1、海南大学环境与植物保护学院 苏增建环境毒理学实验授课教师：苏增建试验地点：环境毒理实验室适用专业：环境科学相关专业海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验一、目的与要求一、目的与要求（1 1）学习和掌握滤纸接触毒性实验和人）学习和掌握滤纸接触毒性实验和人工土壤实验的基本原理和方法。工土壤实验的基本原理和方法。（2 2）初步了解评价环境中化学物质对土）初步了解评价环境中化学物质对土壤中动物急生伤害的标准和基本步骤。壤中动物急生伤害的标准和基本步骤。海南大学环境与植物保护学院 苏增建二、原理二、原理滤纸接触法毒性实验简单易行，可对受滤纸接触法毒性实验简单易行，可对受试物毒性进行初
2、筛。将蚯蚓与湿润的滤纸上试物毒性进行初筛。将蚯蚓与湿润的滤纸上的受试物接触，测定土壤中受试物对蚯蚓的的受试物接触，测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响。潜在影响。人工土壤实验系统将蚯蚓置于含不同浓人工土壤实验系统将蚯蚓置于含不同浓度受试物的人工土壤中，饲养度受试物的人工土壤中，饲养7d7d和和14d14d，评价评价其死亡率，评价受试物对蚯蚓的急性毒性作其死亡率，评价受试物对蚯蚓的急性毒性作用。用。实验一 蚯蚓急性毒性实验海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验三、设备与材料三、设备与材料1 1、主要仪器和设备主要仪器和设备玻璃容器：平底玻璃管（玻璃容器：平底玻璃管（3cm3cm8
3、cm8cm）培养装置：光强培养装置：光强400-800 400-800 lx的温控培养箱的温控培养箱中性滤纸：中性滤纸：80-85g/m2移液器、塑料薄膜、烘箱、电吹风移液器、塑料薄膜、烘箱、电吹风海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验2 2、试验生物试验生物选用二月龄以上，体重选用二月龄以上，体重300-500mg300-500mg左右的左右的健康赤子爱胜蚓。健康赤子爱胜蚓。实验前应在实验室条件下驯养实验前应在实验室条件下驯养2 2周以上。周以上。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验3 3、人工土壤人工土壤人工土壤基质组成（干重）：人工土壤基质组成（
4、干重）：（1 1）10%10%干牛粪（干牛粪（PHPH为为5.5-6.05.5-6.0，磨细，磨细，风干，测定含水量）；风干，测定含水量）；（2 2）20%20%高岭黏土（含高岭黏土（含50%50%以上高岭土）；以上高岭土）；（3 3）70%70%石英沙（石英沙（0.05-0.2mm0.05-0.2mm粒径的石颗粒径的石颗粒粒50%50%以上）；以上）；（4 4）混合人工土壤的组成成分，加入蒸）混合人工土壤的组成成分，加入蒸馏水使其含水量为干重的馏水使其含水量为干重的25%-42%25%-42%，混合均匀。混合均匀。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验四、方法和步骤四、方
5、法和步骤1 1、清肠清肠用蒸馏水清洗蚯蚓，然后置于铺有滤纸用蒸馏水清洗蚯蚓，然后置于铺有滤纸的磁盘上清肠的磁盘上清肠24h24h，用去离子水冲洗后，滤纸用去离子水冲洗后，滤纸吸干称重，供试。吸干称重，供试。注：清肠过程用薄膜包紧磁盘，防止蚯注：清肠过程用薄膜包紧磁盘，防止蚯蚓爬出磁盘死亡。蚓爬出磁盘死亡。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验2 2、滤纸实验滤纸实验在平底试管内壁衬滤纸，铺满不重叠；在平底试管内壁衬滤纸，铺满不重叠；设设5 5个浓度梯度（见附表）及对照共个浓度梯度（见附表）及对照共6 6组组试管，每组试管，每组1010个重复，每个试管内首先移个重复，每个试管
6、内首先移取取1ml1ml对应浓度的受试物溶液，用洁净空气吹对应浓度的受试物溶液，用洁净空气吹干，然后每个试管加入干，然后每个试管加入1ml1ml去离子水，然后加去离子水，然后加入入1 1条蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、条蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、202022环境培养环境培养48h48h，每每24h24h观察一次，记录死亡情观察一次，记录死亡情况，同时还有蚯蚓的病理症状和行为。况，同时还有蚯蚓的病理症状和行为。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验选择浓度范围的预试验选择浓度范围的预试验受试物在滤纸的沉积量受试物在滤纸的沉积量（mg/cmmg/cm2 2）受试物浓度受试物浓度（g
7、/mlg/ml）1.0710-20.1710-30.01710-40.001710-50.0001710-6注：受试物溶于水（1000mg/l）或丙酮等助溶剂，配成系列浓度海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验3 3、人工土壤试验人工土壤试验正式试验前，需进行浓度范围选择实验。正式试验前，需进行浓度范围选择实验。最终设定至少最终设定至少5 5个浓度梯度级及空白组，浓度个浓度梯度级及空白组，浓度范围应包括最大耐受浓度和致死浓度两组浓范围应包括最大耐受浓度和致死浓度两组浓度，每组至少有度，每组至少有4 4个平行样。个平行样。受试蚯蚓需在人工土壤中先驯养受试蚯蚓需在人工土壤中先驯
8、养24h24h，实实验前冲洗干净。验前冲洗干净。实验进行实验进行14d14d，每每7d7d观察蚯蚓的病理症状观察蚯蚓的病理症状及行为、死亡。测定介质中的含水量。及行为、死亡。测定介质中的含水量。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验4 4、质量控制质量控制可在实验中加入阳性对照组（氯乙酰可在实验中加入阳性对照组（氯乙酰胺），空白组用去离子水代替受试物，实验胺），空白组用去离子水代替受试物，实验结束后空白对照组死亡率应不超过结束后空白对照组死亡率应不超过10%10%。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验五、结果及实验报告五、结果及实验报告记录不同受试物浓
9、度对应的死亡情况，记录不同受试物浓度对应的死亡情况，实验报告就包括以下内容：实验报告就包括以下内容：受试物的基本物化性质；实验动物的饲受试物的基本物化性质；实验动物的饲养条件等；试验条件包括温度、湿度、光照养条件等；试验条件包括温度、湿度、光照条件、实验介质的成分级成和制备条件；实条件、实验介质的成分级成和制备条件；实验结果报告。验结果报告。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验六、注意事项六、注意事项1 1、牛粪与其他人工土壤成分混合前应充牛粪与其他人工土壤成分混合前应充分磨细风干、烘干，测定含水量；分磨细风干、烘干，测定含水量；2 2、蚯蚓驯养条件：温度蚯蚓驯养条件：温
10、度18-22 18-22，持续持续光照（强度光照（强度400-800 400-800 lx），保证湿度；），保证湿度；海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验一 蚯蚓急性毒性实验3 3、实验中管口或瓶口必须用薄膜封紧并实验中管口或瓶口必须用薄膜封紧并保证通气，防止蚯蚓钻出；保证通气，防止蚯蚓钻出；4 4、根据根据LC50LC50值可将农药对蚯蚓的毒性划值可将农药对蚯蚓的毒性划分三个等级：分三个等级：1ppm10ppm10ppm的为低毒农药的为低毒农药海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶活性的抑制一、目的与要求一、目的与要求1 1、了解有机磷杀虫剂共同的特性，即对了解有机
11、磷杀虫剂共同的特性，即对昆虫或高等动物体内胆碱酯酶的活性能起抑昆虫或高等动物体内胆碱酯酶的活性能起抑制作用，而引起动物中毒死亡。制作用，而引起动物中毒死亡。2 2、利用这一原理测定各种有机磷杀虫剂利用这一原理测定各种有机磷杀虫剂在动、植物体内的残留毒性，为安全使用农在动、植物体内的残留毒性，为安全使用农药提供依据。药提供依据。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验二、原理二、原理当高等动物或昆虫被有机磷杀虫剂作用当高等动物或昆虫被有机磷杀虫剂作用之后，体内胆碱酯酶就受抑制，不能继续起之后，体内胆碱酯酶就受抑制，不能继续起水解作用，因此，它们体内的乙酰胆碱大量水
12、解作用，因此，它们体内的乙酰胆碱大量积累，而导致中毒死亡积累，而导致中毒死亡海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验三、设备与材料三、设备与材料1 1、设备：可见光分光光度计；试管设备：可见光分光光度计；试管1313支，支，移液器；振荡水浴锅，烧杯，研钵。移液器；振荡水浴锅，烧杯，研钵。2 2、试剂：试剂：（1 1）0.004M0.004M溴化或氯化乙酰胆碱；（溴化或氯化乙酰胆碱；（2 2）2M2M盐酸羟胺溶液；（盐酸羟胺溶液；（3 3）3.5N 3.5N NaOHNaOH；（4 4）4N4N盐酸溶液；（盐酸溶液；（5 5）0.37M0.37M三氯化铁溶液。三氯
13、化铁溶液。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验四、步骤与方法四、步骤与方法1 1、将台面的大试管进行编号将台面的大试管进行编号1-91-9（其中（其中6 6号管为空白管，号管为空白管，9 9号管为对照管），另有一支号管为对照管），另有一支2ml2ml有盖管；有盖管；2.2.2 2、每一排所有组将芽虫放在一起，加入每一排所有组将芽虫放在一起，加入5 5倍左右的冷冻蒸馏水，进行研磨，然后将浆倍左右的冷冻蒸馏水，进行研磨，然后将浆液全部倒入离心管中，在液全部倒入离心管中，在2500rpm2500rpm离心离心15min15min，取离心管中上清液作为正常虫浆，共用
14、；取离心管中上清液作为正常虫浆，共用；海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验3 3、各小组向各小组向2ml2ml管加入管加入0.5ml0.5ml正常虫浆，然正常虫浆，然后由老师帮忙加入后由老师帮忙加入20l0.1%20l0.1%敌百虫液，放置敌百虫液，放置1515分钟；分钟；4 4、向向1-61-6号管分别添加号管分别添加0.20.2、0.40.4、0.60.6、0.80.8、1.01.0、1.0ml1.0ml试剂（试剂（1 1），再分别加入），再分别加入1.31.3、1.11.1、0.90.9、0.70.7、0.50.5、0.50.5磷酸盐缓冲液，摇匀；向磷
15、酸盐缓冲液，摇匀；向7 7号管中分别加入号管中分别加入0.5ml0.5ml无处理的正常虫浆，向无处理的正常虫浆，向8 8号管中加入号管中加入0.5ml0.5ml敌百虫处理过的虫浆，然后分敌百虫处理过的虫浆，然后分别向别向7-97-9号管加入号管加入1ml1ml试剂（试剂（1 1），摇匀；），摇匀；海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验5 5、将将6-96-9号管放入号管放入3737振荡水浴锅中，振荡水浴锅中，40min40min后取出；后取出；6 6、向向6 6号管中加入号管中加入1ml1ml试剂（试剂（4 4），摇匀），摇匀后；后；7 7、分别向分别向1-9
16、1-9号管中加入号管中加入2ml2ml试剂（试剂（2 2）与试剂（与试剂（3 3）的混合液（）的混合液（1 1：1 1临时配用），大临时配用），大力摇动力摇动1min1min以上；以上；海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验8 8、向向9 9号管中加入号管中加入0.5ml0.5ml正常虫浆；正常虫浆；9 9、除除6 6号管外，分别向各管（号管外，分别向各管（1-51-5号、号、7-7-9 9号）加入号）加入1ml1ml试剂（试剂（4 4），摇匀；），摇匀；1010、向向1-91-9号管加入号管加入1ml1ml试剂（试剂（5 5），各管），各管即呈现深浅不同的红
17、棕色，用可见光光度计即呈现深浅不同的红棕色，用可见光光度计（540nm540nm进行测定）。进行测定）。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验五、结果与报告五、结果与报告要求作出乙酰胆碱标准曲线，根据这条要求作出乙酰胆碱标准曲线，根据这条标准曲线求出样本所含的乙酰胆碱量，从而标准曲线求出样本所含的乙酰胆碱量，从而计算出胆碱酯酶被抑制的百分率。计算出胆碱酯酶被抑制的百分率。海南大学环境与植物保护学院 苏增建实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验六、注意事项六、注意事项1 1、受试生物如果是荔枝蝽，则需雄雌各受试生物如果是荔枝蝽，则需雄雌各3 3头，实验时需去除雄性的睾丸，剪去翅膀、头，实验时需去除雄性的睾丸，剪去翅膀、附肢、触角等，研磨后需用玻璃丝过滤；附肢、触角等，研磨后需用玻璃丝过滤；2 2、手工研磨时可先加少量冷冻蒸馏水，手工研磨时可先加少量冷冻蒸馏水，快速研磨后再加适量冷冻蒸馏水磨拌均匀。快速研磨后再加适量冷冻蒸馏水磨拌均匀。
