1、第三节第三节 代谢网络中碳架代谢网络中碳架 物质流的调动物质流的调动 第1页，共104页。处于一定环境条件下的微处于一定环境条件下的微生物培养物中，参与代谢的物生物培养物中，参与代谢的物质在代谢途径（网络）中按一质在代谢途径（网络）中按一定规律流动，形成微生物代谢定规律流动，形成微生物代谢的物质流。的物质流。第2页，共104页。代谢物质的流动过程是一种类似代谢物质的流动过程是一种类似“流体流动流体流动”的过程，它具备流动的一切的过程，它具备流动的一切属性，诸如属性，诸如 方向性、连续性、有序性、可方向性、连续性、有序性、可调性等等，调性等等，并且可以接受疏导、阻塞、分并且可以接受疏导、阻塞、分
2、流、汇流等流、汇流等“治理治理”，也可能发生也可能发生“干枯干枯”和和“溢出溢出(泛滥泛滥)”等现象。此等现象。此外，还有流速和流量等问题。外，还有流速和流量等问题。第3页，共104页。化能异养型微生物以有机化化能异养型微生物以有机化合物为碳源和能源。因此，在合物为碳源和能源。因此，在讨论化能异养型微生物代谢流讨论化能异养型微生物代谢流动时，首先抓住碳元素代谢这动时，首先抓住碳元素代谢这个主要矛盾，研究微生物细胞个主要矛盾，研究微生物细胞的碳架物质流。的碳架物质流。第4页，共104页。4.3.1 碳架物质在代谢途径（代碳架物质在代谢途径（代 谢网络）中的流动谢网络）中的流动4.3.2 微生物的
3、代谢流及其治理微生物的代谢流及其治理第5页，共104页。4.3.1 碳架物质在代谢途径（代谢碳架物质在代谢途径（代谢网络）中的流动网络）中的流动 在典型的工业发酵过程中，微生在典型的工业发酵过程中，微生物的代谢流包括营养物质进入细胞、物的代谢流包括营养物质进入细胞、代谢中间物（碳架物质）在代谢途径代谢中间物（碳架物质）在代谢途径中的流动和代谢产物从细胞进入环境中的流动和代谢产物从细胞进入环境这样顺序发生的过程。这样顺序发生的过程。第6页，共104页。4.3.1.1 有机化合物的组成元素及它们有机化合物的组成元素及它们 各自在生命活动中的作用（略）各自在生命活动中的作用（略）第7页，共104页。
4、4.3.1.2 碳架物质在代谢途径中的流动碳架物质在代谢途径中的流动 以代谢流动的观点加深对代谢网络的认以代谢流动的观点加深对代谢网络的认识：碳架物质在网络的有关途径中流动，从识：碳架物质在网络的有关途径中流动，从原料到终端产物碳架物质流经的路径叫做原料到终端产物碳架物质流经的路径叫做载载流路径流路径。第8页，共104页。4.3.1.3 典型工业发酵的工作模式典型工业发酵的工作模式 典型的工业发酵要从发酵液中获得典型的工业发酵要从发酵液中获得微生物的代谢产物，也就是要让原料有微生物的代谢产物，也就是要让原料有机化合物在微生物细胞的有关的代谢途机化合物在微生物细胞的有关的代谢途径（载流路径）中流
5、动的过程中，转化径（载流路径）中流动的过程中，转化成工业发酵的目的产物，最后目的产物成工业发酵的目的产物，最后目的产物分泌出细胞。分泌出细胞。第9页，共104页。Working pattern of cell-machine in Industrial Fermentation工业发酵细胞机器的工作模式工业发酵细胞机器的工作模式第10页，共104页。上图中，白色椭圆代表细胞的上图中，白色椭圆代表细胞的界面界面，界面包围部分是界面包围部分是细胞机器细胞机器，界面外侧是，界面外侧是细胞机器所在的细胞机器所在的环境环境。带箭头的黑线代表。带箭头的黑线代表典型的工业发酵的细胞机器的典型的工业发酵的细胞
6、机器的载流路径载流路径。N代表代表营养物质营养物质，P代表代表目的产物目的产物。第11页，共104页。4.3.2 微生物的代谢流及其治理微生物的代谢流及其治理第12页，共104页。我们曾从我们曾从热力学热力学的角度把微生物看的角度把微生物看作远离平衡状态的不平衡的开放体系；作远离平衡状态的不平衡的开放体系；我们曾借助我们曾借助电学电学的知识来讨论生物氧化的知识来讨论生物氧化和代谢能的问题；我们曾借用和代谢能的问题；我们曾借用互联网互联网的概的概念来讨论代谢网络的延伸问题；在这里我念来讨论代谢网络的延伸问题；在这里我们要借用们要借用流体力学流体力学的常识来分析微生物的常识来分析微生物细胞的代谢流
7、。细胞的代谢流。第13页，共104页。如果把碳架物质流看作水一样的流体，如果把碳架物质流看作水一样的流体，那么按照工业发酵的工作模式，就可把微生那么按照工业发酵的工作模式，就可把微生物活细胞看作是有一个总的进水口和一个总物活细胞看作是有一个总的进水口和一个总的出水口的、包含特定的管道网的大容器，的出水口的、包含特定的管道网的大容器，组成管道网的管道有粗有细，管道网的管道组成管道网的管道有粗有细，管道网的管道有分支、有交叉，有可控的阀门。有分支、有交叉，有可控的阀门。代谢物质代谢物质流就如同自来水一样在管道和阀门的控制流就如同自来水一样在管道和阀门的控制下流进和流出细胞，形成代谢流。下流进和流出
8、细胞，形成代谢流。第14页，共104页。在这个认识的基础上，结合代在这个认识的基础上，结合代谢能支撑假说和代谢网络假说的内谢能支撑假说和代谢网络假说的内容，讨论微生物的代谢及代谢流的容，讨论微生物的代谢及代谢流的变动性；结合本章（变动性；结合本章（代谢调节的代谢调节的 3 个子系统个子系统）的内容，讨论代谢流对）的内容，讨论代谢流对环境条件的响应和代谢流治理的可环境条件的响应和代谢流治理的可能性。最后还要讨论有关代谢节点能性。最后还要讨论有关代谢节点的刚性的问题。的刚性的问题。第15页，共104页。微生物的微生物的代谢途经的变动性和可调代谢途经的变动性和可调节性节性，不但是代谢流飘移的内在原因
9、，不但是代谢流飘移的内在原因，而且也是人工控制代谢流的生物学根据。而且也是人工控制代谢流的生物学根据。工业发酵中，人的主观能动作用表现在对工业发酵中，人的主观能动作用表现在对代谢流的治理上。代谢流的治理上。治理的直接的目的是让治理的直接的目的是让微生物细胞过量合成（微生物细胞过量合成（overproduction）人们所需要的代谢产物。人们所需要的代谢产物。第16页，共104页。4.3.2.1 碳架物质在代谢网络中流经的碳架物质在代谢网络中流经的 分支处及各分支的流量分配分支处及各分支的流量分配 4.3.2.2 过量合成与微生物的异常代谢过量合成与微生物的异常代谢4.3.2.3 溢出代谢溢出代
10、谢4.3.2.4 代谢流治理的可能性和现实性代谢流治理的可能性和现实性4.3.2.5 代谢网络的刚性代谢网络的刚性第17页，共104页。4.3.2.1 碳架物质在代谢网络中流经的碳架物质在代谢网络中流经的分支处及各分支的流量分配分支处及各分支的流量分配 我们把代谢网络中代谢途径的交叉点我们把代谢网络中代谢途径的交叉点叫做代谢网络的叫做代谢网络的“节点节点”，实际上它实际上它们是碳架物质在代谢网络中流经的们是碳架物质在代谢网络中流经的代代谢中间物谢中间物。初级代谢网络的中心板块上的。初级代谢网络的中心板块上的 12 种前体代谢物种前体代谢物是当然的是当然的节点节点，而且还，而且还是代谢途径的是代
11、谢途径的分流分流或或汇流汇流处。处。第18页，共104页。节点处不论发生汇流还是分流，节点处不论发生汇流还是分流，都存在都存在流量分配流量分配的问题。这个分配既的问题。这个分配既与遗传因素有关，又与条件因素有与遗传因素有关，又与条件因素有关。关。不同微生物物种的代谢途径基本不同微生物物种的代谢途径基本一致，一致，因此，可在微生物学有关工具因此，可在微生物学有关工具书查到有关的途径；书查到有关的途径；而代谢调节机制而代谢调节机制并不完全一样并不完全一样，不一致的情况可在有关，不一致的情况可在有关论文或综述中找到。论文或综述中找到。第19页，共104页。在生物化学中，早有一套描述代谢途径的在生物化
12、学中，早有一套描述代谢途径的调节机制的方法，例如，用一个从效应物（途调节机制的方法，例如，用一个从效应物（途径的终端产物）引出的、指向途径中某个代表径的终端产物）引出的、指向途径中某个代表酶的短箭头的长箭头来标示反馈调节。这种标酶的短箭头的长箭头来标示反馈调节。这种标示方法对于线状途径或偶有分支的途径来说，示方法对于线状途径或偶有分支的途径来说，是很有用的，但是，如果在代谢网络图中使用，是很有用的，但是，如果在代谢网络图中使用，代表调节的箭头与代表酶的箭头交织在一起，代表调节的箭头与代表酶的箭头交织在一起，容易引起误解。容易引起误解。因此我们要因此我们要启用一种新的代谢调节图图例，启用一种新的
13、代谢调节图图例，用来标记代谢网络图用来标记代谢网络图。这种标记方法有四个要。这种标记方法有四个要点：点：第20页，共104页。标明调节方式标明调节方式 用用“I”表示表示抑制抑制（inhibition），），用用“A”表表示示激活激活（activation），），用用“R”表示表示阻遏阻遏（repression）；）；标明效应物标明效应物 一般用三个字母标示效应物（一般用三个字母标示效应物（调节特定调节特定的酶的水平或活性的化合物的酶的水平或活性的化合物 叫做这种酶的叫做这种酶的效应物）效应物）；第21页，共104页。标明受调节的酶：标明受调节的酶：代谢网络图中箭头所代表的酶的名代谢网络图中箭
14、头所代表的酶的名称放在括号内，称放在括号内，标在该箭头旁边；标在该箭头旁边；对酶的调节的对酶的调节的具体的表示方法具体的表示方法：在代表酶的箭头旁边标上代表效应物在代表酶的箭头旁边标上代表效应物的的 3 个字母和代表调节机制的特定字母。个字母和代表调节机制的特定字母。第22页，共104页。例如：某效应物名称后面加上例如：某效应物名称后面加上“I”，标标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该酶的在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该酶的抑制抑制作用作用；效应物名称后面加上；效应物名称后面加上“A”，标在代表酶标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该酶的的箭头旁边，表示该效应物对该酶的激活作用激活作用；
15、效应物名称后面加上效应物名称后面加上“R”，标在代表酶的箭标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该酶的头旁边，表示该效应物对该酶的阻遏作用阻遏作用。如。如果果 2 种效应物种效应物协同作用协同作用，则在两个效应物的名称，则在两个效应物的名称都写上，再在后面加上对应的英文字母。都写上，再在后面加上对应的英文字母。第23页，共104页。第24页，共104页。上图（碳架物质在上图（碳架物质在 EMP和和 HMP途径上的途径上的分流控制图）是一张按此方法标示的网络图，分流控制图）是一张按此方法标示的网络图，请按此方法读图，并从以下说明中得到帮请按此方法读图，并从以下说明中得到帮助。助。大肠杆菌细胞磷酸果
16、糖激酶（大肠杆菌细胞磷酸果糖激酶（PFK）的的酶水平随条件而变动，有氧生长中细胞的酶水平随条件而变动，有氧生长中细胞的PFK水平低于厌氧生长中的细胞，有氧生长水平低于厌氧生长中的细胞，有氧生长中的细胞的中的细胞的PFK（由二聚体组成），对由二聚体组成），对ATP不不敏感，厌氧生长中的细胞的敏感，厌氧生长中的细胞的PFK（由四聚体组由四聚体组成），对成），对ATP敏感。敏感。第25页，共104页。在有氧条件下在有氧条件下，由于，由于PFK的低水平和的低水平和 FDP 醛缩酶（醛缩酶（FDPA）的极端低水平，的极端低水平，大肠大肠杆菌主要经杆菌主要经 HMP 途径降解葡萄糖途径降解葡萄糖。因为在有
17、因为在有氧条件下氧条件下 PFK 对对 ATP不敏感，且其活力高于不敏感，且其活力高于FDP醛缩酶（醛缩酶（FDPA），），FDP 有累积有累积，所以，所以它可能对它可能对 HMP 途径的途径的 6-磷酸葡萄糖酸脱氢磷酸葡萄糖酸脱氢酶（酶（6PGDH）起抑制物的作用，使起抑制物的作用，使6PGDH成为成为HMP降解流上的一个降解流上的一个“阀门阀门”（有氧条（有氧条件下的控制件下的控制“阀门阀门”）。）。第26页，共104页。在厌氧条件下在厌氧条件下，PFK和和FDPA水平较有氧水平较有氧时高，因而时高，因而 EMP 途径对葡萄糖降解代谢的参途径对葡萄糖降解代谢的参与程度增加与程度增加。因为因
18、为 PFK 的水平仍高于的水平仍高于FDPA，FDP 仍然累积并继续抑制仍然累积并继续抑制 6PGDH，但随着但随着EMP参与程度的增加，参与程度的增加，EMP 途径所产生的途径所产生的NADH浓度增高浓度增高。NADH是是6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）的效应物，的效应物，NADH 浓度上升浓度上升就会就会抑制抑制 G6PDH，使使 G6PDH 成为成为 HMP降解流降解流上的另一个上的另一个“阀门阀门”（厌氧条件下的控制厌氧条件下的控制 “阀门阀门”）。）。第27页，共104页。这种抑制作用是必要的，因为提高葡这种抑制作用是必要的，因为提高葡萄糖浓度可以使萄糖浓度可以使
19、FDPA水平上升许多倍，而水平上升许多倍，而 PFK 水平基本保持不变，这样水平基本保持不变，这样 FDP 浓度势必浓度势必是低的，以致无法控制是低的，以致无法控制 6PGDH，这时这时 NADH就通过对就通过对 G6PDH 的抑制作用控制的抑制作用控制 HMP 降解流。这种两个降解流。这种两个“阀门阀门”交替控制的交替控制的机制可以解释为什么在机制可以解释为什么在严格厌氧条件下，大肠严格厌氧条件下，大肠杆菌经杆菌经 HMP 途径降解的葡萄糖只占葡萄糖降途径降解的葡萄糖只占葡萄糖降解总量的解总量的2030。第28页，共104页。4.3.2.2 过量合成和微生物的异常代谢过量合成和微生物的异常代
20、谢 野生菌株在它们天然栖息地在其生长野生菌株在它们天然栖息地在其生长或维持，需要时也能合成人们所希望的代或维持，需要时也能合成人们所希望的代谢产物，但在其固有的代谢调节机制的控谢产物，但在其固有的代谢调节机制的控制下合成的量不多不少，只够细胞自身生制下合成的量不多不少，只够细胞自身生长或维持的需要。体现了微生物细胞的长或维持的需要。体现了微生物细胞的经经济性济性。第29页，共104页。适用于发酵生产的微生物必须具有有过适用于发酵生产的微生物必须具有有过量合成的能力，也就是说是其目的产物的合量合成的能力，也就是说是其目的产物的合成量必须大大高于它通常的合成量。要做到成量必须大大高于它通常的合成量
21、。要做到这一点，不仅要求合成目的产物的途径畅通，这一点，不仅要求合成目的产物的途径畅通，还必须有将目的产物排出细胞的满意的机制。还必须有将目的产物排出细胞的满意的机制。过量合成的速率取决于微生物的遗传性能，过量合成的速率取决于微生物的遗传性能，以及在培养条件下细胞的生理状态。以及在培养条件下细胞的生理状态。第30页，共104页。把自然界中自然竞争中幸存的微把自然界中自然竞争中幸存的微生物称为生物称为野生型微生物野生型微生物，它们具有比较严，它们具有比较严密的代谢调节功能，至少在它们幸存的环密的代谢调节功能，至少在它们幸存的环境条件下不会过量合成初级代谢产物。境条件下不会过量合成初级代谢产物。在
22、在这样的细胞经济体系中，细胞的生产力这样的细胞经济体系中，细胞的生产力体现在其自身的增殖。细胞固有的生产体现在其自身的增殖。细胞固有的生产关系支持细胞自身的增殖（生产细胞），关系支持细胞自身的增殖（生产细胞），不支持（人的）不支持（人的）目的产物的过量生产目的产物的过量生产（生产特定的初级代谢产物）。（生产特定的初级代谢产物）。第31页，共104页。要解放细胞对于目的产物（特要解放细胞对于目的产物（特定的初级代谢产物）的生产力，就定的初级代谢产物）的生产力，就有必要改变细胞原有的生产关系。有必要改变细胞原有的生产关系。对微生物进行遗传改造，就是要对微生物进行遗传改造，就是要修修正原有的生产关系
23、。正原有的生产关系。第32页，共104页。微生物过量合成目的产物（微生物过量合成目的产物（特定特定的代谢中间产物的代谢中间产物）的过程，实质上是）的过程，实质上是功能残缺功能残缺或或遗传失常遗传失常的微生物细胞在的微生物细胞在人为的特定条件下进行人为的特定条件下进行异常代谢异常代谢的过的过程。因此，程。因此，研究微生物过量合成指定研究微生物过量合成指定的初级代谢产物的机理，就是研究工的初级代谢产物的机理，就是研究工业业微生物的病理学微生物的病理学。第33页，共104页。微生物排出某些微生物排出某些能量代谢副产物能量代谢副产物的过的过程，实质上是兼性厌氧微生物在环境条件程，实质上是兼性厌氧微生物
24、在环境条件逼迫下（如缺氧），变通地逼迫下（如缺氧），变通地维持生计维持生计的过的过程。程。兼性厌氧微生物细胞在缺氧的条件下，兼性厌氧微生物细胞在缺氧的条件下，以变通的方式实现还原力的平衡和辅酶的以变通的方式实现还原力的平衡和辅酶的再生和回用，使细胞的能量代谢得以维持，再生和回用，使细胞的能量代谢得以维持，与此同时形成并分泌出能量代谢副产物。与此同时形成并分泌出能量代谢副产物。例如酿酒酵母在发酵液中累积能量代谢例如酿酒酵母在发酵液中累积能量代谢副产物乙醇的过程，就是这样的过程。副产物乙醇的过程，就是这样的过程。第34页，共104页。4.3.2.3 溢出代谢溢出代谢 发生溢出代谢（发生溢出代谢（o
25、verflow metabolism）的的原因是，代谢途径前段的运转速率大于后段原因是，代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。采用改变环境条件或限制营养的运转速率。采用改变环境条件或限制营养供应等方法，可促使微生物进行溢出代谢。供应等方法，可促使微生物进行溢出代谢。这里介绍两个溢出代谢的实例：这里介绍两个溢出代谢的实例：TCA环中间产物柠檬酸的溢出代谢，环中间产物柠檬酸的溢出代谢，导致能量代谢的副产物乙醇生成的溢出代导致能量代谢的副产物乙醇生成的溢出代谢。谢。第35页，共104页。柠檬酸的溢出代谢：柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受激而过量合成柠檬酸。多种微生物均能因受激而过量合成柠檬酸
26、。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以下三个方面：包括以下三个方面：第36页，共104页。GlcG-6-P(PFK)CTA ,NH4I+AFDPPYR
27、OAAAcCoACTACAAICA-KG(PC)(CS)(KD)黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出第37页，共104页。高水平的柠檬酸合成能力高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由。这个能力由 3 个因素构成。第一是在有高浓度草酰乙酸个因素构成。第一是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对的情况下对 AcCoA 具有高度亲和力的具有高度亲和力的组成型的组成型的柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶（CS）的存在；第二是的存在；第二是催化丙酮酸催化丙酮酸 （PYR）固定固定 CO2 生成草酰乙酸反生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶（PC）的存在；第三是在缺
28、少锰的条件下，蛋白质分的存在；第三是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠铵的高浓度能解除柠檬酸（檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。的抑制。此外，柠檬酸的分泌降低其胞内浓度。此外，柠檬酸的分泌降低其胞内浓度。第38页，共104页。较低的降解柠檬酸的能力。较低的降解柠檬酸的能力。这能力由这能力由两个因素构成。第一是两个因素构成。第一是低水平的低水平的-酮戊二酮戊二酸脱氢酶酸脱氢酶（KD）影响影响 TCA环运行的畅通环运行的畅通程度，程度，使使TCA环前半部的中间产物积压；环前半部的中间产物积压；第第二，在锰缺乏的条
29、件下，二，在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（顺乌头酸酶（AE）和和 异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低的活性降低，从，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头顺乌头酸、异柠檬酸和酸、异柠檬酸和-酮戊二酸）更明显。酮戊二酸）更明显。第39页，共104页。在柠檬酸过量合成阶段，在柠檬酸过量合成阶段，培养基的培养基的 pH 值值显然会影响细胞显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸和的跨膜膜对目的产物柠檬酸和的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的培养基的 pH 值值。锰与铁的缺。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。乏有利于柠檬酸的排出。第40页，共
30、104页。乙醇的溢出代谢：乙醇的溢出代谢：葡萄糖为碳源，对酿酒酵母进行葡萄糖为碳源，对酿酒酵母进行批式培养，出现二段生长（批式培养，出现二段生长（two growth phase）现象：在现象：在第一阶段第一阶段，葡萄糖浓度较大，萄萄糖的消耗伴随葡萄糖浓度较大，萄萄糖的消耗伴随着着乙醇的产生乙醇的产生；第二阶段，葡萄糖浓；第二阶段，葡萄糖浓度下降到某值以下，度下降到某值以下，乙醇被氧化乙醇被氧化。第41页，共104页。这样的二段生长现象曾被认为是这样的二段生长现象曾被认为是呼吸途径的阻遏和解阻遏，而且认为是呼吸途径的阻遏和解阻遏，而且认为是分解代谢物阻遏（此名称已被营养阻遏分解代谢物阻遏（此名
31、称已被营养阻遏代替，见本章代替，见本章4.1.2.1）。）。后来才认识后来才认识到，酿酒酵母之所以在葡萄糖培养到，酿酒酵母之所以在葡萄糖培养基中累积乙醇，是因为该微生物有基中累积乙醇，是因为该微生物有限的呼吸能力，并把这种现象称为限的呼吸能力，并把这种现象称为瓶颈效应（瓶颈效应（bottleneck effect）。）。第42页，共104页。细胞并不会因为葡萄糖的高速消细胞并不会因为葡萄糖的高速消耗而附带地形成足够高的呼吸能力耗而附带地形成足够高的呼吸能力（指呼吸链使（指呼吸链使NADH再生的能力）与再生的能力）与之配套；而且葡萄糖的异生成途径之配套；而且葡萄糖的异生成途径（需（需NADH）因
32、受到高浓度的葡萄糖因受到高浓度的葡萄糖的调节而受阻，更加强了瓶颈效应。因的调节而受阻，更加强了瓶颈效应。因此瓶颈是对生物氧化中呼吸链电子传递此瓶颈是对生物氧化中呼吸链电子传递通道的相对狭窄而言的。通道的相对狭窄而言的。第43页，共104页。在供氧情况下，酿酒酵母细胞中葡萄糖在供氧情况下，酿酒酵母细胞中葡萄糖主要经主要经 EMP-TCA 途径（途径（少量经少量经HMP途径途径）氧）氧化降解。这些途径运行中形成的化降解。这些途径运行中形成的NADH和和FADH2分子上的电子需经电子传递链（呼吸链）传递给分子上的电子需经电子传递链（呼吸链）传递给分子氧。分子氧。当葡萄糖浓度较低时，葡萄糖氧化降解过程
33、当葡萄糖浓度较低时，葡萄糖氧化降解过程所需配套的电子传递能力处于电子传递链传递能所需配套的电子传递能力处于电子传递链传递能力范围以内，这时氧的吸收速率与细胞的生长速力范围以内，这时氧的吸收速率与细胞的生长速率成线性关系。辅酶率成线性关系。辅酶NADH 和辅基和辅基 FADH2 完全完全可以在电子传递链释放电子而得到再生。可以在电子传递链释放电子而得到再生。第44页，共104页。当葡萄糖的浓度超过某值，葡萄糖氧化降解当葡萄糖的浓度超过某值，葡萄糖氧化降解过程所需配套的电子传递能力超越微生物细胞电过程所需配套的电子传递能力超越微生物细胞电子传递链传递能力范围，一部分子传递链传递能力范围，一部分NA
34、DH不能通不能通过电子传递链而再生成过电子传递链而再生成 NAD+，只好将电子只好将电子交给内源的有机化合物乙醛，将乙醛还原交给内源的有机化合物乙醛，将乙醛还原成乙醇，从而实现还原力的平衡。从而导成乙醇，从而实现还原力的平衡。从而导致生成乙醇的溢出代谢。致生成乙醇的溢出代谢。由此可见，乙醇由此可见，乙醇的溢出代谢实际上是细胞内生物氧化过程的溢出代谢实际上是细胞内生物氧化过程中形成的还原力相对于电子传递链的呼吸中形成的还原力相对于电子传递链的呼吸能力的溢出，推动了乙醛还原生成乙醇的能力的溢出，推动了乙醛还原生成乙醇的发酵过程。发酵过程。第45页，共104页。从以上实例可以看到，溢出代从以上实例可
35、以看到，溢出代谢的发生，不但要求微生物本身具有谢的发生，不但要求微生物本身具有相应的遗传根据，还必须具备相应的相应的遗传根据，还必须具备相应的环境条件。环境条件。对于工业发酵来说，就是特定的对于工业发酵来说，就是特定的生产菌种和与其对应的生产工艺条件。生产菌种和与其对应的生产工艺条件。第46页，共104页。4.3.2.4 代谢流代谢流“治理治理”的可能性和的可能性和 现实性现实性 代谢流具有流体流动的基本属性，代谢流具有流体流动的基本属性，因此具有因此具有“治理治理”的可能性；微生物代的可能性；微生物代谢的变动性和微生物遗传的保守性，加谢的变动性和微生物遗传的保守性，加上人的主观能动性，能使可
36、能变为现实。上人的主观能动性，能使可能变为现实。本课程主要讨论初级代谢产物的本课程主要讨论初级代谢产物的过量合成，兼顾次级代谢产物的合成。过量合成，兼顾次级代谢产物的合成。第47页，共104页。现代发酵工程依靠微生物活细胞现代发酵工程依靠微生物活细胞来完成发酵工厂生产线上不可缺少的来完成发酵工厂生产线上不可缺少的加工（或转化）步骤，在这个意义上，加工（或转化）步骤，在这个意义上，微生物活细胞就是工业发酵生产线上不微生物活细胞就是工业发酵生产线上不可缺少的微生物生物机器（或称细胞机可缺少的微生物生物机器（或称细胞机器）器），是发酵工厂里关键的生产机器。，是发酵工厂里关键的生产机器。第48页，共1
37、04页。细胞机器与普通意义上的机器不同，细胞机器与普通意义上的机器不同，它们它们必须由代谢能必须由代谢能（metabolic energy）直接驱动直接驱动。在发酵工厂的生产线上，微。在发酵工厂的生产线上，微生物必须完成微生物细胞机器的生物必须完成微生物细胞机器的在线制在线制造（细胞增殖）和生产运行（目的产物的造（细胞增殖）和生产运行（目的产物的合成和输出）的双重任务。合成和输出）的双重任务。第49页，共104页。根据工业发酵的现状，根据工业发酵的现状，把依靠化能异把依靠化能异养型微生物合成某最终被分泌到胞外的初级养型微生物合成某最终被分泌到胞外的初级代谢产物的过程，作为工业发酵的典型过程代谢
38、产物的过程，作为工业发酵的典型过程来研究，并把代谢研究的重点放在碳的代谢来研究，并把代谢研究的重点放在碳的代谢上。上。从而建立了从而建立了生物机器生物机器（又称（又称细胞机器细胞机器）工作的基本模式。在此工作的基本模式。在此工作模式工作模式的基础上，的基础上，提出了工业发酵中微生物代谢的提出了工业发酵中微生物代谢的五段式五段式和初和初级代谢产物的过量合成的级代谢产物的过量合成的五字策略五字策略。第50页，共104页。在物竞天择的基础上建立的细胞经在物竞天择的基础上建立的细胞经济体系已经经受长期的实践检验，并已济体系已经经受长期的实践检验，并已成为微生物细胞生命活动的保障体系。成为微生物细胞生命
39、活动的保障体系。微生物通过生存竞争而获得的一整套自微生物通过生存竞争而获得的一整套自我调节机制，原本服务于微生物的自然我调节机制，原本服务于微生物的自然竞争和生命保障，因此它不会大量的合竞争和生命保障，因此它不会大量的合成维持自我生存之外的代谢产物。而人成维持自我生存之外的代谢产物。而人类因自我发展的需要，却希望微生物能类因自我发展的需要，却希望微生物能够大量地合成能满足人类需求为目的产够大量地合成能满足人类需求为目的产物（微生物的代谢产物）。物（微生物的代谢产物）。第51页，共104页。微生物代谢产物的生物合成是系统工微生物代谢产物的生物合成是系统工程，要完成这一类系统工程，必须依靠微程，要
40、完成这一类系统工程，必须依靠微生物的高度有序的生命活动，决不是打乱生物的高度有序的生命活动，决不是打乱它，而是在可能的范围内对它进行有效的它，而是在可能的范围内对它进行有效的引导。引导。工业发酵呼唤人与微生物的合作，而工业发酵呼唤人与微生物的合作，而在合作中，人处于主导的地位，人应该发在合作中，人处于主导的地位，人应该发挥主观能动作用。挥主观能动作用。第52页，共104页。初级代谢产物的合成初级代谢产物的合成 初级代谢产物是指这样一些低分初级代谢产物是指这样一些低分子质量的合成途径的终产物，它们子质量的合成途径的终产物，它们是是构建生物大分子的分子模块构建生物大分子的分子模块，是微生物，是微生
41、物营养性生长所必需的生长因子，如氨基营养性生长所必需的生长因子，如氨基酸、嘌呤和嘧啶的核苷与核苷酸以及维酸、嘌呤和嘧啶的核苷与核苷酸以及维生素。生素。第53页，共104页。初级代谢产物都是从中心代谢途径的初级代谢产物都是从中心代谢途径的中间产物（中间产物（12种前体代谢物）开始合成的。种前体代谢物）开始合成的。因为它们都是微生物营养性生长所必需的，因为它们都是微生物营养性生长所必需的，除了遗传上有缺陷的菌株外，微生物细胞具除了遗传上有缺陷的菌株外，微生物细胞具有齐全的初级代谢途径基因，也就是说有齐全的初级代谢途径基因，也就是说在合在合适的环境条件下它们的初级代谢途径是普适的环境条件下它们的初级
42、代谢途径是普遍存在的遍存在的。初级途径上的酶的特异性比次级。初级途径上的酶的特异性比次级代谢的酶的特异性要高。代谢的酶的特异性要高。第54页，共104页。各种微生物的初级代谢产物的合成途径各种微生物的初级代谢产物的合成途径基本相同，在同一属微生物中，初级代谢产基本相同，在同一属微生物中，初级代谢产物合成途径的差异是十分罕见的，但在合成物合成途径的差异是十分罕见的，但在合成的调节机制上有较大的差异。的调节机制上有较大的差异。初级代谢产物合成的途径是稳定的，不初级代谢产物合成的途径是稳定的，不同微生物物种的调节机制是可以弄清楚或基同微生物物种的调节机制是可以弄清楚或基本弄清楚的，这就是对这种合成代
43、谢流本弄清楚的，这就是对这种合成代谢流“治治理理”的基础。的基础。这种这种“治理治理”要用到遗传手段要用到遗传手段（遗传脱钩遗传脱钩），并辅之以培养条件的优化），并辅之以培养条件的优化（环境协调环境协调），以求达到），以求达到初级代谢产物过量合初级代谢产物过量合成的目的。成的目的。第55页，共104页。.初级代谢产物过量合成的五字策略初级代谢产物过量合成的五字策略 在分析细胞机器的生产运行时，可把它看在分析细胞机器的生产运行时，可把它看作是分步进行的过程。首先细胞外的营养物质作是分步进行的过程。首先细胞外的营养物质从环境（培养基）跨膜进入细胞；然后，一般从环境（培养基）跨膜进入细胞；然后，一般
44、要经过向心、中心和离心要经过向心、中心和离心 3 段连续的代谢途径段连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的产物；最后，目的代谢，才能在胞内生成目的产物；最后，目的产物经过膜排出细胞，回到环境（发酵醪的产物经过膜排出细胞，回到环境（发酵醪液）。液）。第56页，共104页。“载流途径载流途径”泛指承载代谢物流的泛指承载代谢物流的代谢途径。代谢途径。“载流路径载流路径”泛指由不止一泛指由不止一条载流途径按序首尾衔接而组成的代谢通条载流途径按序首尾衔接而组成的代谢通道。道。在发酵工程领域，在发酵工程领域，“载流路径载流路径”作为作为发酵工程的专用术语，被定义为从主要发酵工程的专用术语，被定义为从主要
45、有机原料到目的产物一组载流途径的有有机原料到目的产物一组载流途径的有序组合。序组合。第57页，共104页。典型的典型的载流路径载流路径是指存在于代谢网络是指存在于代谢网络中的这样的代谢通道，即中的这样的代谢通道，即由多至五段承担不由多至五段承担不同代谢分工的、依次衔接的代谢途径组成同代谢分工的、依次衔接的代谢途径组成的代谢通道。的代谢通道。因此有因此有载流路径的五段式载流路径的五段式之之称。在这条载流路径上流动的代谢主流对称。在这条载流路径上流动的代谢主流对应地也有五段，从而派生出应地也有五段，从而派生出代谢主流的五代谢主流的五段式段式。载流途径的五段式和代谢主流的五。载流途径的五段式和代谢主
46、流的五段式统称为段式统称为微生物代谢的五段式微生物代谢的五段式。第58页，共104页。在此五段式的基础上，从不同的角度出在此五段式的基础上，从不同的角度出发，提出能作为一个整体，用于设计育种以发，提出能作为一个整体，用于设计育种以及发酵工艺控制的五字策略（简称及发酵工艺控制的五字策略（简称工业发酵工业发酵的五字策略的五字策略）：进、通、节、堵、出。）：进、通、节、堵、出。“五字五字策略策略”就是从合作的良好愿望出发，发挥人的就是从合作的良好愿望出发，发挥人的主观能动作用，主动与微生物合作实现工业发酵主观能动作用，主动与微生物合作实现工业发酵效益的策略。这个策略来自初级代谢产物过量合效益的策略。
47、这个策略来自初级代谢产物过量合成的研究，故实际上是成的研究，故实际上是初级代谢产物过量合成初级代谢产物过量合成的五字策略的五字策略。第59页，共104页。NPP进进出出通通节节堵堵工业发酵的工业发酵的“五字策略五字策略”第60页，共104页。高产菌种的代谢特征：不同来源的碳高产菌种的代谢特征：不同来源的碳架物质畅通地架物质畅通地“注入注入”载流路径，高速生载流路径，高速生成并顺利释出目的产物，如下图。成并顺利释出目的产物，如下图。第61页，共104页。进进：在育种和发酵控制方面都要促进细胞对营：在育种和发酵控制方面都要促进细胞对营养物质的吸收。在发酵过程中，一般都希望菌养物质的吸收。在发酵过程
48、中，一般都希望菌体能迅速达到一定的浓度，因此，就必需选用体能迅速达到一定的浓度，因此，就必需选用生长旺盛的菌株，这类菌株吸收营养物质的能生长旺盛的菌株，这类菌株吸收营养物质的能力往往也较强。同时要选择适当的容易吸收的力往往也较强。同时要选择适当的容易吸收的培养基，和适宜的培养条件，以促进微生物的培养基，和适宜的培养条件，以促进微生物的生长。为了消除底物在培养过程中的抑制作用，生长。为了消除底物在培养过程中的抑制作用，有的还采用流加的培养方法。为了促进微生物有的还采用流加的培养方法。为了促进微生物的生长和支持目的产物的合成，还要从代谢生的生长和支持目的产物的合成，还要从代谢生理学的角度优化流加条
49、件。理学的角度优化流加条件。第62页，共104页。通通：在育种方面，解除对途径中某些酶的反馈：在育种方面，解除对途径中某些酶的反馈调节；在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或调节；在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外还包括其他支持生物合成的物流）能够物流外还包括其他支持生物合成的物流）能够畅通地注入载流路径，汇入代谢主流，流向目畅通地注入载流路径，汇入代谢主流，流向目的产物。特别是当发酵进入目的产物合成阶段的产物。特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径畅通，代谢主流优势明后，必需确保载流路径畅通，代谢
50、主流优势明显。显。第63页，共104页。这些酶包括用于目的产物自身合成的酶这些酶包括用于目的产物自身合成的酶（如下图中酶）和用于目的产物的前体合（如下图中酶）和用于目的产物的前体合成的酶（成的酶（如下图中酶和，用于前体如下图中酶和，用于前体C的合成，的合成，酶，用于前体酶，用于前体D的合成）。的合成）。第64页，共104页。例如在谷氨酸的发酵过程中，作为例如在谷氨酸的发酵过程中，作为谷氨酸合成原料的谷氨酸合成原料的 NH4+的缺乏，的缺乏，就可能就可能使谷氨酸合成途径的中断，导致谷氨酸产量使谷氨酸合成途径的中断，导致谷氨酸产量下降，大量下降，大量-酮戊二酸积累。当然，合成途酮戊二酸积累。当然，
