检查；各种皮肤真菌检验；各种皮肤真菌检验；组织悬液的细菌学检查。组织悬液的细菌学检查。更好的社会效益更好的社会效益早日发现并确诊结核病患者是结核病防治的早日发现并确诊结核病患者是结核病防治的最有效方式，研究数据表明，目前有最有效方式，研究数据表明，目前有7070的的结核病患者并不能够在初次检
16、查时查到结核结核病患者并不能够在初次检查时查到结核杆菌，不良的生活习惯如随地吐痰加重了结杆菌，不良的生活习惯如随地吐痰加重了结核病的流行。核病的流行。尽早发现结核病感染者是检验科的责任，因尽早发现结核病感染者是检验科的责任，因此从痰检中更早发现抗酸杆菌对结核病防治此从痰检中更早发现抗酸杆菌对结核病防治意义重大。意义重大。新的科研手段新的科研手段 流流 行行 病病 学学 调调 查查 动动 物物 模模 型型 检检 查查 手手 段段 新新 的的 细细 菌菌 培培 养养 模模 式式 新新 的的 药药 敏敏 实实 验验 方方 法法 自自 动动 化化 痰痰 检检 技技 术术细胞学检验方法细胞学检验方法妇科
17、宫颈癌细胞学检查；妇科宫颈癌细胞学检查；痰液细胞学检查；痰液细胞学检查；胸腹水脑脊液细胞学检查；胸腹水脑脊液细胞学检查；尿液细胞学检查等。尿液细胞学检查等。检验科新的效益增长点检验科新的效益增长点 全套设备投资较少，湖南省的收全套设备投资较少，湖南省的收费标准三级医院是费标准三级医院是5050元元/次，一般情况次，一般情况只要完成只要完成12001200例检查就可以收回仪器例检查就可以收回仪器投资。投资。湘雅医院临床应用情况湘雅医院临床应用情况临临 床床 研研 究究 应应 用用 情情 况况临床研究临床研究 留取留取152152例临床标本例临床标本(100(100例痰标本、例痰标本、2323例支
18、气管分泌物标本、例支气管分泌物标本、7 7例脑脊液标本、例脑脊液标本、2222例穿刺液标本例穿刺液标本)均来自本院住院、门诊及急均来自本院住院、门诊及急诊患者诊患者,标本选取方式为根据医嘱留取标本选取方式为根据医嘱留取,每每例标本同时采用液基抗酸杆菌集菌制片技例标本同时采用液基抗酸杆菌集菌制片技术和直接涂片染色法平行处理术和直接涂片染色法平行处理,并将其结果并将其结果进行比较分析。进行比较分析。至少观察至少观察100100个视野个视野,未发现抗酸杆菌者应继续观未发现抗酸杆菌者应继续观察察300300个视野个视野每每300300个视野个视野0 0条为条为(-)(-)每每300300个视野个视野1
19、-81-8条时应直接报告所查到的抗酸杆条时应直接报告所查到的抗酸杆菌条数菌条数每每100100个视野个视野3-93-9条为条为(+)(+)每每1010个视野个视野1-91-9条为条为(+)(+)每个视野每个视野1-91-9条为条为(+)(+)每个视野每个视野1010条为条为(+)(+)判断结果方法判断结果方法结结 果果 表表1 1 液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法检测结果比液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法检测结果比较较 液基抗酸杆菌集菌制片技术液基抗酸杆菌集菌制片技术 直接涂片染色法直接涂片染色法 阳性阳性(例数例数)阴性阴性(例数例数)合计合计 阳性阳性(例数例数)10(6.
20、58%)0 10(6.58%)10(6.58%)0 10(6.58%)阴性阴性(例数例数)14(9.21%)128 142)14(9.21%)128 142 合计合计 24(15.79%)128 15224(15.79%)128 152 注注:直接涂片染色法直接涂片染色法:阳性率阳性率=6.58%=6.58%液基抗酸杆菌集菌制片技术液基抗酸杆菌集菌制片技术:阳性率阳性率=15.79%.=15.79%.其检测阳性率明显提高其检测阳性率明显提高(X(X2 2=50.51,p0.01)=50.51,p0.01)。表表2 2 液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法检出菌量的比较液基抗酸杆菌集菌制片技
21、术与直接涂片染色法检出菌量的比较 菌量菌量 直接涂片直接涂片 (例数例数)液基集菌制片技术液基集菌制片技术(例数例数)合计合计 -14 0 14-14 0 14 +10 9 19 +10 9 19 +0 4 4 +0 4 4+0 3 3+0 3 3+0 8 8 +0 8 8 合计合计 24 24 2424 48 48 注注:液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法相比检出菌量明显增多液基抗酸杆菌集菌制片技术与直接涂片染色法相比检出菌量明显增多 (u=2.1467,p0.05)(u=2.1467,p0.05)镜下比较镜下比较 痰涂片镜检法 夹层杯集菌法 应用情况应用情况 湘雅医院微生物实验室自湘
22、雅医院微生物实验室自20102010年年7 7月月1 1日搬迁新院至今：共检测临床标本日搬迁新院至今：共检测临床标本70507050例，阳性标本共例，阳性标本共225225例，阳性率为例，阳性率为3.19%3.19%。包括包括4 4例例脓汁、脓汁、3 3例例穿刺液、穿刺液、2 2例例胃液、胃液、1 1例例脑脊液、脑脊液、1 1例例大便、大便、1 1例例胸水标本，其余为胸水标本，其余为呼吸道标本。呼吸道标本。夹层杯诊断技术所获荣誉夹层杯诊断技术所获荣誉C1515项国家专利项国家专利C3 3项国际专利项国际专利C荣登荣登“十一五国家重大科技成就展十一五国家重大科技成就展C技术应用后合作单位及应用单位发技术应用后合作单位及应用单位发表论文表论文1818篇篇
